Name: dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production
Uploaded: 2014-03-02T14:00:00
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Souris, de type sauvage (Mavs + / +) et knock-out (Mavs - / -) de type sauvage (Mavs + / +) et knock-out (Mavs - - /) FAE ont été aimablement fournies par le Dr J. Zhijian Chen (Université de Texas Southwestern Medical Center) 13. Cette publication est basée sur les travaux financés par des subventions du NIH (R01 CA134241 et R01 DE021445) et l&#39;American Cancer Society (RSG-11-162-01-MPC).

Déclaration éthique: Tous les travaux de l&#39;animal a été réalisé sous stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) de l&#39;Université de Californie du Sud. Une. Cytokine expression génique par quantitative PCR en temps réel et la sécrétion par ELISA...

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	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-like+receptors:+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA.">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).</li><li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Xu, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li><li>Meylan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. , (2010).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma+herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+abrogate+NFkappaB+activation+and+antiviral+cytokine+production.">Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production.</a> PLoS Pathog. 7, (2011).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+evades+host+cytokine+production+via+replication+transactivator-induced+RelA+degradation.">Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation.</a> J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Host-virus+Interaction+in+Lytic+Replication+of+a+Model+Herpesvirus.">Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li><li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li></ol>

Évasion immunitaire virale est l&#39;une des interactions les plus dynamiques et les plus fascinants d&#39;interface infraction virale et défense de l&#39;hôte 9. Les composants de l&#39;immunité innée de l&#39;hôte sont structurés de telle sorte que la transduction du signal est effectivement lancé et fidèlement transmis. La délimitation de la hiérarchie et de la réglementation des cascades de signalisation est un sujet prééminent de l&#39;immunité innée. Ici, nous introduisons un protocole p...

Des études récentes ont souligné les cascades de signalisation dans l&#39;ensemble de montage réponses immunitaires innées de l&#39;hôte. Résidant dans des compartiments distincts, les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) de détecter des modèles moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) d&#39;origines diverses pour déclencher immunitaire inné de signalisation 1. Le gène induite par l&#39;acide rétinoïque I (RIG-I) et de l&#39;antigène de différenciation des mélanomes (5 protéines de MDA5) sont des capteurs qui reconnaissent cytosoliques espèces d&#39;ARN avec des caractéristiques structurales spécifiques 2. Lors de l&#39;activation, RIG-I interagit avec son MAVS aval (également connu sous le IPS-1, VISA, et CARDIF) adaptateur qui, à son tour, active la IKK (IKKαβγ) et kinase liée IKK (TBK1 et IKKε, également connu sous le IKKi ) complexes 3-6. Kinases activées phosphorylent immunitaires innées des régulateurs clés de l&#39;expression de gènes, y compris les facteurs de transcription et leurs inhibiteurs, et permettent l&#39;activation transcriptionnelle de gènes antiviraux de l&#39;hôte (par exemple IL6, TNF &amp; #945;, CCL5, et IFNß). Ces cascades de signalisation constituent les réponses innées intrinsèques puissants immunitaires qui établissent un état anti-microbienne de limiter la propagation de l&#39;agent pathogène au cours des premiers stades de l&#39;infection. Murine γHV68 est étroitement liée à KSHV oncogène humain et EBV. Ainsi, l&#39;infection de souris γHV68 fournit un petit modèle animal traitable à examiner la réponse immunitaire de l&#39;hôte à l&#39;infection par le virus de l&#39;herpès gamma in vivo 7. Utilisation γHV68, notre laboratoire a découvert une stratégie complexe dans lequel γHV68 détourne accueillir signalisation immunitaire innée à permettre à l&#39;infection virale. D&#39;une part, γHV68 active la voie MAVS-IKKß, de promouvoir l&#39;activation de la transcription virale via diriger IKKß activé pour phosphoryler la réplication transactivateur (RTA), la clé virale du facteur de transcription pour la réplication γHV68 8. D&#39;autre part, la phosphorylation médiée par amorce IKKß RelA pour la dégradation et la duréeInates activation de NFkB 9. En tant que tel, l&#39;infection γHV68 évite efficacement la production de cytokines antiviral. Fait intéressant, un dépistage utilisant une bibliothèque d&#39;expression de γHV68 identifié RTA comme une ligase E3 pour induire la dégradation des RelA et abroger activation de NFkB 10. Ces résultats dévoilent une stratégie d&#39;évasion immunitaire complexe dans lequel les événements de signalisation en amont immunitaires sont mobilisées par γHV68 à nier l&#39;ultime production de cytokines antiviral. Ici, nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez des souris infectées avec γHV68 la fois in vivo et ex viv o. Dans le protocole, nous explorons encore la &quot;reconstitué&quot; expression des composants de l&#39;immunité innée dans les fibroblastes embryonnaires knock-out par transduction lentivirus, qui met en évidence la fonction des molécules immunitaires innées spécifiques dans la régulation de la production de cytokines antiviral. Ce protocole peut être facilement adaptée à d&#39;autres virusession et les voies de signalisation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Mouse CCL5 ELISA kit</td>
			<td style="width:211px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://www.rndsystems.com/Products/DY478">DY478</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">1.0 mm Zirconia/Silica beads</td>
			<td style="width:211px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:223px;">11079110z</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">TRIzol</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=15596018">15596-018</a></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="98" rowspan="2" style="height:98px;width:251px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td rowspan="2" style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:223px;">18064-014</td>
		</tr>
		<tr height="19">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">CCL5 quantitative real-time PCR primers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production

En réponse à une infection virale, l&#39;hôte une réponse immunitaire innée est activé pour réguler à la hausse l&#39;expression des gènes et la production de cytokines antivirales. Inversement, les virus ont développé des stratégies complexes pour échapper à exploiter et signalisation immunitaire de l&#39;hôte pour la survie et la propagation. Évasion immunitaire virale, entraînant défense de l&#39;hôte et l&#39;évasion virale, fournit l&#39;une des interfaces les plus fascinants et les plus dynamiques de discerner l&#39;interaction hôte-virus. Ces études progresser notre compréhension de la régulation immunitaire innée et ouvrent notre façon de développer de nouveaux traitements antiviraux. Murin γHV68 est un agent pathogène naturel des rongeurs murins. γHV68 infection de souris fournit un modèle animal docile pour examiner la réponse antivirale de KSHV humaine et EBV qui perturbation des interactions in vivo dans virus-hôte n&#39;est pas applicable. Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer la production de cytokines antiviral. Ce protocole peut être adapté à d&#39;autres virutilise et les voies de signalisation. Récemment, nous avons découvert que γHV68 détourne MAVS et IKKß, innés principaux composants de signalisation en aval de l&#39;immunitaires cytosolique RIG-I et MDA5, d&#39;abroger l&#39;activation de NFkB et la production de cytokines antivirales. Plus précisément, l&#39;infection active γHV68 IKKß et que IKKß activée phosphoryle RelA à accélérer la dégradation de RelA. En tant que tel, γ HV68 découple efficacement l&#39;activation de NFkB de son amont IKKß activé, la négation de l&#39;expression antiviral de gène de cytokine. Cette étude met en lumière une stratégie complexe de sorte que l&#39;activation immunitaire innée en amont est interceptée par un agent pathogène viral d&#39;annuler l&#39;activation de la transcription en aval immédiat et soustraire la production de cytokines antivirales.

Trois figures représentatives sont présentés ici, y compris la production de cytokines dans le poumon de Mavs γHV68 infectés + / + et Mavs-/ - souris, la sécrétion de cytokines et l&#39;expression des gènes niveau de Mavs + / + et Mavs γHV68 infectés - / - MEF, et les niveaux d&#39;ARNm de cytokines Mavs γHV68 infectés - / - FAE &quot;reconstitués&quot; avec MAVS. Ces expériences représentatives utilisent d...

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Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez les souris infectées par un virus de l&#39;herpès modèle murin gamma herpèsvirus 68 (γ HV68) qui est étroitement liée à associé au sarcome de virus de l&#39;herpès de Kaposi humain (KSHV) et le virus d&#39;Epstein-Barr (EBV). L&#39;utilisation de souches de souris génétiquement modifiées et les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), nous avons évalué la production de cytokines antivirales la fois in vivo et ex vivo. &quot;Reconstitution&quot; de l&#39;expression des composants immunitaires innées à élimination directe des fibroblastes embryonnaires de transduction lentiviral, nous Pinpoint en outre des molécules immunitaires innées spécifiques et disséquer les événements de signalisation clés qui régulent différemment la production de cytokines antiviral.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

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