Name: aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons
Uploaded: 2014-01-13T13:00:00
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Agradecemos sinceramente a la Fundación Whitehall por su apoyo financiero y fondos de inicio del Scripps Research Institute por llevar a cabo este trabajo.

1. Preparación De Ganglios Abdominales, Mediciones Electrofisiológicas, Y El Aislamiento De Las Neuronas Individuales Identificadas Del Ganglio Abdominal De Aplysia californica
<ol><li>Mantenga Aplysia en el acuario de laboratorio con agua de mar artificial circulante (ASW) a 16 ° C bajo condiciones de luz: oscuras de 12:12.</li>
	<li>Aislamiento del ganglio abdominal.<ol>
<li>Anestesiar a los animales inyectando 380 mM mgCl2 solución durante 5-10 min (equivalente al 30-35% del peso cor...

La neurona R15 participa en la regulación de los sistemas cardiovascular, digestivo, respiratorio y reproductivo30. Una actividad que estalla regularmente rítmica del AP es una característica de R15. Como se muestra en la sección de resultados, el registro emparejado de R15 y L7 muestran que la preparación de los ganglios ha preservado la actividad de las neuronas R15. Las neuronas R15 y L7 respondieron apropiadamente a Ach. Esta preparación de los ganglios se podía mantener hasta 8-10 horas y la activi...

El cerebro humano es extraordinariamente complejo con casi 100 mil millones de neuronas y billones de conexiones sinápticas. Hay casi un número igual de células no neuronales que interactúan con las neuronas y regulan su función en el cerebro. Las neuronas se organizan en circuitos que regulan comportamientos específicos. A pesar de los avances en nuestra comprensión de las funciones cerebrales y los circuitos neuronales, poco se sabe sobre la identidad de los componentes de los circuitos que controlan un comportamiento específico. El conocimiento de las identidades de varios componentes de un circuito facilitará grandemente nuestra comprensión de la base celular y molecular del comportamiento y ayuda en el desarrollo de las estrategias terapéuticas nuevas para los desordenes neuropsiquiátricos.
El caracol marino Aplysia californica ha sido un caballo de batalla para determinar los circuitos neuronales subyacentes a comportamientos específicos1-14. El sistema nervioso de Aplysia contiene aproximadamente 20.000 neuronas que se organizan en 9 ganglios diferentes. Las neuronas de Aplysia son grandes y se pueden identificar fácilmente en función de su tamaño, propiedades eléctricas y posición en los ganglios. Aplysia tiene un rico repertorio de comportamientos que pueden ser estudiados. Uno de los comportamientos bien estudiados es el reflejo branquial-abstinencia (GWR). Los componentes centrales de este reflejo están situados en los ganglios abdominales. Se han mapeado componentes de los circuitos GWR y se han determinado las contribuciones de varios componentes. Es importante destacar que los circuitos GWR se someten a aprendizaje asociativo y no asociativo5,6,15-19. Décadas de estudio sobre este reflejo también han identificado varias vías de señalización que tienen un papel clave en el aprendizaje y la memoria20-24.
Varias preparaciones diferentes de Aplysia se utilizaron para estudiar las bases celulares y moleculares del almacenamiento de la memoria. Estos incluyen el animal intacto2,3,la preparación semi-intacta1,7,13,14,16 y la reconstitución de los principales componentes de los circuitos neuronales25-29. Una preparación reducida para explorar los ganglios de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de circuitos neuronales identificados se describe aquí. Las cuatro neuronas identificadas siguientes fueron estudiadas. R15, una neurona que estallaba, L7 y L11, dos diversas neuronas de motor y R2, una neurona colinérgica fueron estudiados. R2 es la neurona más grande descrita en el sistema nervioso de los invertebrados. Brevemente, esta metodología implica el tratamiento proteasa de ganglios, mediciones electrofisiológicas antes y después de los tratamientos farmacológicos, y el aislamiento de neuronas individuales para el análisis cuantitativo de la expresión génica. Esta metodología nos permite combinar análisis moleculares con el registro simultáneo de múltiples neuronas. Esta metodología se utilizó con éxito para estudiar las respuestas de las neuronas R15 y L7 a la acetilcolina (Ach) por grabaciones intracelulares emparejadas. Después de mediciones electrofisiológicas R15 y L7 y otras neuronas identificadas como L11 y R2 se aislaron para el análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) de la expresión de CREB1, un factor de transcripción importante para el almacenamiento de memoria.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

Un desafío importante en neurobiología es entender los fundamentos moleculares de los circuitos neuronales que gobiernan un comportamiento específico. Una vez identificados los mecanismos moleculares específicos, se pueden desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para tratar anomalías en comportamientos específicos causadas por enfermedades degenerativas o envejecimiento del sistema nervioso. El caracol marino Aplysia californica es muy adecuado para las investigaciones de las bases celulares y moleculares del comportamiento porque los circuitos neuronales subyacentes a un comportamiento específico podrían determinarse fácilmente y los componentes individuales de los circuitos podrían ser fácilmente manipulados. Estas ventajas de Aplysia han llevado a varios descubrimientos fundamentales de la neurobiología del aprendizaje y de la memoria. Aquí se describe una preparación del sistema nervioso Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de las neuronas individuales. Brevemente, el ganglio diseccionado del sistema nervioso se expone a la proteasa para eliminar la vaina ganglionar de tal manera que las neuronas están expuestas pero conservan la actividad neuronal como en el animal intacto. Esta preparación se utiliza para llevar a cabo mediciones electrofisiológicas de neuronas únicas o múltiples. Es importante destacar que, después de la grabación utilizando una metodología simple, las neuronas podrían aislarse directamente de los ganglios para el análisis de expresión génica. Estos protocolos se utilizaron para llevar a cabo grabaciones electrofisiológicas simultáneas de las neuronas L7 y R15, estudiar su respuesta a la acetilcolina y la cuantificación de la expresión del gen CREB1 en aislados de las neuronas L7, L11, R15 y R2 de Aplysia.

Los pesos de los animales que fueron utilizados en este estudio se extendieron a partir del 100-200 g. Siguiendo los protocolos descritos, se realizaron mediciones electrofisiológicas y análisis moleculares de neuronas de ganglios abdominales aislados de animales que oscilaban entre 2-5 g y 200-300 g.
La estandarización del tratamiento con proteasa es importante para el éxito de las mediciones electrofisiológicas de las neuronas en los ganglios. Inicialmente, se utilizaron concentraciones...

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Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

El caracol marino Aplysia californica ha sido ampliamente utilizado como modelo neurobiológico para los estudios sobre bases celulares y moleculares del comportamiento. Aquí se describe una metodología para explorar el sistema nervioso de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de neuronas individuales de circuitos neuronales identificados.

Aplysia Preparación De Ganglios Para Análisis Electrofisiológicos Y Moleculares De Neuronas Individuales

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

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