Name: reverse yeast two-hybrid system to identify mammalian nuclear receptor residues that interact with ligands and/or antagonists
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grants CA127231 och The Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award (CI 1502) (SM). Vi vill tacka professor Zdenek Dvorak från Palacky University Olomouc, Tjeckien för hans hjälp insikter diskutera överföra denna teknik till sin institution och standardisering av protokoll.

1. Konstruktion av PXR-och SRC-1 Fusioner i jästvektorer <ol><li> PCR-amplifiering av humant PXR LBD (107-434 aminosyror) och Human SRC-1 full längd (1-1401 aminosyror). <ol><li> Använd pSG5-hPXR plasmid 8 som PXR LBD mall, använd pCMX-SRC1 plasmid som SRC-1-mallar. </li><li> Tina PCR SuperMix, DNA-mallar och primers (se Material), hålla dem på is. </li><li> Addera 0,25 ug / ul DNA-mall 1 | il, 10 mM primerpar 2 | il vardera, PCR SuperMix 45 | il och tillsätt H2O att bringa totala volymen ...

<ol>
	<li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway.">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li><li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor.">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li><li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+'Jekyll+and+Hyde'+Nature+of+PXR:+The+Case+for+Discovering+Antagonists.">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li><li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response.">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li><li>Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PXR+antagonists+and+implications+for+drug+metabolism.">PXR antagonists and implications for drug metabolism.</a> Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Yeast-Based+Strategy+Unveils+Antagonist+Binding+Regions+on+the+Nuclear+Xenobiotic+Receptor+PXR.">Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR.</a> J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).</li><li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system.">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li><li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine/threonine+kinase+Raf.">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74 (1), 205-214 (1993).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phytoestrogen+coumestrol+is+a+naturally+occurring+antagonist+of+the+human+pregnane+X+receptor.">The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor.</a> Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).</li><li>Kalpana, G. V., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+homomeric+interactions+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+using+the+yeast+two-hybrid+system.">Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).</li><li>Hamdi, A., Colas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid+methods+and+their+applications+in+drug+discovery.">Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery.</a> TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).</li><li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+two-hybrid+system+based+on+adenylate+cyclase+reconstitution+in+Escherichia+coli.">The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli.</a> Methods. 58 (4), 325-334 (2012).</li><li>Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+and+optimization+of+yeast+two-hybrid+systems.">A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems.</a> Methods. 58 (4), 317-324 (2012).</li><li>Albers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+yeast+two-hybrid+screening+for+nuclear+receptor-interacting+proteins.">Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins.</a> Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).</li><li>Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+role+of+the+orphan+nuclear+receptor+SXR+(steroid+and+xenobiotic+receptor)+in+the+mechanism+of+CYP3A4+inhibition+by+xenobiotics.">Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics.</a> J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+drug+metabolism+by+blocking+the+activation+of+nuclear+receptors+by+ketoconazole.">Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole.</a> Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+pregnenolone+X-+receptor+is+a+target+for+ketoconazole+and+Its+analogs.">Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs.</a> Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).</li><li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+agents:+mode+of+action,+mechanisms+of+resistance,+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance.">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li><li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+multidrug+resistance+pump,+Pdr5p,+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li><li>White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+cellular,+and+molecular+factors+that+contribute+to+antifungal+drug+resistance.">Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).</li><li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+peptides,+proteins,+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets.">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li><li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK.">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li></ol>

I vår modifierade Y2H analys har vi identifierat viktiga rester för ketokonazol interaktioner på PXR 6. Eftersom SRC-1 är en coactivator (och klonades in i pGADNot vektorn), vi testade även om SRC-1 kan aktivera lacZ uttryck när klonad i PSH vektorsystem och om detta skulle förändra aktiveringsprofil och / eller påverka leakiness av jäst-två-hybridanalys. Med hjälp av våra omgjorda plasmider vi utförde två-hybrid analyser i erg3 Δ / ERG11 Δ jäst. Som tidigare, visar vi att ...

Jästen två-hybrid (Y2H)-analys används i stor utsträckning för att upptäcka protein-proteininteraktioner och mer nyligen för upptäckten av nya små molekyler som stör protein-proteininteraktion komplex 7, 8, 9, 10, 11. Men de konventionella metoder för denna analys, som används för läkemedelsforskning eller &quot;träffar&quot;, inte tillåter detektion av allosteriska interaktions rester av kemiska föreningar inom protein-proteinytor, att då förändras fortfarande samverka och tillåta förhör av de förändrade resterna 11 . I själva verket, en sådan metod (er), om möjligt att utveckla, skulle göra det möjligt för en lätthanterlig jäst-system för hög genomströmning bedömning av allosteriska interaktions rester kritiska för protein-proteininteraktion störningar. I samband med läkemedelsutveckling, skulle det mest direkta sättet att skapa interaktion av föreningar med proteiner involverar strukturbestämning (t ex kristallisation av protein-inhibitor-komplex). Dessa metoder är cumbersome, använd arbetade resurser och det är inte tekniskt möjligt att genomföra strukturella studier av varje protein. Lätthanterlig genetiska drogscreeningssystem har etablerats i bakterier 1, 2 och andra modellsystem som däggdjur två-hybrid. Dessa system behöver optimering och alternativa system som Y2H är fortfarande den mest testade i läkemedelsutveckling. Det finns begränsningar som inkluderar dålig känslighet och tillförlitlighet interaktioner använder singulära metoder 13 dock en enda Y2H analys kan modifieras för att svara på specifika frågor om interaktionsrester. På området nukleära receptorer forskning har Y2H använts för att definiera interagerande proteiner 14 dock dessa proteininteraktioner har sällan använts för att fastställa arten där ligander / antagonister interagerar med kärnreceptorproteinkomplex. Alltså, vårt laboratorium fokuserade ansträngningar på att definiera en metod, speciellt för receptorproteiner som intelätt mottaglig för proteomik baserade metoder, som skulle gräva nya ligand / antagonist samverkande rester med hjälp av en omvänd Y2H baserad upptäckt plattform. Baserat på vår tidigare bedömning att ketokonazol stör PXR och dess aktivator SRC-1, utvecklade vi en ny vända Y2H system som gör det möjligt för oss att definiera och förhöra ketokonazol samverkande rester på PXR 6. Vår metod är baserad på egenskaperna hos jäst GAL4-proteinet som består av separerbara domäner som ansvarar för DNA-bindning och transkriptionsaktivering. Den PXR LBD proteinet uttrycks som en fusion till den LexA DNA-bindande domänen (DNA-BD), medan fullängds samaktivatorer SRC-1 (steroid receptor coactivator 1) proteiner uttrycks som fusioner till GAL4-aktiveringsdomänen (AD ). Interaktion mellan PXR och SRC-1-fusionsproteiner leder till transkriptionell aktivering av GAL4-bindningsställen innehållande reportergen β-Lac Z som är integrerad i jäst Genomete. Ketokonazol, ett PXR antagonist, stör PXR och SRC-1 interaktion 15, 16, 17 och vi kan detektera interaktionen av PXR och SRC-1 i närvaro eller frånvaro av ketokonazol efter färgning kolonier på filtren för X-gal-aktivitet. Principen för Y2H illustreras i figur 1 och den experimentella proceduren sammanfattas i figur 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain CTY10-5d erg3&#916;/erg11&#916;</td>
			<td>Our lab</td>
			<td></td>
			<td>CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3&#916;/erg11&#916;) genes6 .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Growth Medium</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>630409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>4250-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ONPG (o-Nitrophenyl &#914;-D- Galactopyranoside).</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth (LB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml)</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>156-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% PEG-3350 solution, filter-sterilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10402091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>PXR LBD forward primer for pSH2-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>PXR LBD reverse primer for pSH2-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>SRC-1 forward primer for pGADNOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3&#39;</td>
			<td>our lab</td>
			<td></td>
			<td>SRC-1 reverse primer for pGADNOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR Supermix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11306-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>our lab</td>
			<td>R0189</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse yeast two-hybrid system to identify mammalian nuclear receptor residues that interact with ligands and/or antagonists

Som en kritisk regulator av läkemedelsmetabolism och inflammation, pregnan X Receptor (PXR), spelar en viktig roll i sjukdoms patofysiologi bindnings metabolism och inflammation (leversteatos) 1,2. Det har skett stora framsteg i att identifiera agonistligander för PXR, men det finns begränsade beskrivningar av läkemedelsliknande antagonister och deras bindningsställen på PXR 3,4,5. En kritisk barriär har varit oförmågan att effektivt rena fullängds-protein för strukturella studier med antagonister trots att PXR klenades och karakteriserades 1998. Vårt laboratorium utvecklat en ny hög genomströmning jäst baserad två-hybrid analys för att definiera en antagonist, ketokonazol s, bindande rester på PXR 6. Vår metod innebär att skapa mutationsbibliotek som skulle rädda effekten av enkla mutationer på AF-2 yta PXR förväntas interagera med ketokonazol. Rescue eller &quot;gain-of-function&quot; second mutationer kan göras på så sätt att slutsatser avseende den genetiska interaktion av ketokonazol och ytan rest (er) på PXR är genomförbara. Därför utvecklade vi en hög genomströmning två-hybrid jäst skärm PXR mutanter som interagerar med sin coactivator, SRC-1. Med hjälp av denna metod, där jästen ändrades för att rymma studiet av den svampdödande läkemedel, ketokonazol, kunde vi påvisa specifika mutationer på PXR anrikas i kloner som inte kan binda till ketokonazol. Genom omvänd logik, drar vi slutsatsen att de ursprungliga rester är direkta interaktions rester med ketokonazol. Denna analys är en roman, foglig genetisk analys för att skärmen för antagonistbindningsställen på kärnreceptorytor. Denna analys skulle kunna tillämpas på alla läkemedel, oberoende av dess cytotoxiska potential att jäst såväl som till cellulärt protein (er) som inte kan studeras med användning av standard strukturell biologi eller proteomic baserade metoder. Potentiella fallgropar inkluderar tolkning av data (kompletterande metoder användbara), relining på enstaka Y2H metod, kompetens för att hantera jäst eller utför jäst två-hybrid analyser och analysoptimering.

Vi utförde en analys för att se om vi kunde upptäcka en kolorimetrisk avläsning av föreningen för PXR och steroidreceptor coactivator-1 (SRC-1). Eftersom jäst har betydande sterol produktion har det tidigare visats att lacZ-expression i jäst kan induceras utan behov av extra exogen ligand. Vi fann att lacZ-uttrycket (blå kolonier) också induceras i jäststam transformerad med PXR och SRC-1, men det finns ingen induktion av LacZ-expression (vita kolonier) i jäst transformerad med tomma vektorer, PXR eller SRC-...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists at JoVE.com

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Ketokonazol binder till och motverkar pregnanderivat X Receptor (PXR) aktivering. Jäst hög genomströmning skärmar PXR mutanter definierar en unik region för ketokonazol bindning. Denna jäst-baserad genetisk metod upptäcker nya nukleära receptorinteraktioner med ligander som associerar med ytan bindningsställen.

Omvänd jäst två-hybridsystemet för att identifiera Mammalian Nuclear Receptor Stoder som interagerar med ligander och / eller-antagonister

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Research

JoVE Journal

Biology

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomik för att identifiera proteiner Interagera med P2X2 ligandreglerade munikationsvägar

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-ubiquitin Baserat Membrane Jäst Två Hybrid (MYT) System: ett kraftfullt verktyg för att identifiera Protein-protein interaktioner

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Analys av mRNA Nuclear Export Kinetics i däggdjursceller genom mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Modifierad jäst-Two-Hybrid System för att identifiera proteiner Interagera med Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanoguld Märkning av jäst endosomal System för Ultra Analyser

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Att upptäcka östrogena ligander i personliga hygienprodukter använder en jäst östrogen skärmen optimerad för grundutbildning undervisning laboratoriet

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

En enkel fluorescens-baserade Reporter analysen identifiera cellulära komponenter krävs för Ricin Toxin en kedja (RTA) handel med jäst

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

En flöde flödescytometri-baserad analys identifiera föreningar som stör bindningen av Fluorescently-märkta CXC Chemokine Ligand 12 till CXC Chemokine Receptor 4