Name: dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production
Uploaded: 2014-03-02T14:00:00
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Wild-type (Mavs + / +) e knockout (Mavs - / -) topi wild-type (Mavs + / +) e knockout (Mavs - / -) MEF sono stati gentilmente forniti dal Dr. Zhijian J. Chen (Università di Texas Southwestern Medical Center) 13. Questa pubblicazione si basa sul lavoro finanziato da sovvenzioni dal NIH (R01 CA134241 e R01 DE021445) e American Cancer Society (RSG-11-162-01-MPC).

Etica Dichiarazione: Tutti i lavori animale è stato eseguito in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC), della University of Southern California. 1. Citochine Gene Expression da Quantitative Real-time PCR e la secrezione da ELISA in topi infettati γHV68 <ol><li> Aneste...

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	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-like+receptors:+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA.">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).</li><li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Xu, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li><li>Meylan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. , (2010).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma+herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+abrogate+NFkappaB+activation+and+antiviral+cytokine+production.">Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production.</a> PLoS Pathog. 7, (2011).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+evades+host+cytokine+production+via+replication+transactivator-induced+RelA+degradation.">Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation.</a> J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Host-virus+Interaction+in+Lytic+Replication+of+a+Model+Herpesvirus.">Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li><li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li></ol>

Viral evasione immune è una delle interazioni più dinamiche e affascinanti interfacciamento attacco virale e ospite difesa 9. I componenti immunitarie innate ospitanti sono strutturati in modo tale che la trasduzione del segnale sia effettivamente iniziata e fedelmente trasmessa. Delineare la gerarchia e la regolamentazione delle cascate di segnalazione è un tema preminente di immunità innata. Qui, vi presentiamo un protocollo per individuare i ruoli di regolamentazione di un componente immunitaria innata...

Recenti studi hanno delineato le cascate complessivi segnalazione in montaggio ospite risposte immunitarie innate. Risiedono all&#39;interno compartimenti distinti, i recettori pattern recognition (PRR) individuare pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP) di diversa origine per innescare immunitaria innata di segnalazione 1. Il gene indotta da acido retinoico I (RIG-I) e differenziazione melanoma antigene (5) md5 se si usano proteine ​​citosoliche sono sensori che riconoscono specie di RNA con specifiche caratteristiche strutturali 2. Dopo l&#39;attivazione, RIG-I interagisce con i suoi MAVS a valle (noto anche come IPS-1, VISA, e CARDIF) adattatore che, a sua volta, attiva il IKK (IKKαβγ) e la chinasi IKK-correlati (TBK1 e IKKε, noto anche come Ikki ) Complessi 3-6. Attivato chinasi immunitarie innate fosforilano regolatori chiave di espressione genica, compresi i fattori di trascrizione e loro inibitori, e consentono l&#39;attivazione trascrizionale di geni antivirali ospitante (ad esempio IL6, TNF &amp; #945,, CCL5 e Interferone beta). Queste cascate di segnalazione costituiscono potenti risposte immunitarie innate intrinseche che stabiliscono uno stato anti-microbica per limitare la propagazione dell&#39;agente patogeno durante le prime fasi di infezione. Murino γHV68 è strettamente legato al oncogeno umano KSHV e EBV. Pertanto, l&#39;infezione di topi γHV68 fornisce un piccolo modello animale trattabili per esaminare la risposta immunitaria al virus herpes gamma in vivo 7. Usando γHV68, il nostro laboratorio ha scoperto una strategia complessa in cui γHV68 dirotta ospitare segnalazione immunitaria innata per attivare infezione virale. Da un lato, γHV68 attiva il percorso MAVS-IKKβ per promuovere l&#39;attivazione trascrizionale virale tramite dirigere attivato IKKβ di fosforilare transactivator replica (RTA), il fattore di trascrizione chiave per la replicazione virale γHV68 8. D&#39;altra parte, la fosforilazione mediata IKKβ innesca RelA per degradazione e termineinates attivazione NFΚB 9. Come tale, l&#39;infezione γHV68 evita efficacemente la produzione di citochine antivirale. È interessante notare che uno screening che utilizza una libreria di espressione di γHV68 identificato RTA come ligasi E3 per indurre degrado RelA e abolisce l&#39;attivazione NFΚB 10. Questi risultati scoprire una strategia di evasione immune intricato in cui gli eventi a monte di segnalazione immunitarie vengono sfruttate da γHV68 per negare la finale produzione di citochine antivirali. Qui si descrive un protocollo per misurare la produzione di citochina antivirale in topi infettati con γHV68 sia in vivo ed ex viv o. Nel protocollo esploriamo ulteriormente l&#39;espressione &quot;ricostituiti&quot; di componenti immunitarie innate nei knockout fibroblasti embrionali da trasduzione lentivirale, che individua la funzione delle specifiche molecole immunitarie innate nella regolazione della produzione di citochine antivirale. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre viruses e vie di segnalazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Mouse CCL5 ELISA kit</td>
			<td style="width:211px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://www.rndsystems.com/Products/DY478">DY478</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">1.0 mm Zirconia/Silica beads</td>
			<td style="width:211px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:223px;">11079110z</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">TRIzol</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=15596018">15596-018</a></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="98" rowspan="2" style="height:98px;width:251px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td rowspan="2" style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:223px;">18064-014</td>
		</tr>
		<tr height="19">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">CCL5 quantitative real-time PCR primers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production

In risposta ad una infezione virale, la risposta immunitaria innata host è attivato per up-regolare l&#39;espressione genica e produzione di citochine antivirali. Al contrario, i virus si sono evoluti strategie complesse per eludere e sfruttare ospite segnalazione immune per la sopravvivenza e la propagazione. Viral evasione immune, che comporta la difesa ospite e l&#39;evasione virale, fornisce una delle interfacce più affascinanti e dinamiche di discernere l&#39;interazione ospite-virus. Questi studi ampliano la nostra conoscenza nella regolazione immunitaria innata e spianare la strada per sviluppare nuove terapie antivirali. Murino γHV68 è un patogeno naturale di roditori murini. γHV68 infezione di topi fornisce un piccolo modello animale trattabili per esaminare la risposta antivirale per KSHV umana e EBV di cui perturbazione vivo interazioni virus-ospite in non è applicabile. Qui si descrive un protocollo per determinare la produzione di citochine antivirale. Questo protocollo può essere adattato ad altre virusi e vie di segnalazione. Recentemente, abbiamo scoperto che γHV68 dirotta MAVS e IKKβ, componenti immunitarie innate chiave di segnalazione a valle del citosolica RIG-I e md5 se si usano, per abrogare l&#39;attivazione NFΚB e la produzione di citochine antivirali. In particolare, l&#39;infezione γHV68 attiva IKKβ e che IKKβ attivato fosforila RelA per accelerare la degradazione RelA. Come tale, γ HV68 separa in modo efficiente attivazione NFΚB dal suo monte attivato IKKβ, negando l&#39;espressione genica di citochine antivirali. Questo studio chiarisce una strategia complessa per cui l&#39;attivazione immune innata a monte è intercettato da un agente patogeno virale per annullare l&#39;attivazione trascrizionale immediatamente a valle ed evitare la produzione di citochine antivirali.

Tre figure rappresentative sono mostrati qui, compresa la produzione di citochine nel polmone di Mavs γHV68 infettati Mavs-/ + / + e - del mouse, la secrezione di citochine e l&#39;espressione genica livello di Mavs γHV68 infettati Mavs + / + e - / - MEF, e livelli di mRNA di citochine Mavs γHV68 infettati - / - MEF &quot;ricostituiti&quot; con MAVS. Questi esperimenti rappresentativi utilizzano gene topi knockout per ...

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Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Descriviamo un protocollo per misurare la produzione di citochina antivirale in topi infettati con un modello herpesvirus, murina gamma herpesvirus 68 (γ HV68) che è strettamente correlata alla associato al sarcoma herpesvirus di Kaposi umano (KSHV) e virus di Epstein-Barr (EBV). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali di topo (MEF), abbiamo valutato la produzione di citochina antivirale sia in vivo e ex vivo. &quot;Ricostituzione&quot; l&#39;espressione di componenti dell&#39;immunità innata a eliminazione diretta fibroblasti embrionali di trasduzione lentivirale, abbiamo ulteriormente individuare specifiche molecole del sistema immunitario innato e sezionare gli eventi di segnalazione chiave che differenziale regolano la produzione di citochine antivirale.

Dissezione Innate Immune Signaling in Evasion virale di produzione di citochine

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