Name: dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production
Uploaded: 2014-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production at JoVE.com

Vildtyp (Mavs + / +) och knockout (Mavs - / -)-möss av vildtyp (Mavs + / +) och knockout (Mavs - / -) fick MEFs vänligen tillhandahållen av Dr Zhijian J. Chen (University of Texas Southwestern Medical Center) 13. Denna publikation är baserad på arbete som finansierats genom anslag från NIH (R01 CA134241 och R01 DE021445) och American Cancer Society (RSG-11-162-01-MPC).

Etik Uttalande: Alla djur arbete utfördes under strikt enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur av National Institutes of Health. Protokollet godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Southern California. 1. Cytokine Gene Expression av kvantitativ realtids-PCR och utsöndring medelst ELISA i γHV68 infekterade möss <ol><li> Bedöva könsmatchade, 6-8 veckor gamla C57BL / 6 (B...

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-like+receptors:+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA.">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).</li><li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Xu, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li><li>Meylan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. , (2010).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma+herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+abrogate+NFkappaB+activation+and+antiviral+cytokine+production.">Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production.</a> PLoS Pathog. 7, (2011).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+evades+host+cytokine+production+via+replication+transactivator-induced+RelA+degradation.">Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation.</a> J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).</li><li>Dong, X., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Host-virus+Interaction+in+Lytic+Replication+of+a+Model+Herpesvirus.">Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li><li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li></ol>

Viral immun skatteflykt är en av de mest dynamiska och fascinerande samspel gränssnitt viral brott och värdförsvar 9. Värd medfödda immun komponenter är strukturerade så att signaltransduktion effektivt initieras och troget överförda. Avgränsar hierarkin och reglering av signalkaskader är en framstående ämne av medfödd immunitet. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera de regulatoriska rollerna för en medfödd immun komponent, MAVS, i viral kringgående av cytokinproduktion. Pro...

Nya studier har beskrivit de totala signalkaskader i monterings värd medfödda immunsvar. Bosatta inom olika fack, mönsterigenkänningsreceptorer (PRRs) upptäcka patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) av olika ursprung att utlösa medfödda immun signalering 1. Den retinoinsyra-inducerad gen I (RIG-I) och melanom differentieringsantigen 5 (MDA5) proteiner är cytosoliska sensorer som känner igen RNA arter med specifika strukturella egenskaper 2. Vid aktivering, RIG-I interagerar med sina nedströms MAVS (även kallad IPS-1, VISA, och Cardif) adapter som i sin tur aktiverar IKK (IKKαβγ) och IKK-relaterade kinas (TBK1 och IKKε, även känd som Ikki ) komplex 3-6. Aktiverade medfödda immun kinaser fosforylerar viktiga regulatorer av genuttryck, inklusive transkriptionsfaktorer och inhibitorer därav, och göra det möjligt för transkriptionsaktivering av värd antivirala gener (t.ex. IL6, TNF &amp; #945,, CCL5, och IFN). Dessa signalering kaskader utgör potenta inneboende medfödda immunsvar som etablerar en antimikrobiell tillstånd att begränsa patogen utbredning under tidiga stadier av infektion. Murina γHV68 är nära besläktat med human onkogena KSHV och EBV. Sålunda γHV68 infektion i möss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka värdimmunsvaret mot gamma herpesvirusinfektion in vivo 7. Använda γHV68, har vårt labb avslöjat ett intrikat strategi där γHV68 kapar värd medfödda immunsignalering för att möjliggöra virusinfektion. Å ena sidan γHV68 aktiverar MAVS-IKKβ pathway att främja virala transkriptionsaktivering via rikta aktiverad IKKβ att fosforylera replika transaktivator (RTA), den virala transkriptionsfaktor nyckel för γHV68 replika 8. Å andra sidan, initierar IKKβ-medierad fosforylering RelA för nedbrytning och siktinates NFkB aktivering 9. Som sådan γHV68 infektion undviker effektivt antivirala cytokinproduktion. Intressant, en screening använder ett uttryck bibliotek av γHV68 identifierade RTA som E3 ligas att framkalla RelA nedbrytning och upphäva NFkB aktivering 10. Dessa rön avslöja en invecklad immun skatteflykt strategi där uppströms immun signalering händelser utnyttjas av γHV68 att förneka den ultimata antiviral cytokinproduktion. Här beskriver vi ett protokoll för att mäta den antivirala cytokinproduktion hos möss som infekterats med γHV68 både in vivo och ex viv o. I det protokoll som vi ytterligare utforska &quot;rekonstituerad&quot; uttryck för medfödda immun komponenter i knockout embryonala fibroblaster från Lentiviral transduktion, som preciserar funktionen av specifika medfödda immunmolekyler i regleringen av antivirala cytokinproduktion. Detta protokoll kan lätt anpassas till andra viruSES-och signalsystem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Mouse CCL5 ELISA kit</td>
			<td style="width:211px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://www.rndsystems.com/Products/DY478">DY478</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">1.0 mm Zirconia/Silica beads</td>
			<td style="width:211px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:223px;">11079110z</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">TRIzol</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;"><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=15596018">15596-018</a></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="98" rowspan="2" style="height:98px;width:251px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td rowspan="2" style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:223px;">18064-014</td>
		</tr>
		<tr height="19">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">CCL5 quantitative real-time PCR primers</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting innate immune signaling in viral evasion of cytokine production

Som svar på en virusinfektion, är värd medfödda immunsvaret aktiveras för att uppreglera genexpression och produktion av antivirala cytokiner. Omvänt har virus utvecklat intrikata strategier för att kringgå och utnyttja värd immun signalering för överlevnad och förökning. Viral immun skatteflykt, innebärvärdförsvar och viral skatteflykt, ger en av de mest fascinerande och dynamiska gränssnitt för att urskilja samspelet värd-virus. Dessa studier vår överenskommelse i medfödda immunreglering och bana väg för att utveckla nya antivirala terapier. Murina γHV68 är en naturlig patogen av murina gnagare. γHV68 infektion av möss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka antiviral respons på mänsklig KSHV och EBV varav störning av in vivo virus-värd interaktioner är inte tillämplig. Här beskriver vi ett protokoll för att fastställa den antivirala cytokinproduktion. Detta protokoll kan anpassas till andra viranvänder och signalvägar. Nyligen har vi upptäckt att γHV68 kapar MAVS och IKKβ, nyckel innate immune signalerings komponenter nedströms om den cytosoliska RIG-I och MDA5 att upphäva NFkB aktivering och antivirala cytokinproduktion. Specifikt aktiverar γHV68 infektion IKKβ och att aktiverade IKKβ fosforylerar RelA att accelerera RelA nedbrytning. Som sådan, γ HV68 kopplas effektivt NFkB aktivering från dess uppströms aktiverade IKKβ, motverkar antiviral cytokin genuttryck. Denna studie belyser en intrikat strategi där det uppströms medfödda immunaktivering fångas upp av en viral patogen för att upphäva den omedelbara nedströmstranskriptionsaktiveringen och undgå antivirala cytokinproduktion.

Tre representativa siffror visas här, inklusive cytokinproduktion i lungan av γHV68-infekterade Mavsen + / + och Mavsen-/ - mus, cytokin sekretion och genexpression nivå γHV68-infekterade Mavsen + / + och Mavsen - / - MEF, och cytokin mRNA-nivåer av γHV68-infekterade Mavs - / - MEF &quot;rekonstituerad&quot; med MAVS. Dessa representativa experiment utnyttjar gen knockoutmöss för att undersöka antiviral cytokinpr...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production at JoVE.com

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Vi beskriver ett protokoll för att mäta den antivirala cytokinproduktion hos möss som infekterats med en modell herpesvirus, murina gamma herpesvirus 68 (γ HV68) som är nära relaterad till människans Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV) och Epstein-Barr-virus (EBV). Med användning av genetiskt modifierade musstammar och möss embryonala fibroblaster (MEFs) bedömde vi det antivirala cytokinproduktion både in vivo och ex vivo. &quot;Beredning&quot; ett uttryck för medfödda immun komponenter i knockout embryonala fibroblaster genom lentiviral transduktion, vi ytterligare precisera vissa medfödda immunmolekyler och dissekera de viktigaste signalsystem händelser som på olika sätt reglerar den antivirala cytokinproduktion.

Dissekera Innate Immun Signalering i Viral Evasion av cytokinproduktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifiering av Respirator Burst Response som en indikator för Innate Immune Health i Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Att använda RNA-interferens för att undersöka det medfödda immunsvar i musmakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Icke-invasiv avbildning av det medfödda immun Response i en Zebrafish Larv Modell av<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Induktion av Maternal immunaktivering hos möss vid Mid-dräktighet Stage med Viral Mimic Poly (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Dissekera multi signalering proteinkomplex av Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Single-cell analys av Immunophenotype och cytokin produktion i perifera helblod via massa flödescytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

En musmodell att bedöma medfödda immunsvaret mot Staphylococcus aureus -infektion

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

En Galleria mellonella Oral Administration modell till Study Commensal-Induced medfödda immunsvar

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolering av tonsiller mononukleära celler att studera Ex Vivo medfödda immunsvar i en mänsklig mukosal lymfoid vävnad

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...