Name: reverse yeast two-hybrid system to identify mammalian nuclear receptor residues that interact with ligands and/or antagonists
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) concede CA127231 e The Damon Runyon Premio Fondazione Clinical Investigator (CI 1502) (SM). Vorremmo ringraziare il professor Zdenek Dvorak da Palacky Università di Olomouc, Repubblica Ceca per i suoi utili intuizioni che parlano di portabilità di questa tecnica per la loro istituzione e la standardizzazione del protocollo.

1. Costruzione di PXR e SRC-1 Fusioni in vettori di lievito <ol><li> Amplificazione PCR di Human PXR LBD (107-434 amminoacidi) e Human SRC-1 a figura intera (1-1401 amminoacidi). <ol><li> Utilizzare pSG5-hPXR plasmide 8 come modello PXR LBD, utilizzare plasmide pCMX-SRC1 come SRC-1 modelli. </li><li> Thaw PCR SuperMix, i modelli di DNA e primer (vedi Materiali), tenerli su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 0,25 mg / template DNA microlitri 1 ml, 10 mM coppie di primer 2 microlitri ciascuno, PCR SuperMix 45 ml ...

<ol>
	<li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway.">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li><li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor.">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li><li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+'Jekyll+and+Hyde'+Nature+of+PXR:+The+Case+for+Discovering+Antagonists.">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li><li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response.">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li><li>Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PXR+antagonists+and+implications+for+drug+metabolism.">PXR antagonists and implications for drug metabolism.</a> Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Yeast-Based+Strategy+Unveils+Antagonist+Binding+Regions+on+the+Nuclear+Xenobiotic+Receptor+PXR.">Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR.</a> J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).</li><li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system.">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li><li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine/threonine+kinase+Raf.">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74 (1), 205-214 (1993).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phytoestrogen+coumestrol+is+a+naturally+occurring+antagonist+of+the+human+pregnane+X+receptor.">The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor.</a> Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).</li><li>Kalpana, G. V., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+homomeric+interactions+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+using+the+yeast+two-hybrid+system.">Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).</li><li>Hamdi, A., Colas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+methods+and+their+applications+in+drug+discovery.">Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery.</a> TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+two-hybrid+system+based+on+adenylate+cyclase+reconstitution+in+Escherichia+coli.">The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli.</a> Methods. 58 (4), 325-334 (2012).</li><li>Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+and+optimization+of+yeast+two-hybrid+systems.">A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems.</a> Methods. 58 (4), 317-324 (2012).</li><li>Albers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+yeast+two-hybrid+screening+for+nuclear+receptor-interacting+proteins.">Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins.</a> Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).</li><li>Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+role+of+the+orphan+nuclear+receptor+SXR+(steroid+and+xenobiotic+receptor)+in+the+mechanism+of+CYP3A4+inhibition+by+xenobiotics.">Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics.</a> J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+drug+metabolism+by+blocking+the+activation+of+nuclear+receptors+by+ketoconazole.">Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole.</a> Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+pregnenolone+X-+receptor+is+a+target+for+ketoconazole+and+Its+analogs.">Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs.</a> Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).</li><li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+agents:+mode+of+action,+mechanisms+of+resistance,+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance.">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li><li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+multidrug+resistance+pump,+Pdr5p,+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li><li>White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+cellular,+and+molecular+factors+that+contribute+to+antifungal+drug+resistance.">Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).</li><li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+peptides,+proteins,+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets.">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li><li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK.">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li></ol>

Nel nostro test Y2H modificata, abbiamo identificato residui importanti per le interazioni ketoconazolo su PXR 6. Dal SRC-1 è un coactivator (ed è stato clonato nel vettore pGADNot), abbiamo provato anche se SRC-1 potrebbe attivare l&#39;espressione lacZ quando clonato nel sistema vettore PSH e se questo cambierebbe il profilo di attivazione e / o influenzare il leakiness di il lievito saggio del doppio ibrido. Utilizzando i nostri plasmidi ridisegnati abbiamo effettuato test di due ibride in ERG3 ...

Il lievito due ibridi (Y2H) saggio è ampiamente utilizzato per rilevare le interazioni proteina-proteina e più recentemente per la scoperta di nuove piccole molecole che interrompono proteina-proteina complessi di interazione 7, 8, 9, 10, 11. Tuttavia, gli approcci convenzionali di questo test, utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci o di &quot;hits&quot;, non consentono per il rilevamento di residui di interazione allosterici di prodotti chimici composti all&#39;interno di superfici proteina-proteina, che, quando alterati ancora interagire e consentire l&#39;interrogatorio dei residui alterati 11 . Infatti, tale metodo (s), se possibile sviluppare, consentirebbe un sistema di lievito trattabili per la valutazione ad alta velocità di residui di interazione allosterici critiche per l&#39;interazione proteina-proteina perturbazione. Nel contesto di scoperta di farmaci, il modo più diretto per stabilire l&#39;interazione dei composti con proteine ​​comporterebbe determinazione strutturale (es cristallizzazione del complesso proteina-inibitore). Questi metodi sono cumbersome, utilizzare le risorse elaborate e non è tecnicamente possibile effettuare studi strutturali su tutte le proteine. Sistemi di screening di stupefacenti genetica trattabili sono state stabilite nei batteri 1, 2 e altri sistemi modello, come mammiferi two-hybrid. Tuttavia, questi sistemi devono ottimizzazione e sistemi alternativi come Y2H sono ancora i più testato nella scoperta di farmaci. Esistono limitazioni che includono scarsa sensibilità e affidabilità delle interazioni con metodi singolari 13, tuttavia, un singolo test Y2H può essere modificato per rispondere a domande specifiche relative ai residui di interazione. Nel campo della ricerca recettore nucleare, Y2H è stato usato per definire proteine ​​interagenti 14, tuttavia, queste interazioni proteina sono state raramente utilizzata per definire la natura in cui ligandi / antagonisti interagiscono con complessi recettore-proteine ​​nucleari. Così, il nostro laboratorio concentrato sforzi sulla definizione di un metodo, in particolare per le proteine ​​recettori che non sonofacilmente suscettibili di proteomica metodi basati, che sarebbe dissotterrare romanzo ligando / antagonista interagire residui utilizzando un Y2H basato piattaforma di scoperta inverso. Sulla base della nostra precedente scoperta che il ketoconazolo interrompe PXR e il suo attivatore SRC-1, abbiamo sviluppato un nuovo sistema Y2H che ci permettono di definire e interrogare ketoconazolo interagire residui sulla PXR 6 inversa. Il nostro metodo si basa sulle proprietà della proteina GAL4 lievito che consiste di domini separabili responsabili dell&#39;attivazione di legame al DNA e trascrizionale. La proteina PXR LBD è espressa come una fusione al dominio LexA DNA-binding (DNA-BD), mentre le lunghe co-attivatori SRC-1 (coactivator recettore steroide 1) proteine ​​sono espresse come fusioni al dominio di attivazione GAL4 (AD ). Interazione tra PXR e SRC-1 proteine ​​di fusione porta all&#39;attivazione trascrizionale di GAL4 siti di legame contenenti gene reporter β-Lac Z che viene integrato nel genom lievitoe. Ketoconazolo, un antagonista PXR, interrompe PXR e SRC-1 interazione 15, 16, 17 e si può rilevare l&#39;interazione di PXR e SRC-1 in presenza o assenza di ketoconazolo dopo colorazione colonie su filtri per l&#39;attività X-gal. Il principio di Y2H è illustrato in Figura 1 e la procedura sperimentale è riassunto in Figura 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain CTY10-5d erg3&#916;/erg11&#916;</td>
			<td>Our lab</td>
			<td></td>
			<td>CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3&#916;/erg11&#916;) genes6 .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Growth Medium</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>630409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>4250-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONPG (o-Nitrophenyl &#914;-D- Galactopyranoside).</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (LB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml)</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>156-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% PEG-3350 solution, filter-sterilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10402091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>PXR LBD forward primer for pSH2-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>PXR LBD reverse primer for pSH2-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>SRC-1 forward primer for pGADNOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>SRC-1 reverse primer for pGADNOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR Supermix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11306-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0189</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse yeast two-hybrid system to identify mammalian nuclear receptor residues that interact with ligands and/or antagonists

Come regolatore critico del metabolismo dei farmaci e infiammazione, Pregnane X Receptor (PXR), svolge un ruolo importante nella patofisiologia collegamento metabolismo e infiammazione (es. steatosi epatica) 1,2. C&#39;è stato molto progresso per l&#39;identificazione di ligandi agonisti a PXR, tuttavia, ci sono le descrizioni limitate di antagonisti drug-like e dei loro siti di legame su PXR 3,4,5. Una barriera critica è l&#39;incapacità di purificare efficientemente proteina intera per studi strutturali con antagonisti nonostante PXR è stato clonato e caratterizzato nel 1998. Il nostro laboratorio ha sviluppato un romanzo di lievito ad alta velocità basata saggio del doppio ibrido per definire un antagonista, ketoconazolo di residui vincolante per PXR 6. Il nostro metodo prevede la creazione di librerie mutazionali che salvare l&#39;effetto delle singole mutazioni sulla superficie AF-2 di PXR previsto per interagire con ketoconazolo. Rescue o seco &quot;guadagno di funzione&quot;nd mutazioni possono essere fatte in modo tale che le conclusioni riguardanti l&#39;interazione genetica di ketoconazolo e il residuo di superficie (s) on PXR sono fattibili. Così, abbiamo sviluppato un elevato throughput two-hybrid schermo lievito di mutanti PXR che interagiscono con il suo coactivator, SRC-1. Usando questo approccio, in cui il lievito è stato modificato per accogliere lo studio del farmaco antifungino, ketoconazolo, potremmo dimostrare mutazioni specifiche su PXR arricchiti in cloni incapaci di legarsi al ketoconazolo. Con logica inversa, possiamo concludere che i residui originali siano residui interazione diretta con ketoconazolo. Questo test rappresenta un romanzo, test genetico trattabili allo schermo per antagonista siti di legame sulle superfici del recettore nucleare. Questa analisi può essere applicata a qualsiasi farmaco indipendentemente dal suo potenziale citotossico di lievito e di proteina cellulare (s) che non può essere studiata utilizzando biologia strutturale standard o metodi basati proteomica. Potenziali insidie ​​comprendono l&#39;interpretazione dei dati (metodi complementari utile), relizione sul metodo unico Y2H, esperienza nella gestione di lievito o l&#39;esecuzione di lievito saggi di due ibridi, e l&#39;ottimizzazione del dosaggio.

Noi eseguito un test per vedere se potevamo rilevare una lettura colorimetrica dell&#39;associazione di PXR e del recettore steroide coactivator-1 (SRC-1). Dato che il lievito ha una significativa produzione di sterolo, è stato precedentemente dimostrato che l&#39;espressione lacZ nel lievito può essere indotta senza la necessità di ulteriori ligando esogeno. Abbiamo trovato che l&#39;espressione lacZ (colonie blu) è anche indotto nel ceppo di lievito trasformato con PXR e SRC-1, tuttavia, non vi è alcuna induzione...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists at JoVE.com

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Ketoconazolo lega e antagonizza Pregnane X Receptor (PXR) attivazione. Di lievito di alta schermi di throughput di mutanti PXR definiscono una regione unica per l&#39;associazione ketoconazolo. Questo metodo genetico a base di lievito scopre interazioni recettore nucleare nuovi con leganti che associano con siti di legame di superficie.

Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Research

JoVE Journal

Biology

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomica per identificare proteine ​​che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Ricerca

Biologia

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Modificato lievito-sistema del doppio ibrido per identificare proteine ​​che interagiscono con il fattore di crescita progranulina

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Un'analisi di citometria-basata di flusso per identificare i composti che interrompono il grippaggio del Ligand di Chemokine CXC fluorescente etichettati 12 al recettore di chemochine CXC 4