Name: aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons
Uploaded: 2014-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Nous remercions sincèrement la Fondation Whitehall pour son soutien financier et les fonds de démarrage du Scripps Research Institute pour la réalisation de ce travail.

1. Préparation des ganglions abdominaux, mesures électrophysiologiques et isolement de neurones identifiés uniques à partir du ganglion abdominal d’Aplysia californica
<ol><li>Maintenir Aplysia dans l’aquarium de laboratoire avec de l’eau de mer artificielle circulante (ASW) à 16 °C dans des conditions claires:sombres à 12:12.</li>
	<li>Isolement de ganglion abdominal.<ol>
<li>Anesthésier les animaux en injectant une solution de MgCl2 de 380 mM pendant 5 à 10 minutes (équiva...

Le neurone R15 est impliqué dans la régulation des systèmes cardiovasculaire, digestif, respiratoire et reproducteur30. Une activité d’éclatement régulièrement rythmique de l’AP est une caractéristique de R15. Comme le montre la section des résultats, l’enregistrement apparié de R15 et L7 montre que la préparation des ganglions a préservé l’activité des neurones R15. Les neurones R15 et L7 ont répondu convenablement à Ach. Cette préparation de ganglions a pu être maintenue jusqu’à ...

Le cerveau humain est extraordinairement complexe avec près de 100 milliards de neurones et des billions de connexions synaptiques. Il existe un nombre presque égal de cellules non neuroneuronales qui interagissent avec les neurones et régulent leur fonction dans le cerveau. Les neurones sont organisés en circuits qui régulent des comportements spécifiques. Malgré les progrès réalisés dans notre compréhension des fonctions cérébrales et des circuits neuronaux, on sait peu de choses sur l’identité des composants des circuits qui contrôlent un comportement spécifique. La connaissance des identités de divers composants d’un circuit facilitera grandement notre compréhension de la base cellulaire et moléculaire du comportement et aidera à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les troubles neuropsychiatriques.
L’escargot marin Aplysia californica a été un cheval de bataille pour déterminer les circuits neuronaux sous-jacents à des comportements spécifiques1-14. Le système nerveux d’Aplysia contient environ 20 000 neurones qui sont organisés en 9 ganglions différents. Les neurones de l’Aplysia sont grands et peuvent être facilement identifiés en fonction de leur taille, propriétés électriques, et la position dans les ganglions. Aplysia a un riche répertoire de comportements qui peuvent être étudiés. L’un des comportements bien étudiés est le réflexe de retrait des branchies (GWR). Les composants centraux de ce réflexe sont situés dans les ganglions abdominaux. Les composantes des circuits de la régression pondérée géographiquement ont été cartographiées et les contributions de divers composants ont été déterminées. Il est important de faire en charge les circuits de régression pondérée géographiquement par5,6,15-19. Des décennies d’étude sur ce réflexe ont également identifié plusieurs voies de signalisation qui ont un rôle clé dans l’apprentissage et la mémoire20-24.
Plusieurs préparations différentes d’Aplysia ont été employées pour étudier la base cellulaire et moléculaire du stockage de mémoire. Il s’agit notamment de l’animal intact2,3,de la préparation semi-intacte1,7,13,14,16 et de la reconstitution des principaux composants des circuits neuronaux25-29. Une préparation réduite pour explorer des ganglions d’aplysie pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des circuits neuronaux identifiés est décrite ici. Les quatre neurones identifiés suivants ont été étudiés. R15, un neurone éclatant, L7 et L11, deux neurones moteurs différents et R2, un neurone cholinergique ont été étudiés. R2 est le plus grand neurone décrit dans le système nerveux des invertébrés. En bref, cette méthodologie implique le traitement de la protéase des ganglions, des mesures électrophysiologiques avant et après les traitements pharmacologiques, et l’isolement des neurones simples pour l’analyse quantitative de l’expression des gènes. Cette méthodologie nous permet de combiner des analyses moléculaires avec l’enregistrement simultané de plusieurs neurones. Cette méthodologie a été avec succès employée pour étudier des réponses des neurones R15 et L7 à l’acétylcholine (Ach) par les enregistrements intracellulaires appariés. Après des mesures électrophysiologiques R15 et L7 et d’autres neurones identifiés tels que L11 et R2 ont été isolés pour l’analyse quantitative de l’amplification en chaîne par réaction (qPCR) de l’expression de CREB1, un facteur de transcription important pour le stockage de mémoire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

Un défi majeur en neurobiologie est de comprendre les fondements moléculaires des circuits neuronaux qui régissent un comportement spécifique. Une fois que les mécanismes moléculaires spécifiques sont identifiés, de nouvelles stratégies thérapeutiques peuvent être développées pour traiter les anomalies dans des comportements spécifiques causés par des maladies dégénératives ou le vieillissement du système nerveux. L’escargot marin Aplysia californica est bien adapté aux investigations de la base cellulaire et moléculaire du comportement parce que les circuits neuronaux sous-jacents à un comportement spécifique pourraient être facilement déterminés et les composants individuels des circuits pourraient être facilement manipulés. Ces avantages de l’Aplysia ont conduit à plusieurs découvertes fondamentales de la neurobiologie de l’apprentissage et de la mémoire. Ici, nous décrivons une préparation du système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des neurones individuels. En bref, le ganglion disséqué du système nerveux est exposé à la protéase pour enlever la gaine ganglionnaire de telle sorte que les neurones soient exposés mais conservent l’activité neuronale comme chez l’animal intact. Cette préparation est utilisée pour effectuer des mesures électrophysiologiques de neurones simples ou multiples. Il est important de noter qu’après l’enregistrement à l’aide d’une méthodologie simple, les neurones pourraient être isolés directement des ganglions pour l’analyse de l’expression génique. Ces protocoles ont été utilisés pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques simultanés à partir de neurones L7 et R15, étudier leur réponse à l’acétylcholine et quantifier l’expression du gène CREB1 dans des neurones L7, L11, R15 et R2 uniques isolés d’Aplysia.

Le poids des animaux utilisés dans cette étude variait de 100 à 200 g. Suivant les protocoles décrits, nous avons effectué des mesures électrophysiologiques et l’analyse moléculaire des neurones des ganglions abdominaux isolés chez les animaux s’étendant de 2-5 g à 200-300 g.
La normalisation du traitement de protéase est importante pour des mesures électrophysiologiques réussies des neurones dans les ganglions. Initialement, des concentrations et des durées multiples de prot...

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Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

L’escargot marin Aplysia californica a été largement utilisé comme modèle de neurobiologie pour les études sur la base cellulaire et moléculaire du comportement. Ici, une méthodologie est décrite pour explorer le système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones uniques de circuits neuronaux identifiés.

Aplysie Préparation des ganglions pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones simples

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

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Enchevêtrement moléculaire et Electrospinnability de biopolymères

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