Name: a method for systematic electrochemical and electrophysiological evaluation of neural recording electrodes
Uploaded: 2014-03-03T22:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes at JoVE.com

המחברים מודים לתמיכה של המועצה למחקר האוסטרלי באמצעות המרכז למצוינות לElectromaterials מדע.

הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת La Trobe (09-28P) וועדות אוניברסיטת RMIT בעלי החיים אתיקה (1315). 1. בדיקת אלקטרודה הכנה וראשונית במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות בתצהיר ציפוי האלקטרודה, למשל 10 מ&q...

<ol>
	<li>Oluigbo, C. O., Rezai, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Neurological+Disorders+With+Neuromodulation.">Addressing Neurological Disorders With Neuromodulation.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 58, 1907-1917 (2011).</li><li>Shivdasani, M. N., Mauger, S. J., Rathbone, G. D., Paolini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferior+Colliculus+Responses+to+Multichannel+Microstimulation+of+the+Ventral+Cochlear+Nucleus:+Implications+for+Auditory+Brain+Stem+Implants.">Inferior Colliculus Responses to Multichannel Microstimulation of the Ventral Cochlear Nucleus: Implications for Auditory Brain Stem Implants.</a> J. Neurophysiol. 99, 1-13 (2008).</li><li>Perlmutter, J. S., Mink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Brain+Stimulation.">Deep Brain Stimulation.</a> Ann. Rev. Neurosci. 29, 229 (2006).</li><li>Weaver, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilateral+Deep+Brain+Stimulation+vs+Best+Medical+Therapy+for+Patients+With+Advanced+Parkinson+Disease.">Bilateral Deep Brain Stimulation vs Best Medical Therapy for Patients With Advanced Parkinson Disease.</a> J. Am. Med. Assoc. 301, 63-73 (2009).</li><li>Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+loss+accompanies+the+brain+tissue+response+to+chronically+implanted+silicon+microelectrode+arrays.">Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays.</a> Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).</li><li>McConnell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+neural+electrodes+cause+chronic,+local+inflammation+that+is+correlated+with+local+neurodegeneration.">Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+interface+between+neural+tissue+and+chronically+implanted+intracortical+microelectrodes.">Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes.</a> IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).</li><li>Rousche, P. J., Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+recording+capability+of+the+Utah+Intracortical+Electrode+Array+in+cat+sensory+cortex.">Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 82, 1-15 (1998).</li><li>Williams, J. C., Rennaker, R. L., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+neural+recording+characteristics+of+wire+microelectrode+arrays+implanted+in+cerebral+cortex.">Long-term neural recording characteristics of wire microelectrode arrays implanted in cerebral cortex.</a> Brain Res. Protoc. 4, 303-313 (1999).</li><li>Harris, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conducting+polymer+coated+neural+recording+electrodes.">Conducting polymer coated neural recording electrodes.</a> J. Neural Eng. 10, (2013).</li><li>Bard, A. J., Faulkner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods. , (2001).</li><li>Ludwig, K. A., Uram, J. D., Yang, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+neural+recordings+using+silicon+microelectrode+arrays+electrochemically+deposited+with+a+poly(3,4-ethylenedioxythiophene)+(PEDOT)+film.">Chronic neural recordings using silicon microelectrode arrays electrochemically deposited with a poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) film.</a> J. Neural Eng. 3, 59 (2006).</li></ol>

פרוטוקול זה מספק שיטה להשוואה בין ציפוי האלקטרודה הקלטה עצבי בתוך חיה אחת. עיצוב אלקטרודה המשמש הוא אידיאלי להשתלה לתוך colliculus נחותים עכברוש (IC), עם ממדים של קנה מידה דומה. וריאציות של אלקטרודה זו כגון מקום רב יותר בין שאנקס ימנעו כל אנקס להיות בחולדה IC באותו הזמן, בעוד ...

שתלים עצביים נמצאים בשימוש יותר ויותר למחקר, שליטה תותבות וטיפול בהפרעות כגון מחלת פרקינסון, אפילפסיה, ו1,2 אובדן חושים. מדידה ו / או שליטה הן כימית והרכב חשמלי של המוח היא הבסיס לכל שתלים העצביים. עם זאת, חשוב לנהל את טיפול רק כאשר הרקמה העצבית נמצאת במצב החריג כדי להפחית את תופעות הלוואי 3. לדוגמא, לגירוי מוחי עמוק לטיפול באפילפסיה צריך לחול רק פולס חשמלי למוח במהלך התקף. תופעות לוואי מסוימים עשויות להיות דיסטוניה, אובדן הזיכרון, בלבול, תפקוד הקוגניטיבי לקוי, הזיות מושרה, דיכאון או אנטי הדיכאון 3,4. במכשירים רבים, מערכת לולאה סגורה לכן יש צורך להקליט את הפעילות חשמלית וכדי לעורר גירוי כאשר מדינה נורמלית הוא זוהה. אלקטרודות הקלטה משמשות גם כדי לשלוט בפרומכשירי sthetic. זה קריטי כדי להקליט את הפעילות העצבית היעד עם היחס הגבוה ביותר אפשרי אות לרעש כדי להשיג מפעילה מדויק ביותר ובקרה של התקן. יחס אות לרעש גדול הוא גם רצוי מאוד עבור יישומי מחקר, כפי שניתן לקבל נתונים אמינים יותר, וכתוצאה מנבדקים נדרשו פחות. זה גם יאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים ומסלולים מעורבים בגירוי והקלטה עצביים. לאחר שתל עצבי הושם לתוך המוח, תגובה חיסונית מופעלת על 5,6. במהלך זמן התגובה מחולק בדרך כלל לשלבים אקוטיים וכרוניים, כל אחת בהיקף של תהליכים ביולוגיים שונים 7. התגובה החיסונית יכולה להיות השפעה דרמטית על הביצועים של השתל, כגון בידוד של אלקטרודות מהנוירונים היעד ידי אנקפסולציה בצלקת או השפלה כימית גליה של חומרי שתל 8.זה יכול להפחית את יחס אות לרעש של האלקטרודה הקלטה ותפוקת החשמל של האלקטרודה מגרה, ולהוביל לאלקטרודה כישלון 9. בחירה קפדנית של עיצוב שתל וחומרים נחוץ כדי למנוע כישלון לאורך חיי השתל. רבים חומרים שונים ועיצובים שתל פותחו לאחרונה כדי לשפר את יחס אות לרעש ויציבות שתל להקלטה עצבית. חומרי אלקטרודה כללו פלטינה, אירידיום, טונגסטן, תחמוצת אירידיום, תחמוצת טנטלום, גרפן, צינורות פחמן, מסוממים פולימרים מוליכים, ולאחרונה הידרוג. חומרי מצע שנבדקו כוללים גם סיליקון, תחמוצת סיליקון, סיליקון ניטריד, משי, טפלון, polyimide, וסיליקון. שינויי אלקטרודה שונים גם נחקרו, תוך שימוש בציפויים כגון laminin, neurotrophins, או monolayers עצמי התאספו וטיפולים באמצעות אלקטרוכימיים, פלזמה ושיטות אופטיות. עיצוב שתלים יכול להיות 1 -, 2 - או 3 ממדים עם אלקטרודות בדרך כלל בקצה של חללית בידוד או בשולי שוק חודר אלקטרודות או במערך 2 ממדים לשתלי משטח קליפת המוח. ללא קשר לעיצוב האלקטרודה או חומר, הספרות קודמת יש בדרך כלל הוכיחה את הביצועים של השתל החדש ללא התייחסות למבני שתל אחרים. זה מונע הערכה שיטתית של הנכסים שלהם. פרוטוקול זה מספק שיטה להשוואה בין חומרי אלקטרודה שונים באמצעות מגוון של שיטות אנליטיות ואלקטרו. הוא מבוסס על מאמר שפורסם לאחרונה אשר לעומת 4 מסוממים שונה ביצוע ציפוי פולימר (polypyrrole (PPy) ופולי-3 ,4-ethylenedioxythiophene (PEDOT) מסומם עם סולפט (SO 4) או sulfonate para-טולואן (נק &#39;)) ו -4 ציפוי שונה בעוביי 10. מאמר זה מצא חומר אחד, PEDOT-נק &#39;עם זמן בתצהיר 45 שניות,היה לי ספירת היחס וספייק הגבוהה ביותר אות לרעש עם רעש הרקע הקטן ביותר וכי הפרמטרים אלה היו תלויים בעכבת אלקטרודה. PEDOT-נק &#39;מוצג גם biostability החריף מעולה לעומת הפולימרים מסוממים ניהול האחרים ואלקטרודות אירידיום חשופות. הפרוטוקול מאפשר הפרמטרים הקריטיים שליטה יחס אות לרעש ויציבות שייקבע ומשמש כדי לשפר את הביצועים של האלקטרודות הקלטה עצביות נוסף.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1217">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Programmable Attenuator</td>
			<td style="width:195px;">TDT</td>
			<td style="width:179px;">PA5</td>
			<td style="width:600px;">Controls the amplitude of the acoustic signal across frequencies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Electrostatic speaker driver</td>
			<td style="width:195px;">TDT</td>
			<td style="width:179px;">ED1</td>
			<td>Drives the electrostatic speakers (EC1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Coupled electrostatic speaker</td>
			<td style="width:195px;">TDT</td>
			<td style="width:179px;">EC1</td>
			<td>Delivers sound to the animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Processing base station</td>
			<td style="width:195px;">TDT</td>
			<td style="width:179px;">RZ2</td>
			<td>Records neural activity from electrode array (using PZ2 preamplifier)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Preamplifier</td>
			<td style="width:195px;">TDT</td>
			<td style="width:179px;">PZ2-256</td>
			<td>256-channel high impedance preamplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Multifunction Processor</td>
			<td style="width:195px;">TDT</td>
			<td style="width:179px;">RX6</td>
			<td>Used to generate acoustic stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:244px;">Multichannel electrode</td>
			<td style="width:195px;">NeuroNexus Technologies</td>
			<td style="width:179px;">A4 &#215; 8&#8211;5mm-200-200-413</td>
			<td>4-shank 32-channel electrode array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:195px;">CH Instruments</td>
			<td style="width:179px;">CHI660B</td>
			<td>Deposits electrode coatings and performs cyclic voltammetry and EIS (used with CHI684)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Multiplexer</td>
			<td style="width:195px;">CH Instruments</td>
			<td style="width:179px;">CHI684</td>
			<td>Switches between electrodes on the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">di-sodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Fluka</td>
			<td style="width:179px;">71644</td>
			<td>Used in the test solution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:244px;">3,4-ethylenedioxythiophene (EDOT)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">483028</td>
			<td>An electrode coating material</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">para-toluene sulfonate (Na2pTS)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">152536</td>
			<td>An electrode coating material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Urethane</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">U2500</td>
			<td>Used to anaesthetise the animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Silver/Silver chloride electrode</td>
			<td style="width:195px;">CH Instruments</td>
			<td style="width:179px;">CHI111</td>
			<td>Used for testing the electrode in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Platinum electrode</td>
			<td style="width:195px;">CH Instruments</td>
			<td style="width:179px;">MW4130</td>
			<td>Used for testing the electrode in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Motorized microdrive</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:179px;">DR1000</td>
			<td>To control the electrode array position during surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Enzymatic cleaner</td>
			<td style="width:195px;">Advanced Medical Optics</td>
			<td style="width:179px;">Ultrazyme</td>
			<td>Cleans the protein off the electrode array after implantation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Acoustic enclosure</td>
			<td style="width:195px;">TMC Ametek</td>
			<td style="width:179px;">83-501</td>
			<td>Isolates the animal from acoustic and electrical noise</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Stereotaxic frame</td>
			<td style="width:195px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:179px;">1430</td>
			<td>Secures and positions the animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:195px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:179px;">ATC1000</td>
			<td>Controls the animal temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Bone drill</td>
			<td style="width:195px;">KaVo Dental</td>
			<td style="width:179px;">K5Plus</td>
			<td>Used to perform the craniectomy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Aspirator</td>
			<td style="width:195px;">Flaem</td>
			<td style="width:179px;">Suction pro</td>
			<td>Used to perform the craniectomy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for systematic electrochemical and electrophysiological evaluation of neural recording electrodes

חומרים ועיצובים לשתלים עצביים חדשים הם בדרך כלל נבדקו בנפרד, עם הפגנה של ביצועים, אך ללא התייחסות למאפייני שתל אחרים. זה מונע בחירה רציונלית של שתל מסוים כאופטימלי עבור יישום מסוים והפיתוח של חומרים חדשים המבוססים על הפרמטרים של ביצועים הקריטיים ביותר. מאמר זה עוסק בפיתוח פרוטוקול במבחנה בבדיקת vivo של אלקטרודות הקלטה עצביות. פרמטרים מומלצים לבדיקות אלקטרו ואלקטרו מתועדים עם השלבים העיקריים ובעיות פוטנציאליות שנדונו. שיטה זו מבטלת או מצמצמת את ההשפעה של הרבה שגיאות שיטתיות הווה בin vivo פרדיגמות בדיקות פשוטות יותר, וריאציות במיוחד במרחק אלקטרודה / נוירון ובין מודלים של בעלי החיים. התוצאה היא מתאם חזק בין קריטי במבחנה בתגובות vivo, כגון עכבה וsiיחס gnal לרעש. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם לבדיקת חומרי האלקטרודה אחרים ועיצובים. ניתן להרחיב במבחנה הטכניקות לכל שיטה הרסנית אחרת כדי לקבוע מדדי ביצוע חשובים נוסף. העקרונות המשמשים לגישה הניתוחית במסלול השמיעה יכולים גם להיות שונה כדי אזורים עצביים אחרים או רקמה.

מערך אלקטרודות טיפוסי המשמש לפרוטוקול ניסוי זה מוצג באיור 1. ישנן 32 אלקטרודות אירידיום ב -4 באנקס עם 413 μ מ &#39;2 באזור גיאומטרי נומינלי ומגרש μ מ&#39; 200. כל אלקטרודה שנייה על המערך כבר מצופה באחת מארבעה ציפוי האלקטרודה שונה, שכותרתו 1-4. חומרי הציפוי...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes at JoVE.com

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

שיטה לאלקטרוכימי שיטתי ואלקטרו הערכה של אלקטרודות הקלטה עצביות

ציפוי האלקטרודה שונה משפיע על ביצועי הקלטה עצביים דרך שינויים במאפיינים אלקטרוכימיים, כימיים ומכאניים. השוואה של אלקטרודות במבחנה היא פשוטה יחסית, עם זאת השוואה של תגובת in vivo היא מסובכת בדרך כלל על ידי שינויים במרחק אלקטרודה / נוירון ובין בעלי החיים. מאמר זה מספק שיטה חזקה כדי להשוות אלקטרודות הקלטה עצביות.

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

השרשה כירורגית של אלקטרודות עצביות כרוניות להקלטת פעילות יחידה אחת אותות Electrocorticographic

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

הכנת עכבר ער להקלטת תגובות עצביות והזרקת קליעים נותבים

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

הקלטה אופטית של פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל<em&gt; בחי</em&gt; מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

הקלטת אלקטרו מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Labellar טעם Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...