Name: dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production
Uploaded: 2014-03-02T14:00:00
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Ratones, de tipo salvaje (Mavs + / +) y knockout (Mavs - / -) de tipo salvaje (Mavs + / +) y knockout (Mavs - / -) MEFs fueron amablemente proporcionados por el Dr. Zhijian J. Chen (Universidad de Texas Southwestern Medical Center) 13. Esta publicación se basa en un trabajo financiado por subvenciones del NIH (R01 CA134241 y R01 DE021445) y la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-11-162-01-MPC).

Declaración de Ética: Todo animal de trabajo se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad del Sur de California. 1. Cytokine Gene Expression Cuantitativo en tiempo real PCR y secreción por ELISA en ratones infectados-HV68 <ol><li> Anestesie, 6-...

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	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-like+receptors:+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA.">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).</li><li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Xu, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li><li>Meylan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. , (2010).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma+herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+abrogate+NFkappaB+activation+and+antiviral+cytokine+production.">Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production.</a> PLoS Pathog. 7, (2011).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+evades+host+cytokine+production+via+replication+transactivator-induced+RelA+degradation.">Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation.</a> J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Host-virus+Interaction+in+Lytic+Replication+of+a+Model+Herpesvirus.">Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li><li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li></ol>

Evasión inmune viral es una de las interacciones más dinámicas y fascinantes interfaces delito viral y la defensa de acogida 9. Los componentes de la inmunidad innata de acogida están estructurados de tal manera que la transducción de señales que se inicie de manera efectiva y transmitida fielmente. Delimitación de la jerarquía y la regulación de las cascadas de señalización es un tema prominente de la inmunidad innata. Aquí, presentamos un protocolo para identificar las funciones de regulación d...

Estudios recientes han indicado las cascadas de señalización en general en el montaje de acogida la respuesta inmune innata. Residiendo en compartimentos distintos, los receptores de reconocimiento de patrones (RRP) detectar patógenos asociados a patrones moleculares (PAMP) de diverso origen para desencadenar inmune innato señalización 1. El gen inducida por ácido retinoico-I (GAR-I) y antígeno de diferenciación de melanoma (5) MDA5 proteínas citosólicas son sensores que reconocen especies de ARN con características estructurales específicas 2. Después de la activación, RIG-I interactúa con sus MAVS aguas abajo (también conocido como IPS-1, VISA y CARDIF) adaptador que, a su vez, activa la IKK (IKKαβγ) y relacionados con IKK-quinasa (TBK1 y IKKε, también conocido como Ikki ) Los complejos de 3-6. Quinasas activadas fosforilan inmunes innatas reguladores clave de la expresión génica, incluyendo factores de transcripción y los inhibidores de los mismos, y permiten la activación transcripcional de los genes antivirales de acogida (por ejemplo, IL-6, TNF &amp; #945;, CCL5, y IFNß). Estas cascadas de señalización constituyen potentes respuestas inmunes innatas intrínsecas que establecen un estado anti-microbiana para restringir la propagación de patógenos durante las primeras etapas de la infección. Murino HV68 está estrechamente relacionado con oncogénico VHSK humana y VEB. Así, la infección de los ratones HV68 proporciona un modelo animal pequeño manejable para examinar la respuesta inmune del huésped a la infección por virus del herpes gamma in vivo 7. Usando HV68, nuestro laboratorio ha descubierto una estrategia compleja cual HV68 secuestra albergar señalización inmune innata para permitir la infección viral. Por un lado, HV68 activa la vía MAVS-IKKβ para promover la activación de la transcripción viral a través de la dirección de IKKβ activado para fosforilar transactivador la replicación (ACR), el factor de transcripción clave para la replicación viral HV68 8. Por otra parte, la fosforilación mediada por IKKβ prepara de RelA para la degradación y plazoinates activación de NFkB 9. Como tal, la infección HV68 evita con eficacia la producción de citoquinas antivirales. Curiosamente, una proyección que utiliza una biblioteca de expresión de la HV68 identificó RTA como una ligasa E3 para inducir la degradación de RelA y suprimirá la activación de NFkB 10. Estos resultados descubren una estrategia de evasión inmune compleja mediante el cual los eventos de señalización inmune aguas arriba son aprovechados por HV68 para negar lo último la producción de citoquinas antivirales. Aquí se describe un protocolo para medir la producción de citoquinas antivirales en ratones infectados con HV68 tanto in vivo como ex viv o. En el protocolo se explora aún más la expresión &quot;reconstituido&quot; de los componentes de la inmunidad innata en los fibroblastos de embriones knockout mediante transducción lentiviral, que establece claramente la función de las moléculas inmunes innatas específicas en la regulación de la producción de citoquinas antivirales. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otros viruses y vías de señalización.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Mouse CCL5 ELISA kit</td>
			<td style="width:211px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://www.rndsystems.com/Products/DY478">DY478</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">1.0 mm Zirconia/Silica beads</td>
			<td style="width:211px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:223px;">11079110z</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">TRIzol</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=15596018">15596-018</a></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="98" rowspan="2" style="height:98px;width:251px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td rowspan="2" style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:223px;">18064-014</td>
		</tr>
		<tr height="19">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">CCL5 quantitative real-time PCR primers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production

En respuesta a una infección viral, la respuesta inmune innata de acogida se activa para regular por incremento la expresión génica y la producción de citoquinas antivirales. Por el contrario, los virus han desarrollado estrategias complejas para evadir y explotar la señalización inmune del huésped para la supervivencia y propagación. Evasión inmune viral, lo que implica la defensa del huésped y la evasión viral, ofrece una de las interfaces más fascinantes y dinámicos para discernir la interacción huésped-virus. Estos estudios avanzan nuestros conocimientos en la regulación inmune innata y allanan el camino para desarrollar nuevas terapias antivirales. Murino HV68 es un patógeno natural de los roedores murinos. HV68 infección de ratones como modelo animal pequeño manejable para examinar la respuesta antiviral a HVSK humana y VEB de que la perturbación de la in vivo interacciones virus-huésped no es aplicable. Aquí se describe un protocolo para determinar la producción de citoquinas antivirales. Este protocolo se puede adaptar a otros Virusos y las vías de señalización. Recientemente, se ha descubierto que HV68 secuestra MAVS y IKKβ, componentes inmunes innatas clave de señalización corriente abajo de la citosólica RIG-I y MDA5, se decida suprimir la activación de NFkB y la producción de citoquinas antivirales. Específicamente, la infección activa HV68 IKKβ y que IKKβ activado fosforila relación a acelerar la degradación de RelA. Como tal, γ HV68 desacopla eficazmente la activación de NFkB de su ascendente IKKβ activado, negando antiviral expresión génica de citocinas. Este estudio aclara una estrategia compleja por lo que la activación inmune innata aguas arriba es interceptada por un patógeno viral para anular la activación transcripcional intermedio inmediato y evadir la producción de citoquinas antivirales.

Tres figuras representativas se muestran aquí, incluyendo la producción de citoquinas en el pulmón de Mavs infectados-HV68 + / + y Mavs-/ - ratón, la secreción de citoquinas y la expresión génica nivel de Mavs infectados-HV68 + / + y Mavs - / - MEFs, y niveles de citoquinas mRNA de Mavs infectadas HV68 - / - MEFs &quot;reconstituidas&quot; con MAVS. Estos experimentos representativos utilizan ratones knockout de ge...

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Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Se describe un protocolo para medir la producción de citoquinas antivirales en ratones infectados con un virus herpes modelo, murino herpesvirus gamma 68 (γ HV68) que está relacionado con estrechamente a sarcoma de herpesvirus asociado de Kaposi humano (VHSK) y virus de Epstein-Barr (EBV). La utilización de cepas de ratones genéticamente modificados y los fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), se evaluó la producción de citocina antiviral tanto in vivo como ex vivo. &quot;Reconstituir&quot; la expresión de los componentes inmunes innatas en eliminatorias fibroblastos embrionarios de transducción lentiviral, Señalamos además moléculas inmunes innatas específicas y diseccionar los eventos de señalización clave que regulan diferencialmente la producción de citocina antiviral.

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

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Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

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La inducción de la activación inmune materna en ratones en la etapa mitad de la gestación con Viral Mimic poli (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

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Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

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Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

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Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

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