Name: optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Vi takker Dr. Mickey Yang til redigering og kommentarer og Drs. Lei Zhang og Bo Peng for assistance. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab, Kontoret for Basic Energi Sciences i USA Department of Energy (Kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231), National Heart, Lung, og Blood Institute of National Institutes of Health (ingen . R01HL115153), og National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health (nej. R01GM104427).

1. Fremstilling af Frisk Negativ farveopløsning på 1% (w / v) <ol><li> Sæt 1 mg uranyl formiat (UF) pulver i glasflaske indeholdende 100 ml deioniseret vand i et mørkt rum eller boks. </li><li> Opløsningen omrøres O / N-ved stuetemperatur i et mørkt rum / kasse. Pak flasken med alufolie for at forhindre lys i at ramme løsningen. </li><li> Opløsningen filtreres forsigtigt gennem 0,2 um (porestørrelse filter) monteret på en 5 ml sprøjte. Den filtrerede opløsning blev opsamlet i flere aluminiumfolie dækket Falcon-rør. Filteret sprøjten skal også omviklet med aluminiumfolie for at forhindre udsættelse for lys. </li><li> Opløsningen filtreres igen gennem 0,02 um (porestørrelse) filter monteret på 1 ml sprøjte. Den filtrerede opløsning blev opsamlet og prøve i 2 ml hætteglas. De sprøjter og hætteglas dækkes med aluminiumfolie før brug. </li><li> Frys alikvote hætteglas anvender lang håndteres pincetter nedsænke hætteglas i en flydende nitrogen fyldt beholder straksefter at opløsningen blev filtreret. </li><li> Overfør frosne hætteglas i en -80 ° C fryser til opbevaring og fremtidig brug. </li></ol> 2. Udarbejdelse af negativ farvning Workstation og Inkubation Workstation <ol><li> Optøs et hætteglas med 1% UF opløsning i et vandbad indstillet på stuetemperatur. Sørg for, at aluminiumsfolie forbliver viklet rundt hætteglasset for at forhindre udsættelse for lys. </li><li> Opløsningen filtreres efter det er helt optøet ved hjælp af en aluminiumsfolie indpakket 1 ml sprøjte monteret med en 0,02 um filter. Saml den filtrerede opløsning i en ny aluminiumsfolie indpakket hætteglas, og placerede den på isen inde i en kasket dækket is boks venter for forbrug. </li><li> Lav opløsning plader ved finger skubbe en ~ 8 tomme lang Parafilm ark på overfladen af ​​en tom proteinkrystallisation plade. Det vil generere rækker af cirkulære plader med en diameter på ~ 5 mm. Lav 6 plader i hver række sted parafilmen pladerne på en overflade af fladtrykt is inde i en is indeholderare låg, som farvning arbejdsstation. </li><li> Pipette ~ 35 ul deioniseret vand på hver af venstre tre plader i hver række, og pipette ~ 35 ul filtreret UF løsning på højre tre plader i hver række. Dæk farvning arbejdsstation med et låg for at forhindre udsættelse for lys før farvning proteiner. </li><li> Forbered en EM gitter inkubation station ved at udfylde en tom kasse halvvejs med is, og levet ved siden af ​​en bøjle, der kan monteres på en understøtningsbasis. Anbring prøven pincet i bøjle, hvor pincetten tips er i nærheden isens overflade. Halvdelen dækker pincetten tips fra kassen læbe højde. En ideel is boks til at gøre en inkubationstid station ved hjælp af en tom pipettespidser beholder. </li></ol> 3. OpNS Betjening <ol><li> Glødeudladnings- den tynde kulstof belagt 300 mesh kobber EM gitre i 10 sek. </li><li> Saml et gitter med en pincet og krog pincetten ind i bøjlen ved at holde nettet i en 45 ° hældning og 1 tomme over iseninden i inkubationsstationen. </li><li> Proteinprøven med Dulbeccos phosphatbufferet saltvand (DBP) fortyndes til endelig proteinkoncentration på ~ 0,01 ~ 0,005 mg / ml. Depositum ~ 4 pi fortyndet prøve umiddelbart efter fortyndingen på carbon side af EM nettet. (DPBS kan ændres til en anden buffer, hvis proteinet er følsom over for DPBS) </li><li> Prøven inkuberes på EM gitre til ~ 1 min inde i inkubationstiden stationen. </li><li> Fjern den overskydende opløsning gennem hurtigt røre nettet kant med filtrerpapir. </li><li> Tryk på nettet hurtigt til den første dråbe (~ 35 ul) af rent vand overflade på toppen af ​​Parafilm ark lige efter overskydende opløsning blev fjernet på EM nettet. Og derefter fjerne det overskydende vand straks med filtrerpapir. </li><li> Gentag trin 3.6 for yderligere to gange ved vask af EM-gitter på de resterende to vanddråber på Parafilm (trin 3.6 og 3.7 kan springes over, hvis prøven er meget følsomme over for vand). </li><li> Float EM grid umiddelbart på overfladen af ​​den første dråbe af UF opløsning lige efter det overskydende vand på EM-gitter blev fjernet. Og derefter inkuberes i 10 sek. Sørg for at afslutte vand vaskeprocedurer indenfor 3 sek før flyder nettet på overfladen af ​​UF løsning. Jo kortere vasketid, jo bedre kvalitet være. </li><li> Rengør pincet ved at trænge spidserne ind i et filter papir til ~ 2 - 3 gange. </li><li> Fjern det overskydende opløsning på nettet gennem kontakt nettet kant med filtrerpapir, og derefter flyde nettet på den anden dråbe UF. </li><li> Fortsæt ovennævnte trin 3.10 på anden dråbe. </li><li> Float gitteret på tredje dråbe af UF løsning og dækker farvning station for ~ 1 min. </li><li> Eventuelt trin: vask gitteret hurtigt på toppen af ​​vand som beskrevet i 3.6. Dette yderligere skridt vil gavne prøver indeholdende over indlæst gratis guldpartikler eller bejdse baggrund. </li><li> Fjern overskydende opløsning ved at trykke på filtrerpapiret til thHele e grid bagside (modsat kulstof side). Tør gitteret under en svag strøm af nitrogengas ved stuetemperatur lige efter observere opløsningen absorbere filtrerpapiret. </li><li> Placer gitteret på et ark filtrerpapir inde i en petriskål, og dække skålen delvist med en hætte til at tørre i mindst 30 minutter under RT. For nogle prøver, placere nettet i en 40 ° C inkubator bagning i en time. </li><li> Opbevar nettet i en EM gitter kasse for fremtidig EM undersøge. </li></ol> 4. EM Undersøgelse <ol><li> Juster TEM ordentligt før EM undersøgelse af de små proteiner på nettet. <ol><li> Kontroller opløsningen på den højeste synlige Thon-ring, der er den magt spektrum af en amorf carbon film til at afgøre, om TEM er justeret korrekt. Da TEM deles af mange forskellige brugere, TEM var ofte ikke korrekt justeret. </li><li> Kontroller omhyggeligt effektspektret på carbon film område af prøven for at justere tilpasningen condition af maskinen. De højeste synlige Thon-ringe er bedre end den målrettede opløsning. BEMÆRK: Som et eksempel på en korrekt tilpasning af en LaB6 glødetråd TEM drives under 120 kV høj spænding, kan mere end 20 Thon-ringe visualiseres, hvor den, kan den tilsvarende opløsning være bedre end 5,0 Å. Dette Thon-ring blev opnået ved Fourier overførsel af en amorf carbon film afbildes under en defokusering af ~ 1,6 um og en dosis på 20,4 e / A2 (figur 5). BEMÆRK: Observation af den høje opløsning Thon-ring er en nødvendig betingelse, men ikke en tilstrækkelig betingelse for korrekt justering. For rent faktisk at nå de høje opløsning billeder, mange andre parametre er også vigtige, såsom prøve kvalitet, stråleskader, opladning og drifting samt belysning dosis. </li></ol></li><li> Bring Defocus tilbage til nær-Scherzer fokus til afbildning af små proteiner på et ideelt farvede område. </li><li> Søg efter &quot;uklar&quot; område til image. Et ideelt farvede område er normalt placeret nær kanten af en tykkere pletareal, der ligner en &quot;uklar&quot; område på gitteret, idet tykkelsen af pletten er normalt ikke jævnt fordelt på kulovertrukne gitter (figur 6). Typisk en lav forstørrelse (&lt;100x) var at hjælpe med at finde disse overskyet områder først, før at zoome ind til billeddannelse. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Sammenlignet med konventionelle NS teknikker, kan OpNS forhindre Rouleaux artefakter (figur 1 og 9), der giver pålidelig og rimelig høj opløsning (~ 1 nm) strukturelle detaljer i små proteiner (figur 2). Sammenlignet med kryo-EM OpNS giver en high throughput fremgangsmåde og kan behandle en bred vifte af proteiner og protein-protein interaktioner 6. Men OpNS stadig sine ulemper. Sammenlignet med konventionelle NS, OpNS indebærer: i) mere komplicerede trin i modellen forberedelse; ii) under anvendelse af et radioaktivt stof, UF; iii) holde pletten frisk på grund af den kortere styrken af ​​UF plet på grund af sin lysfølsomhed; iv) for at forhindre udfældning UF Opløsningen skal opbevares i -80 ° C og kræver optøning før brug; v) og til sidst alle UF skal håndteres som farligt affald. Sammenlignet med cryo-EM, OpNS giver relativt lavere opløsning billeder og ingen garanti for nogen endnu ikke opdaget artefakti fremtiden. NS drift proceduremæssige effekter på lipoprotein rouleaux dannelse NS-protokoller til at forberede proteiner til undersøgelse 16,29-36,55 kan inddeles i tre hovedgrupper af metoder 50: blanding 55, drop-af-drop 16, og vaskeprocedurer 29. i) blanding protokollen kræver den indledende blanding af pletten og protein prøve på et bestemt forhold, og derefter anvende den blandede opløsning på kulstof belagt på et gitter, endelig at fjerne overskydende opløsning med filtrerpapir før lufttørring til EM undersøgelse 55. ii) drop-by-slip-protokol indebærer anvendelse (~ 4 ul) prøve drop direkte til en EM gitter belagt med kulstof lade sidde i ~ 1 min, derefter fjerne overskydende prøveopløsning før påføring af en dråbe (~ 4 ul) af pletter løsning på den samme side af gitteret. Efter ~ 1 min inkubation, fjern for strams pletten gennem kontakt med ren filtrerpapir endelig indsendelse til lufttørring 16,56-58. iii) vask protokollen (figur 7), der kræver prøveopløsning ansøgning til en EM gitter belagt med kulstof i 1 min, derefter vask med demineraliseret vand tre gange lige efter fjernelse af overskydende opløsning hver gang med filtrerpapir 3,29,30. OpNS protokol blev ændret fra denne vask procedure. NS plettyper og effekter på lipoprotein rouleaux dannelse I NS, stærkere elektron spredning på grund af tungmetaller pletter giver kontrast fra proteinerne 17-20,59. NS prøver kan desuden lide større strålingsdoser, og forbedre protein funktioner ved at en skarpere negativ kontrast 8,9,60. Pletter af tungmetaller kan klassificeres som: anioniske, herunder phosphowolframsyre (PTA) 16, methylamin wolframat 14 og silicium tungstate 61; og kationIC, såsom uranylacetat (UA) 62, UF 3,29,30, og uranylnitrat (FN) 63. En af de anioniske NS pletter, der er mest almindeligt anvendte er PTA 33,64-67. PTA er en heteropolysyre, der typisk anvendes omkring pH 7,0-7,5. PTA kan også anvendes til positiv farvning 3,16,68. De negative ladninger på PTA kan mediere elektrostatiske interaktioner med umættede lipider positivt ladede hovedgrupper, ligesom POPC, på begge lipoprotein og liposom overflader. PTA kan forårsage rouleaux-dannelse gennem denne interaktion 29,30 selv under almindelig puffer saltholdighed 29,30 (figur 1). Uranyl pletter, såsom UA, UF og FN er alternative muligheder for kationiske tungmetaller pletter og UA især bruges ofte til NS af en række biologiske prøver 62,69,70. Eksperimenter fundet UF forårsager ingen pengerulledannelse af lipoproteiner, der indeholder umættede fedt sure lipider, såsom POPC. Dog kan UF stadig fremkalde Rouleaux formation på lipoprotein, der indeholder mættede fedtsyregrupper lipider, såsom dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) og 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (PSPC). Den detaljerede mekanisme af denne interaktion er ukendt. UA / UF / FN kan alle arbejde ved lavere pH-værdier i intervallet fra 3,5 til 4,6. Sådanne lavere pH-værdier kan ikke egnet til visse biologiske makromolekyler, der er følsomme over for pH 14,71. Interessant, kan UA / UF fix proteinstruktur inden for et par millisekunder via en ukendt mekanisme 72. I modsætning til PTA, UA / UF er mere ligner et salt end en syre. UF sigende kan give bedre resultater end UA 73, hvor den, UF og FN pletter har mindre kornstørrelser end UA (UF: 0,3 nm, FN: ~ 0,5 nm) 3,74. Et interessant eksempel, sekundære strukturelementer-lignende detaljer i et lille protein (53 kDa CETP) kan visualiseres direkte fra de rå micrographs når UF blev anvendt som negativ plet reagens ved at følgetidligere rapporteret cryo-positiv-farvning (cryo-PS) metode (figur 8) 6. I kryo-PS, den farvede prøve var lynfryses ved at følge cryo-EM prøveforberedelse procedure i stedet for tørring procedure i OpNS protokol, som kan forårsage sekundære sammenstyrtning. -PS kryo Den er en fremgangsmåde til høj kontrast og høj opløsning billeddannelse af små proteiner 75. Da cryo-PS billeder har vendt kontrast i forhold til dem fra den rapporterede cryo-NS-protokol 22, men har konsekvent billede kontrast til dem fra traditionelle cryo-EM billeder, så det blev navngivet cryo-PS-metoden. Cryo-PS billeder viser, at farvningsreagens uranyl formiat, trænger den molekylære overflade, udfordrer den konventionelle opfattelse, at farvning kan visualisere kun den ydre overflade struktur. Den mekanisme for, hvordan uranyl formiat trænger den molekylære overflade er ukendt. En mulighed er at uranyl kation binder tilgængelige protein carboxylgrupper og dermedomgivende glaslegeme isen er lavere densitet end farvningen af ​​proteinet og uranyl koncerner og dermed fungerer som en positiv plet. Cryo-PS metode ligner multipel isomorf udskiftning (MIR) metode, som var en fælles tilgang til at løse fase problem i røntgenkrystallografi 76-78. I MIR er krystal prøverne gennemvædet med et tungt atom opløsning, herunder uran, for at få en isomorf form dets native form. Tilføjelsen af tungt atom undertiden ikke påvirker krystal dannelse eller enhedscelledele dimensioner, men giver yderligere oplysninger om krystalstruktur beslutsomhed 76-78. Ved at drage fordel af den lille gran af UF kunne cryo-PS giver en høj kontrast og høj opløsning billede af et enkelt protein, hvilket er vigtigt for protein struktur studier, især i betragtning af at næsten alle proteiner er naturligt dynamisk og uensartet i opløsning. Til validering af denne cryo-PS metode, åbner vi for en blindtest fra EM feltet. </p&gt; Saltkoncentration virkninger på rouleaux-dannelse i lipoproteiner Brug af traditionelt PTA negativt farvningsreagens observeres rouleaux dannelse mere sandsynligt relateret til lipid interaktioner i stedet for protein-interaktion. Imaging prøver af POPC liposomvesikler fremstillet under stort saltindhold (0,5 M NaCI), moderat saltindhold (0,25 M NaCl), relativt svage saltindhold (0,1 M NaCI) og rent vand (figur 9), de elektronmikrofotografier viser rouleaux dannelse var korreleret til saltkoncentration (figur 9A - D). Brug af UF som negativ farvningsreagens blev ingen pengerulledannelse observeret i POPC liposomvesikel prøve 30 (figur 2L), hvilket antyder vaskeproceduren til hurtigt at reducere saltkoncentrationen lige før farvningen er en nødvendig, men ikke uafhængigt tilstrækkelig skridt til forebyggelse pengerulledannelse i POPC relateret prøver. TEM imaging lille protein kræver en nær-Scherzer fokus tilstand. Vellykket TEM billeddannelse af små proteiner ved højere opløsning kræver to kritiske forhold, en ordentlig stråle tilpasning og en nær-Scherzer erhvervelse fokus tilstand. i) En ordentlig lyshøjden kan bedømmes gennem antallet af synlige Thon ringe (power spektrum) på Fourier overdragelse af en carbon film billede erhvervet i henhold til en relativt høj Defocus. Jo bedre tilpasning tilstand af bjælken, kan flere Thon ringe visualiseres og målelige .. ii) Erhvervelse billede under en nær-Scherzer fokus er en anden kritisk tilstand. En traditionel standard strategi til billeddannelse af biologiske prøver anvender typisk høj defokusering (1 - 2 um og endnu mere), som kan forbedre den biologiske prøve billedets kontrast 79. Denne strategi er signifikant forskellige fra den typiske strategi til billeddannelse atomar opløsning struktur af hårde materialer, som ofteudnytter en nær Scherzer fokus (~ 50 nm Defocus). Selv kunne en højere Defocus styrke biologisk prøve Derimod ville i høj opløsning signaler være delvist fjernet. Som et resultat, vil medvirken af ​​høj opløsning signal være lavere på et højere Defocus billeddannelse tilstand. Årsagen er, at TEM billede er foldning af prøve struktur og instrumentet CTF. CTF er en oscillerende kurve over frekvensen, hvor kurven ofte svinget krydser nul amplitude ved høj frekvens. Hver gang, når CTF tværs nul, prøven strukturelle signal på dette specifikke frekvens vil blive elimineret (nul gange et vilkårligt antal vil være nul). Den elimineret signal ved denne frekvens kan aldrig udvindes ved enhver CTF korrektion algoritme (et nul divideret med nul kan være en tilfældig nummer i stedet for det oprindelige strukturelle signal). Under højere defocus billeddannelse, vil CTF svinge meget mere aggressivt, således CTF krydser nul amplitude oftere, som et resultat,de strukturelle signaler ved et større antal specifikke frekvenser vil blive elimineret. Jo flere signaler, der elimineres, jo mindre meddelagtighed billedet vil have. Især kan medvirken af ​​billedet ikke kan inddrives eller korrigeret af nogen CTF korrektion. Dog kan en række ikke gennemførte billeder optaget under forskellige defocuses bruges til at fylde deres huller til hinanden for at opnået en udfyldt strukturel signal af prøven struktur via en udjævning metode, hvor der kan opnås selv en atomar opløsning 9-12. Den gennemsnit-metoden er en kraftfuld metode til at opnå struktur nogle meget symmetriske proteiner og strukturelt beslægtede stive proteiner. Dog er det stadig en udfordring i den strukturelle undersøgelse af små og asymmetriske proteiner, især for strukturelle dynamik og fleksible proteiner, såsom antistoffer og HDLs. Midling er baseret på den antagelse, at protein partikler er identiske i struktur og konformation, men different i orienteringer, er dog mange proteiner kendt for at gennemgå termodynamisk udsving i opløsning. Ved at anvende gennemsnit metode uden tidligere at kende protein termodynamiske udsvingsmargener udsving, kan det i gennemsnit struktur ofte medføre manglende domæner 10,80 eller lokal variation i resolution 81 i cryo-EM rekonstruktioner. Succesen opnå 3D rekonstruktion af lille protein, såsom 53 kDa CETP og 3D-struktur af et enkelt protein, såsom 160 kDa IgG1-antistof, fordele ved at anvende nær-Scherzer fokus billeddannelse tilstand under en korrekt justering tilstand. Selv om billedet kontrast synes lav i nær-Scherzer fokus billeder, kan kontrasten let forbedret ved simpelthen at anvende et low pass filtrering for at reducere højfrekvent støj i baggrunden. Vi mener, det nær-Scherzer fokus billeder bære de maksimale strukturelle signaler, og kan øge nøjagtigheden af ​​partikel tilpasning og øge effektiviteten i single-partikel 3D-rekonstruktion og individuel partikel elektron tomografi genopbygning.

Forståelse protein funktion kræver viden om proteiners struktur. Strukturel bestemmelse er udfordrende for proteiner, hvis molekylmasser er inden for 40 til 200 kDa. Røntgenkrystallografi er begrænset af proteinkrystallisation; kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi er begrænset til molekylmasser mindre end 40 kDa, mens kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har svært ved både køb billede og tredimensionale (3D) rekonstruktioner af små proteiner, som molekylære masser er mindre end 200 kDa. Især mere end 50% protein har en molekylmasse i intervallet 40 til 200 kDa 1,2, da de nuværende metoder er udfordrende i at studere proteiner af denne størrelse, er der behov for en ny metode. Selv om de fleste transmission elektronmikroskoper (TEMS) er i stand til atomar opløsning, dvs bedre end 3 en resolution, opnå endnu en nær nanometer opløsning struktur fra et biologiske prøver er temmelig Challenging 7. Stråling skader, lav kontrast, strukturelle afvigelser samt artefakter såsom dehydrering alle hindre høj opløsning TEM billeddannelse 3,8. Blandt de forskellige TEM metoder, cryo-EM er en avanceret og banebrydende metode til at opnå atomare strukturer af stærkt symmetriske store makromolekyler resolutionen under nær fysiologiske betingelser 9-12. Cryo-EM prøve fremstilles blitz frysning prøveopløsningen, indlejring af makromolekyler i glaslegeme is, som efterfølgende afbildet ved kryogene temperaturer, såsom flydende nitrogen eller helium temperaturer 13. Cryo-EM er fordelagtig ved, at prøverne ikke udgør nogen artefakter og er næsten nativ struktur 8-12. Cryo-EM har sine ulemper: i) yderligere enheder er forpligtet til at blive installeret eller købt til at opgradere en standard TEM instrument til en cryo-EM kapacitet. Enheder omfatter: anti-contaminator, cryo-indehaver, lavdosis-mode software og lavdosis Sensitiv CCD-kamera, selv om priserne på disse enheder er meget lavere end prisen for TEM instrument selv; ii) cryo-EM operation kræver længere tid end NS drift. Behandlingen af ​​en cryo-EM prøven kræver ofte længere tid til at forberede prøver og drive TEM instrument end NS fordi cryo-EM kræver adressering yderligere problemer, herunder: flydende kvælstof temperatur drift, prøve opladning, billedbehandling afdrift, temperaturgradienter, lavdosis model operation, prøve felsomhed og dosering begrænsninger. Disse ekstra skridt vil bremse hastigheden for at erhverve nyttige data i forhold til erhvervelse IF data selv om et par cryo-EM billeder helt kan opnås i 1 time eller derunder ved cryo-EM eksperter med det instrument fremstillet med en afbalanceret temperaturgradient; iii) brugere kræver ekstra uddannelse, såsom håndtering af flydende kvælstof, frysning cryo-EM gitre, lavdosis drift, måling dosis, håndtering opladning, drifting og viden i billedbehandling procEssing; iv) mangel på gentagelig billeddannelse til samme cryo-prøve under forskellige TEM sessioner. Cryo-EM prøver beskadiges let af is kontaminering under prøven lastning og losning til / fra TEM-instrumentet. Denne skade er især en bekymring, når prøverne er vanskelige at isoleres / oprenses 14; v) små proteiner (&lt;200 kDa molekylvægt) er udfordrende at blive afbildet på grund af lav kontrast; vi) lav kontrast og høj støj af cryo-EM billeder reducerer krydskorrelationen værdi mellem billeder, derfor faldende samlede nøjagtighed i bestemmelsen af ​​protein orienteringer, konformationer og klassifikationer, især for proteiner, der strukturelt fleksibel og naturligt svinger i opløsning 4,5. Negativ farvning (NS) er en relativt &quot;gamle&quot; og historisk metode, som alle laboratorier, med enhver form EM, kan bruge til at undersøge proteiners struktur. Brenner og Horne først udviklet konceptet of negativ farvning et halvt århundrede siden for behandlingen virus 15. NS opnås gennem coating modellen med ladede tungmetalsalte. Dette begreb der oprindeligt kommer fra lysmikroskopi og praksis for indlejring bakterier ind i en plet løsning, der giver mørke omkring prøverne, så højere billedets kontrast, når du ser det negative billede 16. Eftersom tungmetalioner har en større evne til at dispergere elektroner i forhold til mindre tætte atomer i proteinerne 17-20, og coating tungmetal pletten tillader en højere dosis begrænsning med forbedret kontrast. NS prøven kan give billeder med høj kontrast 8 til lettere partikel orientering beslutsomhed og 3D-rekonstruktion end billeder fra cryo-EM. Traditionelle NS, desværre, kan producere artefakter fremkaldt af bejdse-protein interaktioner, såsom generel sammenlægning, molekylær dissociation, fladere og stabling 8,21,22. For lipid relateret proteins, såsom lipoproteiner 16,23-30, en fælles artefakt resulterer i partikler, der er stablet og pakkes sammen i en pengerulledannelse (figur 1) 31-36. Mange lipoprotein-undersøgelser, såsom denaturerende polyacrylamid gradient gelelektroforese cryo-EM undersøgelser 13,29,37-40, massespektrometri 39,41 og mindre vinkel røntgen-diffraktionsdata 42 alle viser lipoprotein partikler er isolerede partikler i stedet for naturligt stablet tilsammen danner en pengerulledannelse 21,29,30,35,42-45. Observationen af rouleaux dannelse ved konventionelle NS er muligvis forårsaget af dynamiske interaktioner mellem lipoproteiner sammensat af apolipoproteiner (apo) og phospholipider, der strukturelt fleksibel i opløsning 13,29,30,46-49 og følsomhed over for den standard NS-protokollen. For at identificere denne artefakt blev apolipoprotein E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) high-density lipoprotein (HDL) prøve, der bruges som en prøve og fryselagringEM billeder til et artefakt gratis standard 29, screening NS prøver udarbejdet under en række betingelser. Ved at sammenligne de partikelstørrelser og former opnået fra NS og kryo-EM blev den specifikke type farvningsreagens og saltkoncentration fundet at være to nøgleparametre forårsager de velkendte Rouleaux fænomener. Således blev en optimeret negativ farvning (OpNS) protokol rapporteret. Ved OpNS blev den velkendte pengerulledannelse fænomenet apoE4 HDL elimineres ved OpNS (figur 2A). Statistisk analyse viste OpNS udbytter meget ens billeder (færre end 5% afvigelse) i størrelse og form i forhold til dem fra cryo-EM blev dog kontrasten elimineret. De validere OpNS blev udført ved at undersøge fjernelse af pengerulledannelse artefakt af næsten alle klasser eller underklasser af lipoprotein prøver 6,29,30,50,51, herunder ApoA-I 7,8 nm (figur 2B), 8,4 nm (figur 2C) , 9,6 nm discoidal rekonstitueret HDL (rHDL) (figur 2D), 9,3 nm sfæriske rHDL (figur 2E), human plasma-HDL (figur 2F), lipid fri ApoA-I (figur 2G), plasma-HDL (figur 2H), lipoprotein med lav densitet (LDL ) (figur 2I), mellemprodukt-density lipoprotein (IDL) (figur 2J), med meget lav densitet (VLDL) (figur 2K) og POPC liposom (figur 2L) 30. Yderligere valideringer blev udført ved at afbilde små og asymmetriske proteiner, herunder 53 kDa cholesterylesteroverførselsprotein (CETP) (figur 3A - C) 6,29 og meget fleksibel 160 kDa-IgG-antistof (figur 4A og B) 4,5,29 , 52, og to strukturelt velkendte proteiner, GroEL og proteasom (figur 2M og N). For at kræve nogen yderligere validering fra Colleagues, vi er åbne for enhver blindtest på denne OpNS metode. OpNS som en high-throughput protokol også er blevet brugt til at studere protein-mekanisme via undersøge hundredvis af prøver af små proteiner, såsom CETP, der var bindende for forskellige proteiner henhold til en række betingelser (herunder CETP interagere til 4 klasser af lipoproteiner, rekombineret HDL, plasma-HDL, LDL og VLDL, med / uden 2-antistoffer, H300 og N13, under 9 inkubationstider, herunder 3 min, 20 min, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer, under 4 molforhold, dvs 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, og 3 fortyndinger, dvs 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml og 0,001 mg / ml, plus yderligere kontrolprøver, herunder CETP alene, LDL alene, og VLDL alene, med tredobbelt test af ovennævnte eksperimenter af forskellige personer) 6,29. OpNS billeder af CETP forudsat høj kontrast billeder med rimelighed fine strukturelle detaljer; giver os mulighed for at kunne rekonstruere et 3D tæthed kort over 53 kDa SMAll protein CETP (figur 3D - F) ved en enkelt partikel genopbygning. Desuden høj kontrast OpNS billeder giver os en tilstrækkelig signal fra en enkelt protein (figur 4A - C), hvilket tillod os at opnå den mellemliggende opløsning (~ 1,5 nm) i en enkelt (ét objekt, ingen gennemsnit) IgG-antistof 3D struktur via individuel partikel elektron tomografi (Ipet) metode (figur 4E - J) 5. Den detaljerede beskrivelse af Ipet genopbygning strategi, metode, trin-for-trin processer og strukturel variation analyse blev tidligere rapporteret 4. En film om Ipet antistof genopbygning procedurer, herunder de rå billeder og foreløbige resultater, 3D tæthed kort og strukturel docking var også tilgængelig for offentligheden ved uploadet til YouTube 5. Sammenligning af 3D rekonstruktioner fra forskellige individuelle antistofpartikler kunne afsløre protein dynamik og Conformational ændringer under kemiske reaktioner 4,5. I betragtning af at over 50% af proteiner har molekylmasse spænder fra 40 til 200 kDa 1,2, succes i at afbilde disse små proteiner viste, at OpNS metoden er et nyttigt værktøj til at skubbe den konventionelle EM grænse mod små og asymmetriske strukturelle beslutninger og mekanisme opdagelser . Således er den detaljerede protokol billede nedenfor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:547px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Stain: Uranyl Formate</td>
			<td style="width:159px;">The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td>
			<td style="width:137px;">02545-AA</td>
			<td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">SYRINGE: 1ML NORM-JECT</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-491</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Syringe filter: 0.2 &#956;m&#160;</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">28145-487</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Syringe filter: 0.02 &#956;m filter (Anotop 10)</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">6809-1002</td>
			<td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:159px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">470152-246</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td>
			<td style="width:159px;">Pacific Grid-Tech</td>
			<td style="width:137px;">Cu-300CN</td>
			<td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">CF200-Cu</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Tweezer: Dumont Tweezer L5</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">72882-D</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Milli-Q Advantage A10</td>
			<td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Filter Paper: Grade 1 circles</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">1001-090</td>
			<td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
			<td style="width:137px;">NA</td>
			<td>Any type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glow Discharge Unit</td>
			<td style="width:159px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:137px;">91000</td>
			<td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-520</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-524</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Filter Tips: VWR Signature 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">37001-528</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Pipet</td>
			<td style="width:159px;">Pipetman</td>
			<td style="width:137px;">F161201 and F167300</td>
			<td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy

Strukturel bestemmelse af proteiner er ret udfordrende for proteiner med molekylvægte mellem 40 til 200 kDa. I betragtning af at mere end halvdelen af naturlige proteiner har en molekylmasse mellem 40-200 kDa 1,2, er der behov for en robust og high-throughput metode med en nanometer opløsning kapacitet. Negativ farvning (NS) elektronmikroskopi (EM) er en nem, hurtig og kvalitativ tilgang, som der ofte er blevet brugt i forskningslaboratorier til at undersøge protein struktur og protein-protein interaktioner. Desværre konventionelle NS protokoller ofte genererer strukturelle artefakter på proteiner, især lipoproteiner, der normalt danner præsentere Rouleaux artefakter. Ved at bruge billeder af lipoproteiner fra cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) som en standard, blev de centrale parametre i NS prøvepræparation betingelser nylig screenet og rapporteres som den optimerede NS-protokollen (OpNS), en modificeret konventionel NS protokol 3. Artefakter som rouleaux kan blive kraftigt begrænset af OpNS, derudover giver høj kontrast sammen med rimelig høj opløsning (nær 1 nm) billeder af små og asymmetriske proteiner. Disse høj opløsning og høj kontrast billeder er også gunstige for en enkelt protein (et enkelt objekt, ingen gennemsnit) 3D-rekonstruktion, såsom en 160 kDa-antistof via den elektron tomografi 4,5. Desuden kan OpNS være en høj-throughput værktøj til at undersøge hundredvis af prøver af små proteiner. For eksempel den tidligere publicerede mekanisme 53 kDa cholesterylesteroverførselsprotein (CETP) involverede screening og billeddannelse af hundredvis af prøver 6. I betragtning af cryo-EM sjældent held billeder proteiner mindre end 200 kDa har endnu at offentliggøre enhver undersøgelse, der involverer screening over hundrede betingelser prøve, er det rimeligt at kalde OpNS en high-throughput metode til at studere små proteiner. Forhåbentlig OpNS protokol præsenteres her kan være et nyttigt redskab til at skubbe grænserne for EM og fremskynde EM undersøgelser af lille protein struktur, dynamik og mekanismer.

De implementeringer af OpNS omfatter de strukturelle og morfologiske undersøgelser af forskellige lipoprotein-arter såsom spirende rekombinant HDL (rHDL), sfærisk rekombinant HDL, plasma-HDL, LDL, IDL og VLDL (figur 2) 30; såvel som små proteiner, såsom 53 kDa CETP (blandt de mindste proteiner held afbildes gennem EM) (Figur 3) 6 og 160kDa IgG-antistoffer (en af de mest dynamiske og heterogene proteiner) (figur 4) 4,5,29,52 Selv 28 kDa lipid fri apolipoprotein A-1 (figur 2L), og GroEL og Proteasomer (figur 2M og N). Andre eksempler på OpNS som en high-throughput metode er at undersøge protein-protein-interaktioner til at afdække protein mekanismer, såsom 53 kDa CETP. Som beskrevet i indledningen, hvordan CETP interagerer med forskellige underklasser af lipoproteiner var undersøgelted via undersøge mere end 400 EM prøver 6 Så vidt vi ved, var der ikke sådan et tilfælde af cryo-EM undersøgelse, der involverer screening næsten hundrede forskellige betingelser. OpNS kan udvide EM grænser for at studere små og asymmetrisk protein 3D struktur og endda udvide til at opnå 3D-struktur danne en enkelt og individuel protein (uden gennemsnit). For eksempel IgG-antistof er 160 kDa molekyle med en meget fleksibel struktur, hvor 3D-rekonstruktion ved mellemliggende opløsning er udfordrende at blive opnået. den OpNS fremgangsmåde blev anvendt til billedet en individuel IgG-antistof fra en række kurvestyrede vinkler (figur 4E og H). De rimelig høj opløsning og høj kontrast protein billeder fra OpNS tilladt for en vellykket rekonstruktion af et enkelt protein ved individuel partikel elektron tomografi (Ipet) (figur 4E - J) 4,5. I Ipet 3D rekonstruktion <sup&gt; 4 blev 2D tilt serie målrettede antistof gradvist tilpasset til deres beregnede globale centrum via efterfølgende iterativ rekonstruktion for at opnå en 3D-tæthed ved en opløsning på ~ 14,1 A (figur 4F og G) 4. Ved samme fremgangsmåde blev et enkelt antistof-peptid kompleks rekonstrueret, og peptidet inducerede den interne domæne konformationsændringen af et enkelt antistof partikel blev opdaget (Figur 4I og J, opløsning ~ 16,6 Å) 4,5. Sammenligning af 3D-rekonstruktioner fra forskellige individuelle partikler, kan den strukturelle analyse tillade os at afsløre protein termodynamiske udsving, og endda &quot;snap-shot&quot; de mellemliggende stadier af en kemisk reaktion 4,5,29,53,54. Sammenfattende proteiner med molekylmasse mellem 40 kDa - 200 kDa er udfordrende for standard EM strukturelle undersøgelser og rekonstruktioner. I betragtning af, at over 50%af proteiner har molekylmasse spænder fra 40 til 200 kDa 1,2, rapporterer vi en OpNS metoden som et robust og high-throughput værktøj til at skubbe konventionelle EM grænse mod små og asymmetriske strukturelle bestemmelser og endda mekanistiske undersøgelser. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Rouleau artefakt af lipoproteiner ved traditionel negativ farvning (NS) EM. Elektronmikrografier (over paneler) og udvalgte partikler (under paneler) viser forskellige lipoproteiner med pengerulledannelse efter NS med phosphowolframsyre (PTA) under standard blanding procedure. (A) rekonstitueret HDL (rHDL) med apoE4, (B), ApoA-I-holdige 9,6 nm skiveformede rHDL, (C) apoB indeholdende plasma LDL, (D) ikke-apolipoprotein-indeholdende POPC-liposomer. Barer: 50 nm. Vindue størrelse: A og C, 20 nm; B, 30 nm. The Journal of Lipid Research oprindeligt offentliggjort dette arbejde 29,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Protein struktur ved optimeret negativ farvning (OpNS) EM Elektronmikrografier viser forskellige lipoproteiner og liposomer uden pengerulledannelse artefakt af OpNS (A) apoE4-holdige rHDL,.. (B) 7.8 nm rHDL, (C) 8,4 nm rHDL; ( D) 9,6 nm rHDL (e) 9.3 nm sfæriske rHDL, (F) humant plasma α-HDL (g) plasma-HDL, (H) humant plasma LDL (I) humant plasma IDL (j) humant plasma VLDL; <strong&gt; (K) POPC liposom, (L) lipid gratis apoA-I. Yderligere kontrol blev udført ved hjælp af (M) GroEL og (N) proteasomet prøver. Mikrografier (over paneler) og udvalgte partikler (under paneler). Barer: 50 nm. Vindue størrelse: A - D, 20 nm; E og F, 25 nm; G 20 nm; H 25 nm; Jeg, 50 nm; J og K, 100 nm; L, 80 nm. Undtagen lipid gratis apoA-I, GroEL og Proteasome, Denne forskning blev oprindeligt udgivet i Journal of Lipid Research 29,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. OpNS elektronmikrofotografier af CETP. (A) Oversigt mikrograf med CETP (stiplet cirkler) banan formede partikler. (B) Windowed Vælg rå partikler. (C) tre enkelt rå CETP partikel billeder tydeligt viser en større, tungere og større kugleformet spids, herunder den anden mindre, lettere og smallere spids (venstre panel), ovenfra viser lignende terminale regioner med mindre samlet krumning (i midten panel), og ende udsigt ned ad den lange akse af CETP (højre panel) (D) Overlejre krystalstrukturen (FBF:. 2OBD) på disse rå CETP partikel billeder matcher godt i både form og med domæne størrelse viser orienteringen kan være næsten direkte defineret selv uden hjælp af computer (svarende paneler til (C)). (e) henvisning gratis 2D klasse gennemsnit (en ab initio proces at beregne lighederne (beregninger krydskorrelation) af disse tilfældigt orienterede partikler, partiklerne har en stor lighed med hinanden blev grupperet og justeret, og derefter gennemsnit til at reducere baggrundsstøj og forbedret partikel billedet conkontrast. Referenceværdierne gratis 2D klasse gennemsnit beregnes ved refine2D.py software i EMAN pakke, hvor der, ikke noget menneske taget indledende model blev involveret i denne klasse gennemsnit. Referenceklassen gennemsnit kan anvendes som en uafhængig metode til at validere 3D rekonstruktion fra enkelt-partikel rekonstruktion). (F) valgte referencestoffer gratis 2D klasse gennemsnit viser en større distal ende i forhold til den anden. (G) Indtonet krystalstruktur (FBF : 2OBD) forhold til referenceprodukterne gratis gennemsnit overlægningsfunktionerne billeder viser en næsten perfekt match mellem krystal-struktur og reference-fri klasse gennemsnit i både struktur form og domæne størrelse (lav panel) (F) 3D tæthed kort over CETP ad. beslutning af 13. Å blev rekonstrueret fra 8.879 partikler afbildet af OpNS og enkelt partikel genopbygning metode (øverste panel) og riflede kroppen forankret i denne enkelt partikel rekonstruktion af krystalstrukturen (lav panel). Den itfattedes oplysninger om enkelt partikel genopbygning, herunder forbehandling af billede, indledende model, forfining procedurer vinkel distribution og Fourier Shell korrelation (FSC) blev offentliggjort i metodeafsnittet og støtte i den originale papir (H) Endelig sammenligning af en enkelt partikel genopbygning ( over panel) og yderligere FBF fit sammenligning (nederste panel) 6. Barer: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. Nogle af disse tal blev tidligere offentliggjort i Nature Chemical Biology 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. OpNS billeder og rekonstruktioner af humant IgG 1 antistof partikler. (A) Ivisning af humane IgG1-antistof OpNS billeder. Partikler vist i hvide cirkler viser tydeligt partiklerne med 3 subdomæner. (B) Udvalgte høj opløsning rå billeder af fem individuelle ukonjugerede antistof partikler og (C) deres tilsvarende støjreducerede billeder ved manuelt at reducere støjen omkring rå partikel kant (uden røre nogen densitet inde i partiklerne) for at visualisere nemt. (D) Krystalstrukturen (PDB post 1IGT) af IgG1-antistof, som blev orienteret til en tilsvarende visning for EM-billeder. Sammenligning af de tilsvarende billeder viser mange fælles træk mellem EM billede og krystalstruktur, herunder domæne holdninger og former. (E) I trin-for-trin procedure for en ab initio 3D rekonstruktion fra en enkelt instans IgG1-antistof (ingen gennemsnit, et individuelt objekt) ved hjælp af individuel-partikel elektron tomografi (Ipet) metode. (F) Den endelige 3D-rekonstruktion af en siNGLE antistof partikel ved opløsning af 14,1 Å viste tre doughnut formet domæner formning i et &quot;Y&quot; form. (G) Docking domænerne krystalstrukturer i hver af tilsvarende domæne tæthed kort henholdsvis og manuelt at gentage de sløjfer blandt domænerne. (H) Trin-for-trin procedure for 3D rekonstruktion af et enkelt IgG-peptid kompleks (ingen gennemsnit, en enkelt objekt) ved Ipet. (i) den sidste 3D-rekonstruktion af en IgG-peptid kompleks blev vist på opløsning på 16,6 Å viste tre stang formede domæner danner i et &quot;Y&quot; form (J) Henholdsvis docking krystalstruktur af hver IgG-antistof-domæner (FBF post: 1IGT). ind i hver stang form tætheder viste en dårligt matcher med domæne krystalstrukturer, hvilket tyder på en indre domæne konformationsændringen efter peptid konjugation. Den detaljerede procedure, blev beslutning analyse og statistik beskrevet i den oprindelige papir <sop&gt; 5 bar: A, 50 nm; B - D, 10 nm. Dette arbejde oprindeligt publiceret i PLoS One 4 og videnskabelige rapporter. 5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5. Effekt spektrum af amorf carbon film afbildet under 1,6 um Defocus af en Zeiss Libra 120 LaB6 TEM. Høj opløsning billeddannelse kræver tilstrækkelige beviser for, at EM har den rette justering og høj opløsning kapacitet. Analysen af ​​kraftspektrum nærheden kulstof område på nettet er en effektiv metode til at kontrollere strålen sammenhæng tilstand forud for dataopsamling. Fourier overførsel af billedet af en amorf carbon område viser instrumentet relaterede funktioner kontrast overførsel (C<html> TF), såkaldte Thon-ringe. En korrekt justering og sammenhæng kan afspejles af antallet af synlige Thon-ringe og den højeste opløsning af synlige Thon ringe under en relativt høj Defocus tilstand. Som et eksempel på en nær korrekt tilpasning betingelse for en lab 6 glødetråd udstyret TEM er mere end ~ 20 Thon ringe (~ 5 A), kan genereres fra en carbon film afbildet på 1,6 um Defocus hjælp dosis 20,4 E - / A 2. Thon ringe opnået fra en low-end TEM har en magen til, at der fra high-end TEM, såsom et felt-emission pistol (FEG) øget TEM drives under en korrekt justering tilstand. Dette arbejde oprindeligt publiceret i videnskabelige rapporter. 5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> 6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figur 6. Eksempel mikrografier &quot;ideelle&quot; områder for OpNS billeddannelse. Tre proteinprøver, (A) GroEL (B) Proteasome (C) Sfærisk HDL, blev anvendt som eksempler for at vise de ideelle OpNS til billeddannelse. Da pletter er ujævnt fordelt i prøven, lav forstørrelse af prøve normalt vises &quot;uklar&quot; (længst til venstre panel). De oplagte områder for billeddannelse er normalt placeret i grænserne for disse &quot;skyer&quot;. Et eksempel på trin-for-trin zoom-i én &quot;uklar&quot; plet område (venstre midterste panel) viser stor forstørrelse billeder præsenterer med høj opløsning og høj kontrast billeder af partikler (højre midterste panel). Udvalgte billeder af partikler viser strukturen oplysninger om proteiner (længst til højre panel). Barer:. 30nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig6highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se et stort</a>R-udgave af dette tal. <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Et skematisk diagram af OpNS procedurer. (A) EM gitter inkubation station, enkel station at inkubere prøven løsning på glød-afladet gitter. (B) Farvning arbejdsstation, designet til at opretholde vand vask dråber, og plette dråber over en is seng, og samtidig minimere plet lyspåvirkning. (C) Oversigt over farvningsprocedure, illustrerer: blotting retning, 3x skylning med vand, 3x UF plet eksponering Farvning inkubation med omvendt prøve gitter på pletten dråber og den endelige bagsiden prøve blotting for at sikre et tyndt lag af prøven farveopløsning før tørring ved kvælstof luft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af th</a>er figur. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8. Høj - billeder af 53kDa lille protein CETP opløsning åbenbaret fra en modificeret OpNS metode, cryo-positiv-farvning (cryo-PS) Fem vælge høj opløsning og cirkulær form bløde maskerede rå billeder af CETP partikler (med omvendt kontrast). og partikelform maskeret rå partikler (manuelt reduceret støj omkringliggende rå partikel billedernes kanter, men uden at ændre nogen tæthed inden partiklerne) for at visualisere nemt. All-atom og bånd krystalstruktur sammenligning maskerede rå partikler tilpasset til tilsvarende orienteringer af hver partikel til EM billeder. Detaljerne i de rå billedområder højopløsningsskærm vis lighed med krystalstruktur, mens ikke alle krystalstruktur funktioner kan løses fra rådata. Remarka<html> Bly er disse rå billeder viser lighed i både terminal ender med nærliggende små cirkulære huller set i manuelt reduceret støj-billeder (trekanter); desuden strengene i de C-terminale regioner i partikel billeder supplere krystalstruktur β-ark (pile) og endelig fremstående løkker på CETP C-terminale region er beslægtet i krystalstrukturen (romber). (A) Fem vælge høj opløsning og cirkulær form bløde maskerede rå billeder af CETP partikler (med omvendt kontrast). (B) lavpasfiltrering til 10A. (C) Højere lavpasfiltrering til 20a. (D) Maskerede manuelt støj reducerede billeder. (E) Krystalstruktur sammenligning med bånd struktur. (F) Krystalstruktur sammenligning af alle atom repræsentation. Bar: 5 nm. En del af dette arbejde blev offentliggjort i Nature Chemical Biology 6.lank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" width="500" /> Figur 9. Elektronmikrografier liposomer viser Rouleau dannelse ved konventionel NS protokol (PTA plet) under forskellige saltindhold. (A) Høj saltholdighed (~ 0,5 MNaCl). (B) Regulær saltindhold (~ 0,25 M NaCl). (C) Lav saltholdighed (~ 0,1 M NaCl). (D) Rent vand. Mikrografier (over panelet), og vælg windowed partikler (under panelet) vist. Barer: 100 Nm. Vindue størrelse: 80 nm. The Journal of Lipid Research oprindeligt udgivet dette arbejde 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Mere end halvdelen af ​​proteiner er små proteiner (molekylvægt &lt;200 kDa), der er udfordrende for både elektronmikroskop billedbehandling og tredimensionale rekonstruktioner. Optimeret negativ farvning er en robust og high-throughput-protokollen til at opnå en høj kontrast og relativt høj opløsning (~ 1 nm) billeder af små asymmetriske proteiner eller komplekser under forskellige fysiologiske betingelser.

Optimeret negativ farvning: en High-throughput protokol for behandlingen Små og asymmetrisk proteiners struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Research

JoVE Journal

Environment

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

High-throughput Fluorometric Måling af Potentiel Jord Ekstracellulære enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Eksperimentel protokol til at manipulere Plant-induceret Soil Heterogenitet

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodale Optisk mikroskopi Metoder Reveal Polyp vævsmorfologi og struktur i Caribien Reef Building Koraller

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Semi-højkapacitetsscreening for Potentiel tørke-tolerance i salat (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) kimplasmasamlinger

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

High-throughput screening af Modstridigheden Variationer i lignocelluloseholdige biomasse: Total Lignin lignin Monomerer og enzymatisk Sugar Frigivelse

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Administrere og Detektering Protein Marks på Leddyr til Dispersal Forskning

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

En Push-pull-protokollen til at reducere Colonization af Bird redekasser af honningbier

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

En protokol til Indsamling og Konstruktion Jord Core lysimetre

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Høj overførselshastighed, individuel protokol for analyse af behandling parametre og ernæringsmæssige kvaliteter i majs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensionel (3D)-trykt skabelon for High Throughput zebrafisk Embryo opstilling

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...