Name: dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production
Uploaded: 2014-03-02T14:00:00
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De tipo selvagem (Mavs + / +) e knockout (Mavs - / -) ratinhos, do tipo selvagem (Mavs + / +) e knockout (Mavs - / -) MEFs foram gentilmente cedidos pelo Dr. J. Chen Zhijian (University of Texas Southwestern Medical Center) 13. Esta publicação é baseado no trabalho financiado por subvenções do NIH (R01 CA134241 e R01 DE021445) e American Cancer Society (RSG-11-162-01-MPC).

Declaração de Ética: Todo o trabalho animal foi realizada sob estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia. 1. Cytokine Gene Expression quantitativa por PCR em tempo real e da secreção por ELISA em ratinhos infectados γHV68 <ol><li> Anestesiar, 6-8 semanas de idade ...

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	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-like+receptors:+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA.">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).</li><li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Xu, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li><li>Meylan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. , (2010).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma+herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+abrogate+NFkappaB+activation+and+antiviral+cytokine+production.">Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production.</a> PLoS Pathog. 7, (2011).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+evades+host+cytokine+production+via+replication+transactivator-induced+RelA+degradation.">Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation.</a> J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Host-virus+Interaction+in+Lytic+Replication+of+a+Model+Herpesvirus.">Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li><li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li></ol>

Evasão imune Viral é uma das interações mais dinâmicas e fascinantes interface ofensa viral e de defesa do hospedeiro 9. O anfitrião componentes da imunidade inata são estruturados de tal forma que a transdução de sinal é efetivamente iniciado e transmitido fielmente. Delineando a hierarquia e regulação da cascata de sinalização é um tema de destaque da imunidade inata. Aqui, apresentamos um protocolo para identificar as funções de regulação de um componente imunológico inato, MAVS, na eva...

Estudos recentes têm descrito as cascatas de sinalização em geral montagem de acolhimento respostas imune inata. Residindo dentro de compartimentos distintos, os receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) detectar padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) de origem diversa para acionar imune inato sinalização 1. O gene induzida por ácido retinóico I (RIG-I) e antigénio de diferenciação melanoma 5 proteínas (MDA5) são sensores citosólicas que reconhecem espécies de ARN com características estruturais específicas 2. Após a ativação, RIG-I interage com seus MAVS jusante (também conhecido como IPS-1, VISA, e CARDIF) adaptador que, por sua vez, ativa a IKK (IKKαβγ) e relacionadas à IKK quinase (TBK1 e IKKε, também conhecido como Ikki ) complexos 3-6. Quinases imune inata ativadas fosforilam reguladores chave de expressão de genes, incluindo fatores de transcrição e inibidores dos mesmos, e permitir a ativação da transcrição de genes virais de acolhimento (por exemplo, IL6, TNF &amp; #945;, CCL5 e IFNp). Estas cascatas de sinalização constituem respostas inatas intrínsecas potentes imunes que estabelecem um estado anti-microbial para restringir a propagação de patógenos durante os estágios iniciais da infecção. Murino γHV68 está intimamente relacionado com oncogênico SKHV humana e EBV. Assim, a infecção de ratinhos γHV68 fornece um modelo animal pequeno tratável para examinar a resposta imune do hospedeiro à infecção por vírus de herpes gama in vivo 7. Usando γHV68, nosso laboratório revelou uma estratégia complexa pela qual γHV68 seqüestra sediar sinalização imune inato para permitir a infecção viral. Por um lado, γHV68 ativa a via MAVS-IKKβ para promover a ativação da transcrição viral via dirigir IKKβ activado para fosforilar transactivadora replicação (RTA), o fator de transcrição chave viral para γHV68 replicação 8. Por outro lado, a fosforilação IKKβ mediada primos RelA para degradação e termoinates ativação NFkB 9. Como tal, a infecção γHV68 evita eficazmente a produção de citocinas anti-viral. Curiosamente, uma pesquisa utilizando uma biblioteca de γHV68 expressão identificada RTA como uma ligase E3 para induzir a degradação RelA e revogará ativação NFkB 10. Estes resultados descobrir uma estratégia de evasão imune complexa em que os eventos de sinalização imunes a montante são aproveitadas por γHV68 para negar o final da produção de citocinas anti-viral. Aqui nós descrevemos um protocolo para medir a produção de citocinas antiviral em camundongos infectados com γHV68 in vivo e ex viv o. No protocolo que explorar ainda mais a expressão &quot;reconstituído&quot; dos componentes da imunidade inata nos knockout fibroblastos embrionários de transdução lentiviral, que identifica a função das moléculas imunitárias inatas específicos na regulação da produção de citocinas anti-viral. Este protocolo pode ser facilmente adaptada para outras viruses e vias de sinalização.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Mouse CCL5 ELISA kit</td>
			<td style="width:211px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://www.rndsystems.com/Products/DY478">DY478</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">1.0 mm Zirconia/Silica beads</td>
			<td style="width:211px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:223px;">11079110z</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">TRIzol</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=15596018">15596-018</a></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="98" rowspan="2" style="height:98px;width:251px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td rowspan="2" style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:223px;">18064-014</td>
		</tr>
		<tr height="19">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">CCL5 quantitative real-time PCR primers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production

Em resposta a uma infecção virai, a resposta imune inata hospedeiro é activado para sobre-regular a expressão do gene e a produção de citocinas anti-virais. Por outro lado, os vírus evoluíram estratégias complexas para iludir e explorar anfitrião sinalização imune para a sobrevivência e propagação. Evasão imune viral, o que implica a defesa do hospedeiro e evasão viral, fornece uma das interfaces mais fascinantes e dinâmicas para discernir a interação hospedeiro-vírus. Estes estudos avançar nossa compreensão na regulação imune inata e pavimentar o caminho para desenvolver novas terapias antivirais. Murino γHV68 é um agente patogénico natural de roedores murino. γHV68 infecção de camundongos fornece um modelo animal pequeno tratável para examinar a resposta antiviral para SKHV humana e EBV dos quais perturbação da in vivo interações vírus-hospedeiro não é aplicável. Aqui nós descrevemos um protocolo para determinar a produção de citocinas anti-viral. Este protocolo pode ser adaptado para outros virusa e vias de sinalização. Recentemente, descobrimos que γHV68 seqüestra MAVS e IKKβ, principais componentes inatos sinalização imunes a jusante da cytosolic RIG-I e MDA5, revogar ativação NFkB e produção de citocinas anti-viral. Especificamente, a infecção activa γHV68 IKKβ e que IKKβ activado fosforila RelA para acelerar a degradação RelA. Como tal, γ HV68 desacopla eficazmente a activação de NFkB do seu montante IKKβ activado, eliminando a expressão do gene de citocinas anti-viral. Este estudo elucida uma estratégia em que o complexo de activação imune inata a montante é interceptado por um agente patogénico virai de anular a activação da transcrição imediatamente a jusante e evitar a produção de citocinas anti-viral.

Três figuras representativas são mostradas, incluindo a produção de citocinas nos pulmões de Mavs γHV68 infectadas + / + e Mavs-/ - rato, a secreção de citocinas e a expressão do gene de nível Mavs γHV68 infectadas + / + e Mavs - / - MEFs, e níveis de mRNA das citocinas de Mavs γHV68 infectados - / - MEFs &quot;reconstituído&quot; com MAVS. Estas experiências representativas utilizam camundongos knockout de...

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Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Nós descrevemos um protocolo para medir a produção de citocinas antiviral em camundongos infectados com um vírus do herpes modelo murino herpesvírus gama 68 (γ HV68) que está intimamente relacionada ao sarcoma-associado herpesvírus de Kaposi humana (SKHV) e vírus Epstein-Barr (EBV). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos de rato embrionárias (MEFs), avaliou-se a produção de citocinas anti-viral in vivo e ex vivo. &quot;Reconstituição&quot; a expressão de componentes da imunidade inata em eliminatórias fibroblastos embrionários de transdução lentiviral, nós identificar mais moléculas imunes inatas específicas e dissecar os principais eventos de sinalização que diferencialmente regulam a produção de citocinas anti-viral.

Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Imunologia e Infecção

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Indução de Maternal Immune Activation em Ratos na Fase Mid-gestação com Viral Mimic poli (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

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Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

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Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...