Name: reverse yeast two-hybrid system to identify mammalian nuclear receptor residues that interact with ligands and/or antagonists
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья (NIH) Гранты CA127231 и Дэймон Руньон Foundation Award клинический исследователь (CI 1502) (на SM). Мы хотели бы поблагодарить профессора Зденек Дворак из Палацкого университета Оломоуц, Чехия за его полезные проникновения в обсуждении переносимости этой методики их организации и стандартизации протокола.

1. Строительство ПРИ и SRC-1 Fusions в дрожжевые векторы <ol><li> ПЦР-амплификации человеческого PXR ДТЛ (107-434 аминокислот) и человека SRC-1 полной длины (1-1401 аминокислот). <ol><li> Используйте pSG5-hPXR плазмиды 8 как ПРИ LBD шаблона, используйте PCMX-SRC1 плазмиды как SRC-1 шаблонов. </li><li> Оттепель ПЦР SuperMix, ДНК...

<ol>
	<li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway.">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li><li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor.">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li><li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+'Jekyll+and+Hyde'+Nature+of+PXR:+The+Case+for+Discovering+Antagonists.">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li><li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response.">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li><li>Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PXR+antagonists+and+implications+for+drug+metabolism.">PXR antagonists and implications for drug metabolism.</a> Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Yeast-Based+Strategy+Unveils+Antagonist+Binding+Regions+on+the+Nuclear+Xenobiotic+Receptor+PXR.">Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR.</a> J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).</li><li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system.">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li><li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine/threonine+kinase+Raf.">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74 (1), 205-214 (1993).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phytoestrogen+coumestrol+is+a+naturally+occurring+antagonist+of+the+human+pregnane+X+receptor.">The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor.</a> Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).</li><li>Kalpana, G. V., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+homomeric+interactions+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+using+the+yeast+two-hybrid+system.">Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).</li><li>Hamdi, A., Colas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+methods+and+their+applications+in+drug+discovery.">Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery.</a> TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+two-hybrid+system+based+on+adenylate+cyclase+reconstitution+in+Escherichia+coli.">The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli.</a> Methods. 58 (4), 325-334 (2012).</li><li>Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+and+optimization+of+yeast+two-hybrid+systems.">A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems.</a> Methods. 58 (4), 317-324 (2012).</li><li>Albers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+yeast+two-hybrid+screening+for+nuclear+receptor-interacting+proteins.">Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins.</a> Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).</li><li>Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+role+of+the+orphan+nuclear+receptor+SXR+(steroid+and+xenobiotic+receptor)+in+the+mechanism+of+CYP3A4+inhibition+by+xenobiotics.">Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics.</a> J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+drug+metabolism+by+blocking+the+activation+of+nuclear+receptors+by+ketoconazole.">Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole.</a> Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+pregnenolone+X-+receptor+is+a+target+for+ketoconazole+and+Its+analogs.">Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs.</a> Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).</li><li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+agents:+mode+of+action,+mechanisms+of+resistance,+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance.">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li><li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+multidrug+resistance+pump,+Pdr5p,+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li><li>White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+cellular,+and+molecular+factors+that+contribute+to+antifungal+drug+resistance.">Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).</li><li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+peptides,+proteins,+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets.">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li><li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK.">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li></ol>

В нашем модифицированном Y2H анализа, мы выявили важные остатки для кетоконазол взаимодействий на ПРИ 6. Поскольку SRC-1 представляет собой коактиватор (и клонировали в вектор pGADNot), мы также протестировали, может ли SRC-1 активировать экспрессию LacZ, когда клонировали в векторе системы P...

Дрожжи двугибридная (Y2H) анализ широко используется, чтобы обнаружить белок-белковых взаимодействий и совсем недавно для открытия новых малых молекул, которые разрушают белок-белковых комплексов взаимодействия 7, 8, 9, 10, 11. Однако обычные подходы этом анализе используется для лекарственных препаратов или &quot;попаданий&quot;, не позволяют для обнаружения аллостерических остатков химических веществ взаимодействия соединений в белок-белковых поверхности, что, когда изменяется еще взаимодействовать и позволяют опроса измененных остатков 11 . В самом деле, такой способ (ы), если это возможно, чтобы развиваться, позволило бы сговорчивым систему дрожжей для оценки высокой пропускной аллостерических остатков взаимодействия критических для нарушения взаимодействия белок-белок. В контексте открытия новых лекарств, наиболее прямой путь для установления взаимодействия соединений с белками предполагает структурную определение (например Кристаллизация белок-ингибитор комплекса). Эти методы дипломbersome, использовать сложные ресурсы, и это технически невозможно выполнить структурные исследования по каждой белка. Сговорчивым системы генетического скрининга наркотиков были созданы в бактериях 1, 2 и других модельных систем, как млекопитающих двугибридная. Тем не менее, эти системы должны оптимизацию и альтернативные системы, такие как Y2H-прежнему являются наиболее протестирован в лекарственных препаратах. Существуют ограничения, которые включают слабую чувствительность и надежность взаимодействия с использованием особых методов 13, однако, один Y2H анализ может быть изменен, чтобы ответить на конкретные вопросы, касающиеся остатков взаимодействия. В области исследований ядерной рецепторов, Y2H был использован для определения взаимодействующих белков 14, однако, эти белковые взаимодействия редко используется для определения характера, в которых лиганды / антагонисты взаимодействуют с ядерными рецептор-белковых комплексов. Таким образом, наша лаборатория сосредоточены усилия на определении метода, особенно для белков-рецепторов, которые нелегко поддаются протеомные методы, основанные, что бы раскопать роман лиганд / антагониста, взаимодействующих остатков с использованием обратной Y2H основе платформу открытия. Основываясь на нашем предыдущем открытии, что кетоконазол нарушает PXR и его активатор SRC-1, мы разработали роман обратного Y2H систему, которая позволит нам определить и допросить кетоконазол взаимодействующих остатков на ПРИ 6. Наша методика основана на свойствах белка GAL4 дрожжей, который состоит из отделимых областей, отвечающих за активацию ДНК-связывающего и транскрипции. Белок PXR LBD выражается в виде гибрида к LexA ДНК-связывающий домен (ДНК-BD), в то время как по всей длине Соактиваторы SRC-1 (стероид коактиватор рецептор 1) белки экспрессируются в виде слитых с доменом активации GAL4 (AD ). Взаимодействие между ПРИ и SRC-1 слитых белков приводит к транскрипционной активации GAL4-связывающие сайты, содержащие репортерный ген β-Lac Z, который интегрирован в геноме дрожжейэ. Кетоконазол, антагонист PXR, нарушает PXR и SRC-1 взаимодействие 15, 16, 17, и мы можем детектировать взаимодействие ПРИ и SRC-1 в присутствии или в отсутствие кетоконазол после окрашивания колонии на фильтров для X-гал активности. Принцип Y2H иллюстрируется на рисунке 1 и экспериментальная процедура показаны на рисунке 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain CTY10-5d erg3&#916;/erg11&#916;</td>
			<td>Our lab</td>
			<td></td>
			<td>CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3&#916;/erg11&#916;) genes6 .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Growth Medium</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>630409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>4250-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONPG (o-Nitrophenyl &#914;-D- Galactopyranoside).</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (LB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml)</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>156-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% PEG-3350 solution, filter-sterilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10402091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>PXR LBD forward primer for pSH2-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>PXR LBD reverse primer for pSH2-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>SRC-1 forward primer for pGADNOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>SRC-1 reverse primer for pGADNOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR Supermix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11306-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0189</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse yeast two-hybrid system to identify mammalian nuclear receptor residues that interact with ligands and/or antagonists

В критической регулятора метаболизма лекарств и воспаления, прегнан Х-рецептора (ПРИ), играет важную роль в патофизиологии болезни обмена веществ, связывающую и воспаление (например, стеатоза печени) 1,2. Там был достигнут значительный прогресс в идентификации агонистов лигандов для ПРИ, однако, есть ограниченные описания наркотиками как антагонистов и их сайтов связывания на PXR 3,4,5. Критический барьер была неспособность эффективно очистить полнометражный белка для структурных исследований с антагонистами, несмотря на то, что ПРИ клонировали и характеризуется в 1998 году. Наша лаборатория разработала новую высокую пропускную дрожжи основе двугибридная анализа определить антагонист, кетоконазол х, связывания остатков на ПРИ 6. Наш метод включает в себя создание мутационные библиотеки, которые бы спасти эффект одиночных мутаций на AF-2 поверхности ПРИ ожидается, взаимодействовать с кетоконазол. Спасение или «усиления из-функции&quot; вторй мутации могут быть сделаны таким образом, что выводы о генетическом взаимодействии кетоконазол и поверхностного остатка (ов) на ПРИ осуществимы. Таким образом, мы разработали высокую пропускную двухгибридного дрожжей экран PXR мутантов, взаимодействующих с ее коактиватора, SRC-1. Используя этот подход, в которых дрожжи был изменен, чтобы приспособить изучение противогрибкового препарата, кетоконазол, мы могли бы продемонстрировать специфические мутации на ПРИ обогащенные клонов не могли связать с кетоконазол. По обратной логике, мы приходим к выводу, что первоначальные остатки являются прямыми остатки взаимодействия с кетоконазолом. Этот анализ представляет собой роман, послушный генетический анализ для скрининга антагонистов сайтов связывания на поверхности ядерного рецептора. Этот анализ может быть применен к любому препарату независимо от его цитотоксического потенциала для дрожжей, а также клеточного белка (ов), которые не могут быть изучены с помощью стандартного структурной биологии или протеомических на основе методов. Потенциальные ловушки включают интерпретацию данных (нетрадиционные методы полезны), надежAnce на одного метода Y2H, опыт в обращении с дрожжей или выполнение дрожжей двух гибридных анализов и оптимизации анализа.

Мы провели анализ, чтобы убедиться, что мы могли обнаружить колориметрического считывание ассоциации ПРИ и стероидного рецептора коактиватор-1 (SRC-1). Поскольку дрожжи имеет значительный производства стерола, это ранее было показано, что LacZ экспрессии в дрожжах могут быть вызваны без не...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists at JoVE.com

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Кетоконазол связывается и противодействует прегнановых X рецептор (ПРИ) активации. Дрожжи высокой пропускной экраны PXR мутантов определить уникальный регион для связывания кетоконазол. Этот генетический метод дрожжей на основе обнаруживает новые взаимодействия ядерных рецепторов с лигандами, которые связывают с поверхности участков связывания.

Реверс дрожжевой Два-гибридная система для идентификации Mammalian ядерного рецептора Остатки, которые взаимодействуют с лигандами и / или антагонистов

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Research

JoVE Journal

Biology

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Протеомики для идентификации белков Взаимодействие с P2X2 лиганд-Gated Каналы Катионит

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Сплит-Убиквитин основе дрожжей Мембрана два-Hybrid (МИФ) Система: Мощный инструмент для выявления белок-белковых взаимодействий

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Анализ мРНК ядерного Кинетика Экспорт в клетках млекопитающих по Микроинъекция

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Измененный Дрожжи-Two-гибридная система для идентификации белков Взаимодействие с фактор роста Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Нанозолото Маркировка из дрожжей эндосомных системы для Ультраструктурные Анализы

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Обнаружение эстрогенных лигандов в продуктах личной внимательности с использованием дрожжей эстроген экран оптимизирован для лаборатории обучения студентов

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Простой на основе флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов необходимых для рицин токсинному цепь (RTA) оборота дрожжей

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Потока на основе цитометрии проба для выявления соединений, которые нарушают Связывание лиганда дневно меченых КЭС хемокиновых 12 КЭС хемокиновых рецепторов 4