Name: sample drift correction following 4d confocal time-lapse imaging
Uploaded: 2014-04-12T22:35:00
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Nos gustaría dar las gracias a Gaby Martins y los organizadores del taller EMBO2010 3D Developmental Imaging donde comenzó este trabajo y todos los colaboradores de los proyectos de Fiyi y ImageJ.

1. 4D Time-lapse experimentos de imagen La configuración utilizada para la adquisición de la imagen serán diferentes dependiendo del equipo utilizado. La capacidad de la microscopía confocal para la sección ópticamente una muestra depende de un número de factores: la longitud de onda de excitación, el tamaño del agujero de alfiler, la apertura numérica del objetivo, el índice de refracción de la muestra y el medio en el que se incrusta la muestra. El tamaño del agujero de alfiler ...

<ol>
	<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li><li>Collins, T. 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Exp. (36), (2010).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish.">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li><li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li><li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome.">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li><li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion.">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), 3145-3153 (2007).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li></ol>

Nuestra capacidad de utilizar el software de post-procesamiento para corregir la deriva de la muestra de los conjuntos de datos derivados de experimentos de microscopía de lapso de tiempo prolongados está restringida por una serie de factores. La capacidad de discernir la deriva frente a movimiento migratorio de una muestra depende de los marcadores celulares utilizados. Marcadores celulares que se expresan ampliamente, ya sea dentro de una muestra o no participan en eventos migratorias durante la adquisición de imá...

De formación de imágenes confocal es ampliamente utilizado en biología celular y del desarrollo de seguir los movimientos celulares y cambios en la morfología. La captura de una serie de secciones ópticas en diferentes planos focales permite la generación de un modelo tridimensional (3D) de una muestra, que luego se puede extender en cuatro-dimensiones (4D) mediante la creación de una serie de lapso de tiempo de conjuntos de datos 3D. La generación de bases de datos 4D permite la medición detallada de los movimientos celulares y comportamientos. En experimentos con lapso de tiempo a largo plazo, es común observar el movimiento de la muestra. Esto puede ser causado por ligeras imprecisiones en el control de la etapa de hardware y posiciones focales. Mientras que en otros casos, la deriva es un resultado de los movimientos inducidos por el crecimiento de la muestra o la flexibilidad dentro de los medios de montaje de la muestra. Existen métodos para compensar o limitar estos movimientos incluyendo mejoras en sistemas de enfoque de hardware y aumento de la rigidez del medio de montaje. Sin embargo, estos enfoques no pueden aplicarse en muchos casos debido a la s de formación de imágenesuesta obligada a proporcionar las condiciones adecuadas para el mantenimiento y crecimiento de las muestras. Soluciones de software de código abierto no existir para la corrección de movimiento en 2D con el tiempo, a través del uso de las StackReg y TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins en ImageJ o Fiji, pero éstos no pueden ser aplicado a conjuntos de datos 4D. Para corregir la deriva de la muestra se ha desarrollado un plug-in (deriva 3D correcta) para utilizar la plataforma de procesamiento de imágenes de código abierto, Fiji 1. Nuestro plug-in es capaz de realizar el registro de correlación de fase para corregir el movimiento que se produce como resultado de la deriva de la muestra en los experimentos de lapso de tiempo de tres dimensiones. Fase 6 de correlación es un método eficiente de cálculo para determinar la traducción entre imágenes. El plug-in se describe aquí utiliza la biblioteca fase de correlación desarrollada por Preibisch et al. 7. En experimentos de varios canales, el plug-in utiliza un canal a determine la corrección requerida. Esta corrección se aplica entonces a los canales adicionales resultantes en el registro de la base de datos 4D. En el sistema modelo de pez cebra es posible llevar a cabo de imagen de lapso de tiempo durante un período de muchas horas, o incluso varios días 8. Un método común para el montaje del pez cebra es la de insertar el embrión vivo anestesiado en agarosa de bajo punto de fusión (0,8-1,5%), lo que restringe su movimiento 9-11. Mientras que el movimiento se restringe el crecimiento de la muestra aún se produce, lo que resulta en las células dentro del campo de visión posición de cambio. Con el fin de seguir el movimiento de las células en el embrión es necesario para corregir primera para el movimiento de toda la muestra. Este protocolo fue desarrollado con especímenes de pez cebra, y se ha utilizado para el desarrollo de la imagen somite 12, pero puede ser aplicada a cualquier conjunto de datos confocal 4D.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Low gelling temperature agarose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9414-25G</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">0208-4-PO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable 3mL graduated</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Samco</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">212</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Polyethylene transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">9cm bacterial grade Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">632180</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing</td>
			<td style="width:71px;">Bola</td>
			<td style="width:119px;">S1815-04</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Zeiss LSM-710 Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">421452-9600-000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample drift correction following 4d confocal time-lapse imaging

La generación de cuatro dimensiones (4D) de datos confocal; que consiste en secuencias de imágenes en 3D a través del tiempo; proporciona una excelente metodología para capturar comportamientos celulares implicados en los procesos de desarrollo. La capacidad de rastrear y seguir los movimientos de células está limitado por los movimientos de la muestra que se producen debido a la deriva de la muestra o, en algunos casos, el crecimiento durante la adquisición de la imagen. Células de seguimiento en los conjuntos de datos afectados por la deriva y / o el crecimiento incorporarán estos movimientos en cualquier análisis de la posición de la célula. Esto puede resultar en el movimiento aparente de las estructuras estáticas dentro de la muestra. Por lo tanto antes de la célula de seguimiento, la deriva de la muestra debe ser corregida. Usando el código abierto de distribución de Fiji 1 de ImageJ 2,3 y las herramientas incorporadas LOCI 4, hemos desarrollado el 3D correcta deriva plug-in para eliminar el movimiento de la muestra errónea en los conjuntos de datos confocal. Este protocolo compensa con eficacia para la traducción de la muestra o alteraciones en po focalción mediante la utilización de correlación de fase que registrarse en cada punto de una de cuatro dimensiones de datos confocal, manteniendo la capacidad de visualizar y medir los movimientos celulares sobre experimentos con lapso de tiempo prolongados.

En el pez cebra en desarrollo, las células musculares rápidas funden en fibras multinucleadas de 19 horas después de la fertilización (20 - somite etapa) 13. Con el fin de visualizar el movimiento de los núcleos y la fusión de las células musculares que llevamos a cabo 4D de lapso de tiempo de formación de imágenes confocal utilizando una cepa transgénica que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de α-actina de músculo esquelético para etiquetar todo el múscu...

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Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Muestra de Corrección de la sincronización Tras 4D Confocal Time-lapse de imágenes

Time-lapse microscopía permite la visualización de los procesos de desarrollo. El crecimiento o la deriva de las muestras durante la adquisición de imágenes se reduce la capacidad de seguir y medir los movimientos de las células durante el desarrollo precisión. Se describe el uso de software de procesamiento de imagen de código abierto para corregir la deriva de tres dimensiones de la muestra con el tiempo.

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

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Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Investigación

Bioingeniería

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