Name: fine-tuning the size and minimizing the noise of solid-state nanopores
Uploaded: 2013-10-31T20:00:00
Duration: 9 min 43 s
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私たちは、自然科学とカナダの工学研究評議会、イノベーションのためのカナダの財団、オンタリオ研究基金による支援を認める。私たちは、ナノ細孔ソフトウェアと計装設計のヘルプのための貴重な議論と技術的なサポートのためのナノ細孔の製造および特性評価、L. Andrzejewskiの補助のためにYの劉に感謝し、A. Marziali。

1。ナノ細孔の作製とクリーニング注：ナノポア絶縁膜中に存在するようになると、ステップ2に記載したように、直接、さらなる処理又は洗浄することなく、液体セル内に装着することができる。又は酸素プラズマ2への暴露によって：それは実験間の汚染物質の痕跡を除去する必要がある場合は、ナノポアチップはピラニア溶液3,15,16（H 2 O 2 3：01 H 2 SO 4）のいずれかを用いて洗浄することができる。従って、以下のプロトコルで1.2〜1.9ステップピラニア溶液への曝露によって予備洗浄する必要がない場合は、オプションである。 <ol><li>ドガは、40℃で30分間超音波処理器内で真空下に置くことによって、脱イオン（DI）水を濾過</li><li>慎重に3ミリリットル1ミリリットルの過酸化水素、続いて硫酸を添加し、10 mlビーカー中にピラニア溶液を調製する。ピペットで還流することによって完全に混合する。注意：ピラニア溶液は、非常に危険です。 TA下さい<html>すべての予防措置をKE。 </li><li>耐酸性ピンセットを使用して、慎重に完全にチップを沈め、表面に浮いて、それを避けるために、ピラニア溶液にナノ細孔を有する膜チップ端 - 最初に挿入します。 </li><li>ろ過された水で徹底的にピンセットをすすぐ。 </li><li> 90℃まで熱板のプリセットにビーカーを置き、少なくとも30分間掃除することができます。 </li><li>慎重にきれいなガラスピペットを用いてビーカーからピラニア溶液を除去し、大量の水で廃棄してください。 </li><li>きれいなガラスピペットを使用すると、すすぐためにビーカーにステップ1.1からの脱気脱イオン水5mlを加える。水を除去し、少なくとも5倍を繰り返します。 </li><li>慎重にきれいな鋭い先端ピンセットを用いてビーカーからナノ細孔チップを取り外します。ナノ細孔膜は非常に脆弱であるように、細心の注意を払って取り扱ってください。 </li><li>優しく吸引器を使用して、その縁に吸引を適用することにより、チップを乾燥させます。使用直前まできれいなペトリ皿にチップを格納します。 </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2。ナノ細孔の取り付け<ol><li> 20％の硝酸溶液中に入れ、10分間煮沸することによりテフロンナノポアセル（ 図1）をクリーニングする。注意：すべての必要な個人用保護具を使用して、注意して酸を処理します。 </li><li>慎重に10分間沸騰DI水における硝酸と場所からセルを削除します。 </li><li>硝酸の完全な除去を確実にするためにさらに10分間DI水で細胞を沸騰させる。ホットプレートからビーカーを取り外して、常温に冷却する。 </li><li>ビーカーからセルを削除し、濾過された空気またはN 2で乾燥吹く。きれいなペトリ皿に細胞を保存する。 </li><li>ドガは、40℃で30分間、超音波処理器内で真空下に置くことによって（pH8のHEPESで緩衝化）のKCl溶液を濾過</li><li>少なくとも10分間、エタノール中で超音波処理することにより、各ナノポアチップのきれいな2個のシリコーンエラストマーガスケット。 </li><li>きれいなエラストマーガスケット幸福のcarefuにナノ細孔チップを配置ガスケット開口部を有する膜ウィンドウを整列させるリットル。チップの上に第二のガスケットを配置し、位置を合わせます。 </li><li>きれいにナノ細孔セルの半分のリザーバ入口上のチップ、ガスケットを配置します。所定の位置に残りの半分をねじ込むことにより、細胞を組み立てます。ナノポアセル構成要素の分解図が図1に示されている。 </li><li>細胞貯水池にエタノールをピペットで数気泡が入口を終了するには、見られているまで、真空チャンバー内に配置することにより、ナノ細孔チップを濡らす。 </li><li>フィルタリングKCl溶液を脱気少なくとも3ミリリットルと貯水池をフラッシュしてエタノールを除去。吸引器を使用して、オーバーフローを削除するように注意してください。 </li></ol> 3。ナノ細孔特性評価<ol><li>電気的にシールドされた実験ではナノ細孔のセルを配置し、各貯蔵中のAg / AgCl電極を配置。このセットアップでは、外部電源と電流増幅器を除いて、図2に示したものと同様である低ノイズ抵抗帰還増幅器と交換。 </li><li>電圧固定モードでの低ノイズアンプを使用して、200 mVまで-200 mVでの掃引電位を印加し、IV特性を記録します。 </li><li>溶液17中にその直径を計算するために使用することができるナノ細孔コンダクタンスを得るためにIV曲線を取り付ける。計算された直径は、TEM像から予想されるよりもはるかに小さい場合には、気孔が完全に濡れていない可能性があり、および/または破片や汚染を含んでいます。 </li><li>ナノ細孔全体で200 mVの電位を印加し、30秒間のイオン電流を記録します。 </li><li>イオン電流のパワースペクトル密度（PSD）分析を行い、ナノポアの電気的なノイズ特性を定量化するために統合する。ノイズは5 kHzの帯域幅で15 pAのRMS上回る場合、細孔は完全に濡れていない可能性があり、および/または汚染を含み、確実に、実験に使用することができない。 </li></ol> 4。高い電気フィーを用いて空調ナノ細孔LDS 注：IV曲線が生成された非対称性を示し、または期待小なりコンダクタンス、または現在のトレースは、低周波数での不安定性及び高いノイズレベルを示し、それは細孔上の汚染物を除去するために高電界でナノポアを調整する必要がある場合表面及び/又は孔を濡らす。この方法は、膜キャパシタンス又は測定に使用される電流増幅器の入力に結合された寄生容量に起因する高周波ノイズに影響を与えないものの、（これも1 / fノイズとも呼ばれる）低周波ノイズ18を大幅に低減することができる。この調整を行うために使用されたセットアップの概略図を図2に示す。 <ol><li>パッチクランプアンプから電極を外します。 </li><li>発生&gt; 6 Vのできるコンピュータ制御電源（ここで使用さ30 nmの厚さの膜のための&gt; 0.2 V / nmの電界強度）に電極の一方を接続し、他のEにリアルタイムで監視することができるxternal電流アンプ。 注：高電界の印加は、種々の膜の材料及び厚さのナノ細孔を調整するために使用することができる。特に明記しない限り、両方の30-nmおよび10 nmの膜がここで説明されていますが、記載された電圧は、30 nmの厚さの膜に使用されるものを参照してください。 </li><li>少なくとも5秒間、ナノ細孔全体で400 MV（測定電圧）の電位差を適用します。 </li><li>ナノ細孔のコンダクタンスを決定するために、データの最終的な1秒から平均電流値を計算します。最も可能性の高い形状に基づいて、ソフトウェアと、選択したナノ細孔コンダクタンスモデルを使用して自動的に行われる必要があり、このコンダクタンスに基づいたナノ細孔の直径を計算します。これは、IV曲線から測定径に対応している必要があります。 </li><li> 5秒の測定期間に続いて0.2 V / nmでの電界を生成するために、ナノポアを横切っ6 V（湿潤電圧）の200ミリ秒パルスを適用する400 mVに。ここでも、データの最後の1秒を使用して、ナノポアの直径を計算し、ナノポアが完全に濡れていることを保証するためにTEM測定から期待値と比較する。必要に応じて、数回繰り返す。 </li><li>必要に応じて、測定期間中の電流信号が安定するまで電圧を増加させ、予想されるコンダクタンスを示す高電界パルスの印加を繰り返す。これが大幅に拡大したり、急速にナノ細孔を破損する恐れがあるので、それは、10 Vの（ すなわち &gt; 0.3 V / nm）を超えることは推奨されません。 </li></ol> 5。高電界を使用してナノ細孔を拡大注意：ナノ細孔の直径は、特定の生体分子センシング·アプリケーション用の機能性を決定する上で非常に重要です。この目的のために、ナノポアは、適切な径を洗浄および湿潤するために使用される同じ設定を用いて達成されるまで、高電界を印加することにより、所望の大きさに拡大することができるTEMを使用して作成されナノ細孔（ 図2）。 <ol><li>部4と同様の電子配置を用いて、直径の測定値を得るために細孔を横切って200〜500 mVのバイアスを印加する。 IV曲線をフィッティング未満精密ながら、一点測定は、大きく、急速にナノポアの大きさを推定するために使用することができる。 </li><li> 400 mVで、少なくとも5秒の測定期間に続いて、ナノ細孔全体で8 Vの2秒のパルスを適用します。新しい直径の計算は、通常、ナノ細孔のサイズが非常に小さい増加（&lt;0.1 ​​nm）を表示します。 </li><li> その場およびナノ細孔径を大きくするリアルタイム測定で取得するために拡大し、測定電圧を交互に、周期的にこのプロセスを繰り返します。 </li><li>より速い成長速度が望ましい場合、細孔が0.03ナノ秒/秒までの範囲のEC＆＃コンダクタンスの増加率で拡大するように、典型的に加速する10 V.成長まで漸増印加電圧の大きさを増加させる160; 10ナノ秒/秒、ナノポアの大きさ、電界の強さと、電解液の特性に応じて。 </li><li>所望の直径に達すると、高電界の印加を停止する。これは、コンピュータプログラムを用いて自動的に行うことができる。 </li><li>電極へのパッチクランプアンプを再接続します。 </li><li>上記3.5 - ナノ細孔の直径を確認し、ステップ3.2と低ノイズ電流信号を確認するために、200 mVで新しいIVおよび現行のトレース·データを取得する。必要に応じて、（ - 5.5 4.1ステップ）のコンディショニングを繰り返して、プロトコルを拡大。 </li></ol> 6。 DNA転座<ol><li>生体分子試料を添加する前に、リザーバ内の汚染がないことを確認するために対照実験を行う。電流封鎖が2分後に検出されないことを確認するために、任意のサンプルがない場合の150から300 mVと印加電位の下で現在のトレースを取得する。 </li><li>へのλDNA（48.5 kbpの二本鎖）を追加&lt;EM&gt; 0.5-2 NG /μLの最終濃度のためのシス貯水池。リザーバを通して試料の均一な分布を確実にするために、少なくとも10秒間、ピペットで穏やかに還流。 </li><li> 30 nmの厚さのナノ細孔の場合は、 トランスリザーバに150から300 mVの潜在的バイアスを印加し、ナノ細孔を通過するイオン電流を測定する。非常に短い転座イベントの場合は、比較的高いローパスフィルタ周波数（100 kHz）の高周波数（250 kHzまたはそれ以上）でサンプリングすることが望ましい。 </li><li>分子がナノ細孔を通って転位するように過渡電流封鎖を検出するためのソフトウェアを使用してイオン電流を監視します。分子移動のイオン電流トレースは、関心のある試料についての情報を推測するために閉塞の深さ、持続時間および頻度を決定するために分析することができる。転位の分子についての情報が知られている場合、逆に、このデータは、ナノポア自体の特性を調べるために使用することができる。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

ナノ細孔径の制御は、生体分子センシング用途において基本的に重要である。ナノポアの直径はプローブされる分子の大きさのオーダーである必要があり、彼らは、試料を収容するのに十分大きいが、最適な信号対雑音を達成するの​​に十分に小さくなければならない。高電界を印加すると提示された方法を使用してサイズの制御が唯一のプロセスを通じて増加することをナノ細孔径の単方向ですが、3-100ナノメートルの直径を有するナノ細孔は、サブナノメートルの精度で、作ることができます。 3-4 nmの細孔が容易にTEM 23を用いて製造することができるように、これは、嵩高いタンパク質-リガンド複合体の相互作用のssDNA構造をプロービングより広い範囲のアプリケーションの固体ナノポアの信頼できる製造を可能にする。 100nmの前記ナノ細孔の成長が非常に速く、それほど正確であることができるが、より穏やかな条件は、拡大プロセスのよりよい制御を実現するために用いることができる。 sとUCH、効果的なサイズ制御を達成するための最も重要なステップは、拡大効率及び所望の孔径を達成するために要求される精度のレベルのバランスをとるために、パルスの強度および持続時間の選択である。これをさらに拡大が低いバイアスしかし同等の電界強度が観測される薄いナノ細孔（10nmの厚さ）の拡大によって強調される。最終的なサイズによっては、数分で、サブ100 nmの直径にナノ細孔を拡大することが一般的に可能である。 それは、バックグラウンドノイズからトランスロケーション信号を区別することはほぼ不可能であると同様に、大型の低周波電流の変動は、単分子研究を排除する。不完全な24湿潤 、最初の製造25とナノ細孔壁13上の破片の吸着後に残っている炭素質残留物の存在は、多くの場合、私がある過酷な化学治療と追加の清掃を必要とする、信号品質を劣化させることができますnefficacious。興味深いことに、それは、湿潤を補助又は穿孔、イメージングおよび取り扱いプロセスから残さ汚染を除去するために実装する前に、ピラニア溶液中または酸素プラズマでナノポアを洗浄することの重要性を強調するために、固体ナノポアプロトコルのが一般的である。でも、この治療で、しかし、ナノ細孔は、多くの場合、濡れないか、高ノイズを発揮し続け、失敗した試行のための提案された解決策は、非常に時間がかかり、14可能な追加の洗浄を行うことである。高電界を印加すると、これらの長いプロトコルは、用途に応じて必要ではないかもしれない。これは、ほとんどのデバイスが、結果として準備時間および過酷な化学物質に対処する必要性を低減する、本明細書に記載した方法を用いてその場で再調整することができることが分かった。電気的ノイズを緩和する上で最も重要なステップは完全にポアを濡らし、ゆるく結合したデブリを除去するための単純な電圧の上昇及び/又はパルス持続時間である。このように処理されたナノ細孔を確実にそのようなDNAおよびタンパク質の通路としての生体分子転位実験で使用することができる。これらの分子は目詰まりやノイズの多い電気信号に通じる細孔壁に付着した場合、高電界パルスが障害物を除去し、流体セルからナノポアチップのマウントを解除することなく、更なる実験のための低ノイズ特性を回復するために再適用することができる。 記載のセットアップを使用して高電界の印加は、高帯域幅（&gt; 1kHzの）における感度と低ノイズ特性を欠くV 10及び電流増幅器まで適用することができ、外部電源の必要条件によって制限されるため単一分子センシング。典型的な生体分子の実験は±1 Vに制限され、低雑音増幅器電流に依存するが、adjuで高電界調節および感受性電流の測定の両方を達成することができる単一のシステムを設計することは簡単である安定した利得。この制限にもかかわらず、他の1セットアップからの移行は、迅速かつ簡単です。例えば、SEM 5、熱酸化および8整形膜の使用として、ナノポアの大きさを制御するための既存の技術に比べて、高い電界が標準的な装置を用いて実験台上で実施し、提供することができるより速く、より正確かつより安価な方法を提供ナノ細孔サイズの広い範囲。迅速かつ再現低周波ノイズを低減する能力は、最初の製造の信頼性になり、以前に使用した細孔がさらなる実験に若返ることができるように、固体ナノポアの寿命を延長する。要するに、高電界でコンディショニング様々な厚さのナノ細孔の95％以上は、生体分子検出に適した、それらをレンダリングする、非常に小さな低周波ノイズ特性を示した。製造は、よりaccessi固体ナノ細孔実験を行う、このように簡単に、より信頼性がある研究者へのBLE、潜在的に、より堅牢な製造プロセスによってナノ細孔技術の実用化への道を可能にする。

生物学的および固体ナノ細孔は、単一分子レベル1での生体分子の分析物を検出する手段を提供する。個々のナノ細孔は、通常、2つの液体リザーバ間を通過するイオン電流のための唯一の導管を提供する、薄い絶縁膜に埋め込まれている。大規模コールターカウンターの原理を利用して、ナノポア実験は、それらが電気泳動的に外部電場の存在下でナノ細孔を介して駆動されるように、荷電した生体分子の長、大きさ、電荷および立体配座を決定するために、イオン電流の変化を関連付ける。 例えば、α-溶血素のような生物学的ナノポアは、典型的には、高い感度と低ノイズ特性3を提供していますが、支持脂質二重層は、それらの適用性を制限し、壊れやすく、固定サイズのものである。固体ナノ細孔は、一方では、薄い（10〜50 nm）のシリコン窒化物又はシリコン酸化膜で作製され、異なるSIZで作ることができるエス、容易にウェーハスケール技術6,7と一体化し、より堅牢であり、実験条件のより広い範囲を可能にする。これらの利点にもかかわらず、固体ナノポア技術は、生体分子研究のためのそれらの有用性を制限するいくつかの実用的な欠点がある。ナノ細孔径の制御が可能であるが、特殊な装置や熟練した人員を必要とし、達成するために、典型的には高価で面倒である。例えば、集束イオンビームにより穿孔ナノポアは最近、走査型電子顕微鏡（SEM）5内の特定の実験条件下で収縮することが示されている。他のアプローチでは、透過型電子顕微鏡（TEM）により穿孔ナノ細孔は、ビーム条件および水性溶媒8に続く暴露に応じて拡張または縮小することができる。これらの場合において、ナノ細孔サイズの達成可能な範囲は、化学治療の後、限られた制御が困難でかつナノポアの大きさが変更できるので、さらに信頼性がない又は特定の液体環境9中に浸漬したとき。 固体ナノ細孔を通るイオン電流も高く、ノイズに悩まされることができる、のソースは、ナノ細孔文献2,3,10,11において激しく調査し話題です。種々の方法は、電気ノイズを低減するために提案されているが、信頼性の高い、安定した低ノイズナノポアの収率は、典型的には低い。掘削および撮像中の炭素質残留物の堆積は、多くの場合、完全な濡れにチャレンジを行うと12を除去することは困難であるナノバブルの形成を引き起こし、電気信号の品質に有害な影響を有することができる。また、検体分子によるナノポアの目詰まりがさらなる実験のために使用できない孔13,14をレンダリングする信号品質を劣化させる。要するに、これらの効果が大きく官能ナノポア装置の歩留まりを低下させ、固体ナノポアの研究に関連するコストを増加させる。 アプリケーション0.15 V / 100nmの範囲で高電界を生成するためのAg / AgCl電極の電圧のTiONからは、これらの課題に対する驚くほど簡単な解決策を提示する。短い電圧パルス、単分子研究のためのクリーンな低ノイズナノ細孔表面の理想的な周期的なアプリケーションを介して生成される。高電界への長期暴露は、ナノ細孔径の増大をもたらす細孔壁を構成する膜材料の除去を開始する。この成長は、正確に、パルス強度及び持続時間を調整することによって制御することができる。分子がナノ細孔表面に吸着するような電流トレースによるナノ細孔の目詰まりによる実験の経過と共に劣化したように、このプロセスは、そうでなければ廃棄される詰まっデバイスを回収するために繰り返すことができる。このように、機能的なナノ細孔の収率はさらに、同じデバイスを複数回使用する能力によって増大する。それは迅速に実験で液体で実行されるように、この方法にはいくつかの利点を提供する条件は、唯一の標準実験室装置を必要とするソフトウェアで自動化することができ、95％以上の収率で官能高品質のナノ細孔を生成する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="516">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JEM-2100F TEM</td>
			<td style="width:136px;">JEOL</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td style="width:83px;">Drilling requires 200 kV accelerating voltage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier</td>
			<td style="width:136px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td>Low-noise voltage and current amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">X-Series data acquisition card</td>
			<td style="width:136px;">National Instruments</td>
			<td style="width:81px;">PCI-6351</td>
			<td>Interfacing with setup, apply of high electric fields</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LabVIEW 2012 software</td>
			<td style="width:136px;">National Instruments</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td>Apply voltages, record current, data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Current amplifier</td>
			<td style="width:136px;">Keithley</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td>Current amplification during high electric field pulses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows</td>
			<td style="width:136px;">Norcada Inc.</td>
			<td style="width:81px;">NT005X</td>
			<td>Substrate in which nanopores are created</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows</td>
			<td style="width:136px;">Norcada Inc.</td>
			<td style="width:81px;">NT005Z</td>
			<td>Substrate in which nanopores are created</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicone elastomer O-rings</td>
			<td style="width:136px;">Marian Chicago</td>
			<td style="width:81px;">HT6135</td>
			<td>Punched for sealing the nanopore chip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:136px;">In Vivo Metric</td>
			<td style="width:81px;">E255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:81px;">52004P</td>
			<td>Used for cleaning cells - handle with caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:81px;">H323</td>
			<td>Used for piranha solution - handle with caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:81px;">A300</td>
			<td>Used for piranha solution - handle with caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:81px;">P335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:81px;">BP310</td>
			<td>Buffering KCl solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary Faraday cage</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td>Shielding nanopore cell, electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Secondary Faraday cage</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td>Shielding headstage, electrode wires</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Teflon cell</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td>To hold nanopore chip and reservoirs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hot plate</td>
			<td style="width:136px;">VWR</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td>Heating piranha solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fine-tuning the size and minimizing the noise of solid-state nanopores

固体ナノ細孔は、核酸やタンパク質などの1つの生体分子の特性評価のための汎用的なツールとして浮上している。しかしながら、薄い絶縁膜中のナノポアの作成は困難なままである。特殊な集束電子ビームシステムを含む製造方法は、明確に定義されたナノ細孔を生成することができるが、市販の膜で信頼性が高く、低騒音ナノポアの収率は、2,3低いままとサイズ制御が4,5自明である。ここで、微調整に高電界の印加は、最適な低ノイズ性能を確保しつつ、ナノポアの大きさが実証される。高電界のこれらの短いパルスは、自然のままの電気信号を発生し、長時間露光時​​にサブナノメートルの精度でナノ細孔の拡大を可能にするために使用される。この方法は、複数の収率及び再現性を向上させる、標準的な実験装置を用いて水性環境中でその場で行われるオリッ状態ナノ細孔の製造。

この研究で用いナノ細孔は、30ナノメートル厚さ10nmのシリコン窒化膜ウィンドウで掘削された。記載されたプロトコルは、様々な材料の固体ナノ細孔の任意の方法を用いて作製に適用することができるが、それらは一般に、以前に確立されたプロトコル11,14を用いてTEMによって穿孔される。 TEMで掘削ナノ細孔は、直径4-8 nmの（ 図2）との間で一般的である。両方の30-nmおよび10 nmの厚さの膜が取り付けられており、上記のプロトコルを使用して調整することができますが、特に明記しない限り、記載された電圧バイアスが30 nmの厚さの膜に必要なものを参照してください。異なる大きさの膜については、印加電圧がナノポア内部0.15 V / 100nmの範囲で電界を生成するように調整されるべきである。 図3aは、高電界を用いた治療の前と後の30 nmの厚さの膜中に10 nmのナノ細孔の2典型的なコンダクタンストレースを示しています。新しくdは装着時ナノ細孔をrilled、不安定なイオン電流ノイズの多い信号を取得する低周波変動度の高い呈する可能性が通常高い。 図3aに示されているナノ細孔は、この動作を強調しています。そのコンダクタンスが不完全な濡れに最も可能性の大きさのナノ細孔のために予想よりもかなり少ない。 8 Vパルス（2秒間持続時間の90パルス）によって生成大きさが0.27 V / nmで高電界を印加すると、ナノ細孔は完全に濡れになり、その後、直径21ナノメートルに拡大されます。この時点で、細孔は、低雑音特性を有する安定したコンダクタンスを示す。同様のナノポアにおけるノイズの定量分析は、 図3bにおけるパワースペクトル密度プロットとして示されている。湿っていないおよび/または詰まった毛穴の低周波ノイズの振幅が非常に高い（&gt; 20 pAをRMS）、実験で使用不能にそれらをレンダリングする。高電場、低周波数（&lt;10 kHz）の時の雑音電力と空調の際diminisです最大3桁、低ノイズ·実験のための準備でHED。 印加電位が拡大して低電界計測期間の間に高電界パルス化されるように、 図4aは、典型的な電流測定を示す。後続の各パルスの後に、（ナノ細孔コンダクタンスIE）測定電圧でのナノ細孔を通って生じたイオン電流は、限られた量だけ増加する。これは、直径dが有効長さl eff の円筒形状を有するものとしてナノポアを近似する、導電率σの溶液中にそのコンダクタンスGから推測できるように、ナノポアは、サイズが大きくなることを示している。様々な他のモデルは、その幾何学17,19-21にナノ細孔コンダクタンスを関連付けるために存在するが、幾何学的およびアクセス抵抗項を組み込んだ次の関係が、高塩におけるTEM-掘削ナノ細孔の有効な証明されています二本鎖DNAの転座17,22のための関心の直径の広い範囲にわたって濃度。 <img alt="" src="/files/ftp_upload/51081/51081eqn.jpg" width="150px" />所望の直径に達すると、プロセスは、ソフトウェアによって自動的に停止される。 図4bに示すように、得られたナノ細孔の直径は、次いで、正確なIV測定を用いて確認することができる。 これは、高電界を使用して治療ナノ細孔が完全に機能していることに注意することが重要である。 図5aに示されたコンダクタンストレースに示すように、これは、λのDNA転座を検出することによって検証されます。この図では、二本鎖DNAは、記載された方法を用いて、11 nmおよび32 nmのに拡大された2つのナノポアを介して駆動される。それぞれの場合において、ベースラインコンダクタンスは非常に安定であり、二本鎖DNA分子がナノ細孔を通って転位するように透明な封鎖は、高い信号対表示、観察され高いノイズを示す未処理の毛穴に比べてノイズの単一分子転イベント。 図5aの挿入図に示すように、これらのサイズのナノポアについて予想されるように、個々の折り畳まれた分子は、転位のように、複数の別個の閉塞レベルが観察される。各ポア貫通転位事象中にナノ細孔コンダクタンスのヒストグラムは、 図5bに示されている。二重閉塞状態（2本のDNA鎖 - 折りたたみ時） - ナノ細孔の低ノイズ特性は、ベースラインに対応する明確な、簡単に解決可能なピーク（DNAなし）、シングル（折り畳まれていない1のDNA鎖）を明らかにしている。注目すべきは、細孔を占める単一のdsDNA分子に対応するコンダクタンスの変化が大きく、小さいナノ細孔で異なるという事実である。他の孔またはクラックがtで作成されていた場合、同じ閉塞振幅が観察されるであろうように、これは、高電界の印加は、実際には既存のナノ細孔を拡大していることの間接的証拠を提供する彼は、プロセス17の間に、膜。 同様に、 図6は、異なる厚さの膜で作製したナノ細孔を拡大する高電界の有効性を示している。ここでは、10ナノメートルのSiNx膜で作成されたナノ細孔が不安定と比較的小さなコンダクタンスを表示する、最初は部分的に湿っていないです。 ±3 Vを交互に印加すると4秒の時間（30の合計）のパルス（0.3 V / nmで±）、ナノ細孔は、ウェットとなり、3 nmの細孔のための理想的なIV特性を示す。方法論は、その後、400以降のパルスに対して繰り返し、ナノ細孔を8 nmまで拡大されました。この拡大は、同程度の電界で行わ限定さ30nmの膜で作製したナノ細孔の場合よりも低い印加電圧バイアスは、プロセスは、主に駆動される電界であることを示している。より薄い膜を介して転座によって生成される電流遮断は、薄い膜が厚く細孔、ナノ細孔中に生成されるものよりも大きくなるようにこのように処理されたような増加した感度を有するタンパク質などのより短い分子を研究するために使用することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig1.jpg" width="600px" /> 図1。ナノ細孔セルアセンブリ。ナノ細孔を含む窒化珪素膜を順番に電解質リザーバーを含む2テフロン半電池で圧縮されているシリコーンエラストマーガスケット、間に配置されます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig2.jpg" width="600px" /> 図2。ナノ細孔調整とセットアップを拡大。厚さ30nmのシリコン窒化膜（左）で掘削ナノ細孔は、2液リザーバーを接続している。 Aコンピュータは、パッチクランプアンプや電解質リザーバ内に浸漬さのAg / AgCl電極を介してナノポアを横切って電位バイアスを印加する外部電源（DAQカード）のいずれかを制御するために使用される。電流増幅器は、コンピュータソフトウェアを用いてリアルタイムで監視するために測定されたイオン電流を中継する。この図は、[11]から変更されている。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig3.jpg" width="600px" /> 図3。高電界印加前と後の電流トレースします。（a）に取り付け、さらにはピラニア溶液で洗浄する次の時には、ナノ細孔のコンダクタンスが不安定と円筒10 nmの細孔（青）に期待されるよりも少ない。 8 Vの2秒パルスの印加後に、ナノポアは、完全に湿らせ、拡大された、安定したコンダクタンスを示す生体分子センシング実験（緑）のために使用することができるされている。 （b）は （それぞれ青とオレンジ）、不完全に濡れ詰まりナノポアのパワースペクトル密度をプロット。 8 Vの200ミリ秒のパルスを印加すると、ナノ細孔（それぞれ、緑色および赤色）湿ら及び破片を除去した。この図は、[11]から変更されている。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig4.jpg" width="600px" /> 図4。高電界を使って拡大ナノ細孔。（a）の拡大と測定可能性のバイアス（赤）を交互にナノポアをイオン電流（青色）が有限のステップで増加することを明らかにしている。結果として行動ANCE測定は、ナノポアの直径を推測するために使用することができる。所望の直径が達成されると、プロセスは停止される。 （b）は、コンダクタンスの正確なIV測定は、ナノ細孔のサイズが増加していることを確認します。それらが適合することができ、それらの対称及びオーミック挙動を確認することができるようなプロットは、単一点の電流値よりも細孔径のより良好な推定値を提供する。この図は、[11]から変更されている。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig5.jpg" width="600px" /> 図5。エアコン、ナノ細孔を介してDNAの転座。（A）150 mVとバイアスでナノ細孔の片側に二本鎖DNAを加え（48.5 kbpの）は11ナノメートル（青）のコンダクタンストレースと32 nmのPORの一過性の封鎖を生成ES（赤）。 （b）は、ナノ細孔のそれぞれのコンダクタンスのヒストグラムはベースラインに対応する離散ピーク、シングルとダブルの転座のイベントを示しています。この図は、[11]から変更されている。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig6.jpg" width="600px" /> 図6。 10 nmの膜中のナノ細孔の拡大。10 nmの膜内のナノ細孔もともと展示品はほとんどコンダクタンスと非対称I-V特性（オレンジ）。 30±3 V（4秒の期間）の間に交流のパルス、ナノ細孔を濡らすとの印加時に3 nmの細孔（青）に期待されるものと一致コンダクタンスで理想的なIV特性を示す。 ±3Vの更なる400パルスが8nmの直径をナノ細孔を拡大（緑）。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig6highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores

生体分子転位実験のために、溶液中の固体ナノ細孔を製造するための方法が提示される。高電界の短いパルスを印加することにより、ナノ細孔径がサブナノメートルの精度で制御可能に大きくすることができ、その電気的なノイズ特性が大幅に改善。この手順は、実験条件下で標準的な実験装置を用いてその場で実行される。

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