Name: reverse yeast two-hybrid system to identify mammalian nuclear receptor residues that interact with ligands and/or antagonists
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists at JoVE.com

この作品は、衛生研究所（NIH）の国立研究所によってサポートされていましたCA127231と（SM）のデイモンラニヨン財団臨床研究者賞（CI 1502）を付与します。我々は彼らの機関やプロトコルの標準化へのこの技術の移植性を議論に彼の有用な洞察のためパラツキー大学オロモウツ、チェコ共和国からの教授ズデニェクドヴォルザークに感謝したいと思います。

1。酵母ベクターにおけるPXRとSRC-1融合の構築<ol><li>ヒトPXR LBD（107から434アミノ酸）およびヒトSRC-1完全長（アミノ酸1から1401）のPCR増幅。 <ol><li> SRC-1テンプレートとしてをpCMX-SRC1プラスミドを使用し、PXR LBDテンプレートとしてのpSG5-hPXRプラスミド8を使用してください。 </li><li>雪解けのPCRのSuperMix、DNAテンプレートとプライマーは（材料を参照）、氷上で保管してください。 </li><li> ...

<ol>
	<li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway.">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li><li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor.">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li><li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+peptides,+proteins,+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets.">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li><li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK.">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li></ol>

私たちの修正Y2Hアッセイでは、PXR 6上のケトコナゾールとの相互作用に重要な残基を同定した。 SRC-1はコアクチベーターである（及びpGADNotベクターにクローニングした）ので、我々はまた、SRC-1は、これが活性化プロフィールを変更および/または漏出性に影響を与えるかどうかをPSHベクター系にクローン化されたときにla​​cZ発現を活性化し得るかどうかを試験した酵母ツーハイブ?...

酵母ツーハイブリッド（Y2H）アッセイが広くタンパク質-タンパク質相互作用を発見するために使用され、より最近では、タンパク質-タンパク質相互作用複合体7、図8、図9、図10、図11を破壊する新規な小分子の発見のために。しかし、このアッセイの従来のアプローチは、創薬または「ヒット」のために使用、改変された時にはまだ相互作用し、改変された残基11の尋問を可能にすること、タンパク質-タンパク質表面内の化学薬品化合物のアロステリック相互作用残基の検出を可能にしない。実際に、このような方法（単数または複数）は、開発することが可能であれば、タンパク質 - タンパク質相互作用の破壊のための重要なアロステリック相互作用残基のハイスループット評価に扱いやすい酵母系を可能にする。薬物発見の文脈において、タンパク質と化合物の相互作用を確立するための最も直接的な方法は、構造決定（タンパク質-阻害剤複合体、例えば crystalization）を含むであろう。これらのメソッドは中出しですbersome、精巧なリソースを使用し、それはすべてのタンパク質上の構造研究を行うことは技術的に実現不可能である。 扱いやすい遺伝的薬剤スクリーニング系は、細菌、1,2および哺乳動物ツーハイブリッドなどの他のモデル系において確立されている。しかしながら、これらのシステムは、Y2Hのような最適化お​​よび代替システムがまだほとんどの薬物発見で試験する必要がある。乏しい感度および特異法13を用いて相互作用の信頼性を含む限界があるが、単一のY2Hアッセイは、相互作用残基に関する特定の質問に答えるように改変することができる。核内受容体研究の分野において、Y2Hは、相互作用タンパク質14を定義するために使用されてきたが、これらのタンパク質相互作用はほとんど/アンタゴニストは、核受容体-タンパク質複合体と相互作用するリガンドた性質を定義するために使用されていない。したがって、我々の研究室では、特にありません受容体タンパク質のために、メソッドを定義することに力を注い逆Y2Hベースの検出プラットフォームを使用して残留物を相互作用新規リガンド/アンタゴニストを発掘だろ基づく方法を、プロテオミクスに容易に適用できる。 ケトコナゾールはPXRとその活性化因子SRC-1を破壊という我々の以前の知見に基づいて、我々は小説はPXR 6にケトコナゾール作用する残基を定義して、質問するために私達を可能にするY2H系を逆に開発しました。我々の方法は、DNA結合および転写活性化に関与する分離可能なドメインからなる酵母GAL4タンパク質の特性に基づく。タンパク質はGAL4活性化ドメインとの融合体として発現される完全長クチベーターSRC-1（ステロイド受容体コアクチベーター1）しながら、PXR LBDタンパク質はAD（LexAのDNA結合ドメイン（DNA-BD）との融合体として発現される）。 PXR及びSRC-1融合タンパク質間の相互作用は、酵母genomに統合されたレポーター遺伝子β-LacリZを含有するGAL4結合部位の転写活性化をもたらすE。ケトコナゾール、PXRアンタゴニストは、PXR及びSRC-1の相互作用15、16、17を破壊し、我々はX-gal活性のためのフィルター上のコロニーを染色した後、ケトコナゾールの存在下又は非存在下でPXR及びSRC-1との相互作用を検出することができる。 Y2Hの原理は、図1に示されており、実験手順を図2にまとめる。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain CTY10-5d erg3&#916;/erg11&#916;</td>
			<td>Our lab</td>
			<td></td>
			<td>CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3&#916;/erg11&#916;) genes6 .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Growth Medium</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>630409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>4250-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONPG (o-Nitrophenyl &#914;-D- Galactopyranoside).</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (LB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml)</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>156-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% PEG-3350 solution, filter-sterilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10402091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>PXR LBD forward primer for pSH2-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>PXR LBD reverse primer for pSH2-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>SRC-1 forward primer for pGADNOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>SRC-1 reverse primer for pGADNOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR Supermix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11306-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0189</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse yeast two-hybrid system to identify mammalian nuclear receptor residues that interact with ligands and/or antagonists

薬物代謝および炎症の重要な調節因子として、プレグナンX受容体（PXR）は、代謝、炎症（ 例えば脂肪肝） の1,2を結ぶ疾患の病態生理に重要な役割を果たしている。 PXRのアゴニストリガンドの同定に多くの進歩があったが、薬物様拮抗薬およびPXR 3,4,5上のそれらの結合部位の限られた記述があります。重大な障壁を効率的PXRは1998年にクローニングされ、特徴付けられたという事実にもかかわらず、拮抗薬との構造の研究のために、完全長のタンパク質を精製することができないことであった。当研究室では、PXR 6に結合残基、アンタゴニスト、ケトコナゾールのを定義するのに基づく新規のハイスループット酵母ツーハイブリッドアッセイを開発しました。我々の方法は、ケトコナゾールと対話することが期待PXRのAF-2表面上の単一変異の効果を救うだろ突然変異のライブラリを作成する必要があります。救助または「機能獲得型」セコndは突然変異はPXRにケトコナゾールの遺伝的相互作用および表面残基（複数可）に関する結論が実現可能であるようにすることができる。従って、我々はそのコアクチベーター、SRC-1との相互作用PXR変異体の高スループットツーハイブリッド酵母画面を開発しました。酵母は抗真菌薬、ケトコナゾールの研究に対応するように変更されたこのアプローチを、使用して、我々は、ケトコナゾールに結合することができないのクローンが濃縮されたPXRに特定の変異を実証できた。逆論理によって、我々は、元の残基はケトコナゾールとの直接的な相互作用残基であると結論付けている。このアッセイは、核内受容体表面上の結合部位アンタゴニストをスクリーニングするための新規な、扱いやすい遺伝的アッセイを表す。このアッセイは、酵母、ならびに標準的な構造生物又はプロテオミクスベースの方法を使用して研究することができない細胞タンパク質（単数または複数）に関係なく、その細胞傷害能の任意の薬物に適用することができる。潜在的な落とし穴は、データの解釈（相補メソッド便利）、信頼を含めるシングルY2H法、酵母を取り扱うまたは酵母ツーハイブリッドアッセイを実施する専門知識、およびアッセイの最適化にある低インピーダンス。

我々は、PXRとステロイド受容体コアクチベーター1（SRC-1）の関連性の比色読み取りを検出できるかどうかを確認するためにアッセイを行った。酵母は有意なステロール生を有するので、予め酵母におけるlacZ発現は、追加の外因性リガンドを必要とせずに誘導することができることが示されている。私たちは、lacZ発現（青色コロニー）もPXRとSRC-1で形質転換された酵母株が誘導されることがわ...

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Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

ケトコナゾールに結合し、プレグナンX受容体（PXR）の活性化に拮抗する。 PXR変異体の酵母ハイスループットスクリーニングは、ケトコナゾールが結合するための独自の領域を規定する。この酵母ベースの遺伝的方法は、表面結合部位と会合したリガンドを有する新規な核内受容体相互作用を検出します。

相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Research

JoVE Journal

Biology

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

リシン毒素チェーン (RTA) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...