Name: optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Vi takker Dr. Mickey Yang for redigering og kommentarer, og DRS. Lei Zhang og Bo Peng for å få hjelp. Dette arbeidet ble støttet av Office of Science, Office of Basic Energy Sciences i USA Department of Energy (kontrakt nei. DE-AC02-05CH11231), det nasjonale hjerte, lunge og blod Institute of National Institutes of Health (ingen . R01HL115153), og National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health (ingen. R01GM104427).

1. Fremstilling av frisk negativ farging løsning ved 1% (w / v) <ol><li> Sett 1 mg Uranyl formiat (UF) pulver i glassflaske som inneholder 100 ml avionisert vann i et mørkt rom eller boks. </li><li> Rør løsningen O / N ved RT i et mørkt rom / boks. Pakk løsningen flaske med aluminiumsfolie for å hindre lys fra å treffe løsningen. </li><li> Filtrer løsningen forsiktig gjennom 0,2 mikrometer (porestørrelse) filter som er montert på en 5 ml sprøyte. Den filtrerte oppløsning ble oppsamlet i flere aluminiumsfolie dekket Falcon-rør. Filteret sprøyte må også pakkes med aluminiumsfolie for å hindre lyseksponering. </li><li> Filtrer løsningen igjen gjennom 0,02 mikrometer (porestørrelse) filter montert på en ml sprøyte. Den filtrerte oppløsningen ble oppsamlet og delmengde i 2 ml ampuller. De sprøyter og ampuller blir dekket med aluminiumsfolie før bruk. </li><li> Fryse alikvoten ampuller som bruker lang håndteres tang nedsenke hetteglass i en flytende nitrogen fylt container umiddelbartetter oppløsningen ble filtrert. </li><li> Overfør de frosne ampuller i en -80 ° C fryser for lagring og fremtidig bruk. </li></ol> 2. Utarbeidelse av negativ farging Workstation og Inkubasjon arbeidsstasjon <ol><li> Tin en ampulle på 1% UF-løsning i et vannbad innstilt ved RT. Kontroller at aluminiumsfolie forblir pakket rundt hetteglasset for å hindre eksponering for lys. </li><li> Filtrer løsningen etter at den er helt tint ved hjelp av en aluminiumsfolie viklet 1 ml sprøyte montert med et 0,02 mikrometer filter. Samle den filtrerte løsningen inn i en ny aluminiumsfolie innpakket hetteglass, og plasserte den på isen inne i en cap dekket isen boksen venter på bruken. </li><li> Gjør løsningen platene ved å skyve en finger ~ 8 cm lang Parafilm arket på overflaten av en tom protein krystallisering plate. Det vil generere rader av sirkulære plater med en diameter på ~ 5 mm. Gjør 6 plater i hver rad sted de Parafilm plater på en overflate av flat is inni en is inneholdeeh lokk, som et farge arbeidsstasjon. </li><li> Pipette ~ 35 mL deionisert vann på hver av venstre tre plater i hver rad, og pipette ~ 35 mL filtrert UF løsning på å rette tre plater i hver rad. Dekk til farging arbeidsstasjon med et lokk for å hindre eksponering for lys før farging proteiner. </li><li> Tilbered en EM rutenett inkubering stasjonen ved å fylle en tom boks halvveis med is, og festet ved siden av en kleshenger som kan monteres på en støtte base. Plasser prøven pinsett i hengeren, der pinsett tips er i nærheten isflaten. Halvparten dekke pinsett &#39;tips av boksen leppe høyde. En ideell isboks å foreta en inkubasjonstid stasjonen bruker en tom pipettespisser beholder. </li></ol> 3. OpNS Operation <ol><li> Glow-lade den tynne karbon film belagt 300 mesh kobber EM nett for 10 sek. </li><li> Plukk opp et rutenett med pinsett og hekt pinsett inn i hengeren ved å holde nettet i 45 ° tilt og en tomme over isenoverflaten inne i inkubasjon stasjonen. </li><li> Fortynn proteinprøven med Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning (DBPS) ved proteinsluttkonsentrasjon på 0,01 ~ til ~ 0,005 mg / ml. Innskudd ~ 4 pl fortynnet prøve umiddelbart etter fortynning på karbon side av EM-rutenettet. (DPBS kan endres til en annen buffer hvis proteinet er følsom for DPBS) </li><li> Inkuber prøven på EM-nett for ~ 1 min inne i inkubering stasjonen. </li><li> Fjern overskudd av oppløsning gjennom raskt å berøre kanten rutenett med filterpapir. </li><li> Trykk på risten hurtig til den første dråpe (~ 35 mL) ren vannflaten på toppen av Parafilm arket rett etter at det overskytende oppløsningen ble fjernet på EM-rutenettet. Og deretter fjerne overflødig vann raskt med filterpapir. </li><li> Gjenta trinn 3.6 for ytterligere to ganger ved å vaske EM rutenett på de to gjenværende vanndråper på Parafilm (trinn 3.6 og 3.7 kan hoppes over hvis prøven er svært følsom for vann). </li><li> Flyte EM grid umiddelbart på overflaten av den første dråpe av UF-løsning rett etter den overskytende vann på EM gitteret ble fjernet. Og deretter inkuberes i 10 sek. Sørg for å fullføre vann vaskeprosedyrer innen 3 sek før flytende rutenettet på overflaten av UF løsning. Jo kortere vasketid, jo bedre kvaliteten være. </li><li> Rengjør pinsett ved å penetrere tips til et filterpapir for ~ 2 - 3 ganger. </li><li> Fjern det overskytende oppløsning på risten gjennom kontakter gitteret kant med filterpapir, og deretter flyte gitteret på den andre dråpe av UF. </li><li> Fortsett foregående trinn 3.10 på den andre dråpe. </li><li> Float rutenettet på den tredje dråpe UF løsning og dekke flekker stasjonen for ~ 1 min. </li><li> Valgfritt trinn: Vask risten raskt til en topp av vann, som beskrevet i 3.6. Dette ekstra trinnet vil gagne prøver som inneholder over lastet gratis gullpartikler eller beis bakgrunn. </li><li> Fjern overflødig oppløsning ved å berøre filterpapiret til the hele nettet bakside (på motsatt side av karbon-siden). Tørk gitteret under en forsiktig strøm av nitrogengass ved RT rett etter observere den absorberende oppløsningen til filteret papir. </li><li> Sett risten på et ark av filterpapir inne i en petriskål, og dekker fatet delvis med et lokk til å tørke i minst 30 minutter i henhold til RT. For noen prøver, plasserer rutenettet i en 40 ° C inkubator baking for en hr. </li><li> Oppbevar rutenettet i en EM grid boks for fremtidig EM undersøke. </li></ol> 4. EM Undersøke <ol><li> Juster TEM skikkelig før EM undersøkelse av små proteiner på rutenettet. <ol><li> Sjekk oppløsningen av høyeste synlig Thon-ring som er kraften spekteret av en amorf karbon film for å finne ut om TEM er riktig justert. Siden TEM deles av mange forskjellige brukere, TEM ble ofte ikke riktig justert. </li><li> Kontroller nøye effektspekteret på karbon film område av prøven for å tilpasse justeringen condition av maskinen. De høyeste synlige Thon-ringene er bedre enn målrettet oppløsning. MERK: Som et eksempel på en riktig justering av et filament LaB6 TEM drives under 120 kV høy spenning, kan mer enn 20 Thon-ringer skal visualiseres, der, kan den tilsvarende oppløsning være bedre enn 5,0 Å. Dette Thon-ring ble oppnådd ved Fourier-overføring av en amorf karbonfilm avbildes under en defokuseringen av ~ 1,6 mikrometer, og en dose på 20,4 e / a2 (figur 5). MERK: Observasjon av den høye oppløsningen Thon-ring er en nødvendig betingelse, men ikke en tilstrekkelig betingelse for riktig justering. Å faktisk oppnå bilder med høy oppløsning, mange andre parametre er også viktige, slik som prøvekvalitet, stråleskade, lading og drivende samt belysningsdosehastighet. </li></ol></li><li> Ta med defokus tilbake til nær-Scherzer fokus for å avbilde de små proteiner på en ideell farget område. </li><li> Søk etter &quot;regn&quot; område å image. En ideell farget område er vanligvis plassert i nærheten av kanten av et tykkere flekkområdet, som ser ut som en &quot;regn&quot; område på risten, siden tykkelsen av flekken er vanligvis ikke jevnt fordelt på karbon-belagt gitter (figur 6). Vanligvis en lav forstørrelse (&lt;100x) var å bidra til å finne disse overskyede områdene først før du zoomer inn for bildebehandling. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Sammenlignet med konvensjonelle NS teknikker, kan OpNS hindre rouleaux artefakter (figur 1 og 9), som gir pålitelig og rimelig høy oppløsning (~ 1nm) strukturelle detaljer av små proteiner (figur 2). Sammenlignet med kryo-EM, gir OpNS en høy gjennomstrømning fremgangsmåte og kan undersøke et bredt utvalg av proteiner og protein-protein interaksjoner 6. Imidlertid har OpNS fremdeles sine ulemper. Sammenlignet med konvensjonelle NS, innebærer OpNS: i) mer kompliserte trinn i prøven forberedelse; ii) ved hjelp av et radioaktivt stoff, UF; iii) å holde flekken friskt på grunn av den kortere potens av UF-flekken på grunn av sin lysfølsomhet; iv) for å hindre nedbør i UF-løsning skal lagres i -80 ° C og krever tining før bruk; v) og til slutt alle UF skal håndteres som farlig avfall. Sammenlignet med cryo-EM, gir OpNS relativt lavere oppløsning og ingen garanti for noen ennå ikke oppdaget artefakti fremtiden. NS drift prosessuelle effekter på lipoprotein rouleaux dannelse NS protokoller for å forberede proteiner for undersøkelse 16,29-36,55 kan deles inn i tre hovedgrupper av metoder 50: Blandings 55, drop-by-slipp 16, og vaskeprosedyrer 29. i) blande protokollen krever den innledende blanding av flekken og proteinprøven med en bestemt forhold, og deretter påføre den blandede løsning til karbonfilm belagt på et rutenett, endelig fjerning av overskytende løsning med filterpapir før lufttørking for EM-undersøkelse 55. ii) drop-by-slipp-protokollen innebærer å bruke (~ 4 mL) prøve dråpe direkte til et EM rutenett belagt i karbon la sit for ~ 1 min, deretter fjerne overflødig prøveløsningen før påføring av en dråpe (~ 4 mL) av flekken Løsningen på den samme side av gitteret. Etter ~ 1 min av inkubasjon fjerne excess flekken gjennom kontakt med rent filterpapir, endelig sender for lufttørking 16,56-58. iii) vasking protokollen (figur 7) som krever prøveoppløsning søknad til en EM rutenett belagt på karbon i 1 min, og deretter vasket med deionisert vann tre ganger i rett etter fjerning av overskytende løsning hver gang av filterpapir 3,29,30. OpNS protokollen ble endret fra denne vaskeprosedyren. NS typer beis og effekter på lipoprotein rouleaux dannelse I NS, sterkere elektron spredning på grunn av heavy metal flekker gi kontrast fra proteiner 17-20,59. NS prøvene kan i tillegg lider større stråledoser, og forbedre protein funksjoner ved et skarpere negativ kontrast 8,9,60. Flekker av tungmetaller kan klassifiseres som: anioniske, inkludert Fosfovolframsyre (PTA) 16, -metylamin tungstate 14 og silisium tungstate 61; og kationic, for eksempel Uranyl acetat (UA) 62, UF 3,29,30, og uranylnitrat- (FN) 63. En av de anioniske NS flekker som er mest brukt er PTA 33,64-67. PTA er en heteropoly syre, som brukes vanligvis rundt en pH 7,0 til 7,5. PTA kan også brukes til positiv farging 3,16,68. De negative anklager om PTA kan megle elektrostatiske interaksjoner med umettede lipider positivt ladede hode grupper, som POPC, på begge lipoprotein og liposomprøvene overflater. PTA kan forårsake rouleaux formasjon gjennom denne interaksjonen 29,30 selv under vanlig buffer saltholdighet 29,30 (figur 1). Uranyl flekker, som UA, UF og FN er alternative valg for kationiske tungmetaller flekker og UA særlig brukes ofte for NS av en rekke biologiske prøver 62,69,70. Forsøk funnet UF forårsaker ingen rouleaux av lipoproteiner som inneholder umettede fett syre lipider, slik som POPC. Imidlertid kan UF fremdeles indusere rouleaux formasjon på lipoprotein som inneholder mettede fettsyrelipider, for eksempel dimyristoyl-fosfatidylkolin (DMPC) og 1-hexadecanoyl-2-octadecanoylklorid-sn-glycero-3-fosfocholin (PSPC). Den detaljerte mekanisme av denne interaksjonen er ukjent. UA / UF / FN kan alt arbeid ved lavere pH-verdier spenner 3,5 til 4,6. Slike lavere pH-verdier kan ikke egnet for visse biologiske makromolekyler som er følsomme for pH 14,71. Interessant nok kan UA / UF fikse proteinstruktur i løpet av noen få millisekunder gjennom en ukjent mekanisme 72. I motsetning PTA, er UA / UF mer lik et salt enn en syre. UF velig kan gi bedre resultater enn UA 73, der, UF og FN flekker har mindre kornstørrelser enn UA (UF: 0.3 nm, FN: ~ 0,5 nm) 3,74. Et interessant eksempel sekundærstrukturlignende detaljene i et lite protein (53 kDa CETP) kan visualiseres direkte fra rå mikrografer når UF ble brukt som negativ-flekk-reagens ved å følgetidligere rapporterte kryo-positiv-farging (cryo-PS)-metoden (figur 8) 6. I Cryo-PS, farget prøven var flash frosset ved å følge cryo-EM prøveopparbeidelse prosedyre i stedet for tørkeprosedyren i OpNS protokollen, noe som kan føre til at sekundære strukturell kollaps. Den kryo-PS er en fremgangsmåte for høy kontrast og høy oppløsning avbildning av små proteiner 75. Siden Cryo-PS bildene har snudd kontrast i forhold til de fra den rapporterte cryo-NS protokoll 22, men har konsekvent bilde kontrast til de fra konvensjonelle cryo-EM bilder, slik at det ble kalt cryo-PS metoden. Den kryo-PS-bilder viser at det farvende reagens, Uranyl formiat, trenger inn i den molekylære overflaten, utfordrende den konvensjonelle oppfatning av at fargingen kan visualisere kun den ytre overflatestruktur. Mekanismen for hvordan Uranyl formiat penetrerer den molekylære overflaten er ukjent. En mulighet er at den Uranyl kation binder tilgjengelige protein karboksylgrupper, og dermedomgivende glasslegemet is er av lavere tetthet enn farging av proteinet og uranyl grupper, for derved å fungere som en positiv flekk. Den kryo-PS metoden er lik multippel isomorf erstatning (MIR)-metoden, noe som var en vanlig tilnærming for å løse problemet fase i røntgenkrystallografi 76-78. I MIR, er krystallprøver dynket med en tung atom løsning, inkludert uran, for å få en isomorphic skjema til sin opprinnelige form. Tillegg av den tunge atom noen ganger påvirker ikke krystalldannelse eller enhetscelle dimensjoner, men gir ytterligere informasjon av krystallstrukturbestemmelse 76-78. Ved å dra nytte av de små korn av UF, kan kryo-PS gi en høy kontrast og høy oppløsning av et enkelt protein, noe som er viktig for proteinstrukturstudier, spesielt tatt i betraktning at nesten alle proteiner som er naturlig dynamisk og heterogene i løsning. For validering av denne Cryo-PS-metoden, åpner vi for noen blindtest fra EM-feltet. </p&gt; Saltkonsentrasjon virkninger på rouleaux formasjonen i lipoproteiner Bruke tradisjonell PTA negativ farging reagens, er observert rouleaux dannelse mer sannsynlig relatert til lipid interaksjoner i stedet for protein interaksjon. Imaging prøver av POPC liposom-vesikler fremstilt under betydelig saltinnhold (0,5 M NaCl), middels salinitet (0,25 M NaCl), relativt svake saltinnhold (0,1 M NaCl), og renset vann (figur 9), er elektronmikrografer viser rouleaux dannelsen var korrelert til saltkonsentrasjon (figur 9A - D). Ved hjelp av UF som negativ farging reagens, ble det ikke observert i rouleaux POPC liposom-vesikkel prøven 30 (Figur 2L), noe som tyder på at vaskeprosedyren for raskt å redusere saltkonsentrasjonen rett før farging er en nødvendig, men ikke tilstrekkelig uavhengig skritt for å hindre rouleaux i POPC relatert prøver. TEM bildebehandling lite protein krever en nær-Scherzer fokus tilstand. Vellykket TEM avbildning av små proteiner med høyere oppløsning krever to kritiske forhold, en skikkelig strålejustering og en nær-Scherzer fokus oppkjøpet tilstand. i) En riktig stråleinnretning kan bli bedømt ved antall synlige Thon ringer (effektspekter) på Fourier overføring av et filmbilde karbon anskaffet under et forholdsvis høyt for uskarp. Jo bedre justeringen tilstand av strålen, kan jo flere Thon ringene bli visualisert og målbar .. ii) Innhente bilde under en nær-Scherzer fokus er et annet kritisk tilstand. En tradisjonell standard strategi for avbilding av biologiske prøver som vanligvis benytter høy defokuseringen (1 - 2 um og enda mer), som kan øke den biologiske prøven bildekontrasten 79. Denne strategien er vesentlig forskjellig fra den typiske strategi for avbilding av atomstrukturen oppløsning av harde materialer, som oftebenytter en nær Scherzer fokus (~ 50 nm uskarp). Selv om, kan en høyere styrke defokuseringen biologisk prøve kontrast, vil høy oppløsning signaler være delvis elimineres. Som et resultat, ville medvirkning av høyoppløselig signal være lavere ved høyere uskarp avbildning tilstand. Grunnen er at den TEM bildet er foldingen av prøven struktur og instrumentet CTF. Den CTF er en oscillerende kurve mot frekvens, hvor kurven ofte oscilleres krysser null amplitude ved høy frekvens. Hver gang når CTF over null, prøven strukturelle signal ved denne spesifikke frekvens vil bli eliminert (null hvilket som helst antall ganger vil være null). Den eliminert signal ved denne frekvens aldri kan utvinnes ved en hvilken som helst CTF korreksjonsalgoritme (en null dividert med en null kan være en hvilken som helst tilfeldig tall i stedet for den opprinnelige strukturelle signal). Under høyere uskarp avbildning, vil CTF oscillere mye mer aggressivt, krysser således CTF null amplitude oftere, som et resultat,de strukturelle signaler ved et større antall bestemte frekvenser vil bli eliminert. Jo flere signaler som elimineres, jo mindre medvirkning bildet vil ha. Spesielt, kan medvirkning av bildet ikke bli gjenvunnet eller korrigeres av noen CTF korreksjon. Imidlertid kan brukes en rekke ufullstendig bilde ervervet under forskjellige uskarp å fylle sine hull til hverandre for å oppnås et ferdig konstruksjons signal av prøven strukturen via en gjennomsnittsmetoden, hvor enda en atom oppløsning kan oppnås 9-12. Den gjennomsnitt-metoden er en kraftig metode for å oppnå strukturen av noen svært symmetriske proteiner og som er strukturelt beslektet stive proteiner. Imidlertid gjenstår det en utfordring i det strukturelle studier av små og asymmetriske proteiner, spesielt for strukturelle dynamikk og fleksible proteiner, slik som antistoffer og HDL. Gjennomsnitt er basert på antagelsen om at proteinpartikler er identiske i struktur og konformasjon men different i orientering, er imidlertid mange proteiner kjent for å gjennomgå termodynamisk svingninger i løsning. Ved bruk av gjennomsnittsmetoden uten tidligere å vite proteintermodynamiske svingninger svingninger, kan den gjennomsnittlige strukturen forårsaker ofte mangler domener 10,80 eller lokal variasjon i oppløsning 81 i cryo-EM rekonstruksjoner. Det lykkes i å oppnå den 3D rekonstruksjon av små proteiner, slik som 53 kDa CETP, og 3D-struktur av et enkelt protein, slik som 160 kDa IgG1 antistoff, drar fordel ved å bruke nær-Scherzer fokusavbildning tilstand under et riktig justering tilstand. Selv om bildekontrasten virker lav i nær-Scherzer fokus bilder, kan kontrasten lett bli forbedret ved ganske enkelt å anvende et lavpass-filtrering for å redusere høyfrekvent støy i bakgrunnen. Vi tror, ​​nær-Scherzer fokusere bildene bære de maksimale strukturelle signaler, og kan øke nøyaktigheten av partikkel justering og forbedre enereffektivitet i single-partikkel 3D rekonstruksjon og enkelt partikkel electron tomography gjenoppbygging.

Forstå protein funksjonen krever kunnskap om proteinstruktur. Strukturbestemmelse er utfordrende for proteiner som molekylær massene er innenfor 40-200 kDa. Røntgenkrystallografi er begrenset av protein krystallisering; kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi er begrenset til molekylmasser mindre enn 40 kDa, mens kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har vanskeligheter både bildeopptak og tredimensjonale (3D) rekonstruksjoner av små proteiner, som molekylære masser er mindre enn 200 kDa. Spesielt, mer enn 50% proteiner har en molekylvekt innen området fra 40 til 200 kDa 1,2, som dagens metoder er utfordrende å studere proteiner av denne størrelse, er en ny metode nødvendig. Selv om de fleste transmisjonselektronmikroskop (TEMS) er i stand til atom-oppløsning, det vil si bedre enn tre en løsning, å oppnå enda en nær nanometer oppløsning struktur fra en biologiske prøver er heller Challenging 7. Stråleskader, lav kontrast, strukturelle avvik, samt gjenstander som dehydrering alle hindre høy oppløsning TEM avbildning 3,8. Blant ulike TEM tilnærminger, er cryo-EM en avansert og nyskapende metode for å oppnå atom oppløsning strukturer av svært symmetriske store makromolekyler i henhold nærheten fysiologiske forhold 9-12. Den kryo-EM prøve fremstilles flash-frysing prøveløsningen, innebygging av makromolekyler i glasslegemet is, som deretter avbildes ved kryogene temperaturer slik som flytende nitrogen eller heliumtemperatur 13. Cryo-EM er en fordel i at prøvene presentere ingen artefakter og er nesten innfødte i struktur 8-12. Cryo-EM har sine ulemper: i) flere enheter kreves for å bli installert eller kjøpt for å oppgradere en standard TEM instrument for en cryo-EM evne. Enheter inkluderer: anti-contaminator, cryo-holder, lavdose-modus programvare og lavdose sensitive CCD-kamera, selv om prisene på disse enhetene er mye lavere enn prisen på TEM instrument i seg selv; ii) cryo-EM drift trenger lengre tid enn NS drift. Undersøke en cryo-EM prøven ofte krever lengre tid til å forberede prøver og drive TEM instrument enn NS fordi cryo-EM krever adressering ytterligere vanskeligheter, inkludert: flytende nitrogen temperatur drift, sample lading, bildebehandling drift, temperaturgradienter, low-dose modell drift, sample stråling følsomhet og dosering begrensninger. Disse ekstra trinn vil senke hastigheten for å anskaffe nyttige data i forhold til NS datainnsamling, selv om noen få cryo-EM bilder kan sikkert fås i 1 time eller mindre av cryo-EM eksperter med instrumentet forberedt med en balansert temperaturgradient; iii) brukere trenger ekstra opplæring, for eksempel håndtering av flytende nitrogen, frysing cryo-EM rutenett, lavdose drift, dose måling, håndtering lade, drivende og kunnskap i bildebehandling procEssing; iv) mangel på repeterbare bildebehandling for de samme Cryo-prøven under forskjellige TEM økter. Cryo-EM prøver blir lett skadet av is forurensning under prøven lasting og lossing til / fra TEM instrument. Denne skade er spesielt et problem når prøvene er vanskelige å bli isolert / renset 14; v) små proteiner (&lt;200 kDa molekylvekt) er utfordrende å bli avbildet på grunn av lav kontrast; vi) lav kontrast og høy støy av kryo-em-bilder reduserer krysskorrelasjonsverdi mellom bilder, og derfor redusere nøyaktigheten i bestemmelse av protein orienteringer, konformasjoner og grupperinger, spesielt for proteiner som er strukturelt fleksibel og naturligvis svinge i løsningen 4,5. Negativ farging (NS) er et relativt &quot;gamle&quot; og historisk metode som helst laboratorium, med hvilken som helst type EM, kan utnytte for å undersøke protein-strukturen. Brenner og Horne først utviklet konseptet of negativ farging et halvt århundre siden for å undersøke virus 15. NS oppnås gjennom belegg prøven med ladede tunge metallsalter. Dette konseptet opprinnelig kommer fra lysmikroskopi og praksisen med å bygge bakterier inn i en flekk løsning som gir mørke rundt prøvene, slik at høyere bilde kontrast når du ser det negative bildet 16. Siden de tunge metall-ioner har en større evne til å dispergere elektroner i forhold til mindre tette atomer i proteiner 17 til 20, og belegget tungmetall flekken tillater en høyere dose begrensning med forbedret kontrast. NS prøven kan gi bilder med høy kontrast 8 for enklere partikkel orientering besluttsomhet og 3D rekonstruksjon enn bilder fra cryo-EM. Tradisjonelle NS, dessverre, kan produsere gjenstander indusert av flekken-protein interaksjoner, for eksempel generell samling, molekylær dissosiasjon, flatere og stabling 8,21,22. For lipid relatert proteins, så som lipoproteiner 16,23-30, en felles gjenstand resulterer i partikler som er stablet og pakket sammen til en rouleaux (figur 1) 31-36. Mange lipoprotein studier, som nondenaturing polyakrylamid gradient gel elektroforese, studerer cryo-EM 13,29,37-40, massespektrometri 39,41, og små vinkel røntgendiffraksjon data 42 alle showet lippoproteinpartikler er isolerte partikler i stedet for naturlig stablet sammen danner en rouleaux 21,29,30,35,42-45. Observasjonen av rouleaux dannelse ved konvensjonelle NS er muligens forårsaket av dynamiske vekselvirkninger mellom lipoproteiner sammensatt av apolipo-proteiner (apo) og fosfolipider som er strukturelt fleksibel i løsning 13,29,30,46-49 og følsomhet for standard NS-protokollen. Å identifisere denne gjenstanden ble apolipoprotein E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) high-density lipoprotein (HDL) prøve brukt som en prøve og cryo-EM bilder for en gjenstand gratis standard 29, screening NS prøvene utarbeidet under en rekke forhold. Ved å sammenligne de partikkelstørrelser og former fremstilt av NS, og kryo-EM, ble den spesifikke type av flekker reagens og saltkonsentrasjon funnet å være to viktige parametre forårsaker de kjente rouleaux fenomener. Således ble en optimalisert negativ farging (OpNS) protokoll rapportert. Av OpNS, ble den kjente rouleaux fenomenet apoE4 HDL elimineres ved OpNS (figur 2A). Statistisk analyse viste OpNS utbytter meget lignende bilder (mindre enn 5% avvik) i størrelse og form i forhold til de fra kryo-EM, ble imidlertid kontrasten eliminert. Valideringer av OpNS ble utført ved å undersøke eliminering av rouleaux gjenstand av nesten alle klasser eller subklasser av lipoprotein prøver 6,29,30,50,51, inkludert ApoA-I 7.8 nm (figur 2B), 8.4 nm (figur 2C) , 9.6 nm discoidal rekonstituert HDL (rHDL) (figur 2D), 9.3 nm sfærisk rHDL (2E), human plasma HDL (figur 2F), lipid gratis ApoA-I (figur 2G), plasma HDL (figur 2H), low density lipoprotein (LDL ) (figur 2I), middels-density lipoprotein (IDL) (figur 2J), svært lav tetthet lipoprotein (VLDL) (figur 2K), og POPC liposom (figur 2L) 30. Ytterligere valideringer ble utført av tenkelig små og asymmetriske proteiner, inkludert de 53 kDa kolesteryl ester transfer protein (CETP) (figur 3A - C) 6,29, og svært fleksibel 160 kDa IgG antistoff (figur 4A og B) 4,5,29 , 52, og to strukturelt kjente proteiner, GroEL og proteasomet (figur 2 M og N). For å kreve noen ytterligere kontroll og godkjenning fra colleagues, er vi åpne for eventuelle blindtester på denne OpNS metoden. OpNS som en high-throughput-protokollen er også blitt brukt til å studere protein mekanismen via undersøke hundrevis av prøver av små proteiner, slik som CETP som ble binding til forskjellige proteiner under en serie tilstander (inkludert CETP samspill til fire klasser av lipoproteiner, rekombinert HDL, plasma HDL, LDL og VLDL, med / uten to antistoffer, H300 og N13, under 9 inkubasjonstid, inkludert 3 min, 20 min, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timers, 24-timers, 48 ​​timer og 72 timer, under 4 molare forhold, dvs. 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, og tre fortynninger, dvs. 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml og 0.001 mg / ml, pluss ytterligere kontrollprøver, inkludert CETP alene, LDL alene, og VLDL alene, med trippel tester av ovennevnte eksperimenter av forskjellige personer) 6,29. OpNS bilder av CETP gitt bilder med høy kontrast med rimelig gode strukturelle detaljer; tillater oss å kunne rekonstruere en 3D tetthet kart over 53 kDa SMAll protein CETP (Figur 3D - F) av enkelt partikkel gjenoppbygging. Videre har de høy kontrast OpNS bilder gir oss et tilstrekkelig signal fra en enkelt protein (figur 4A - C), noe som tillot oss å oppnå mellomprodukt-oppløsning (~ 1,5 nm) av et enkelt (ett objekt, uten snitt) IgG-antistoff 3D-struktur via den enkelte-partikkel electron tomography (Ipet) metode (figur 4E - J) 5. Den detaljerte beskrivelsen av Ipet rekonstruksjon strategi, metodikk, trinn-for-trinn-prosesser og strukturelle variasjonsanalyse ble tidligere rapportert fire. En film om Ipet antistoff gjenoppbygging prosedyrer, inkludert RAW-bildene og mellomresultater, 3D tetthet kart og strukturelle docking var også tilgjengelig for offentligheten av lastet opp til YouTube fem. Sammenligning av 3D rekonstruksjoner fra ulike individuelle antistoff partiklene kan avsløre protein dynamikk og conformational endringer i kjemiske reaksjoner 4,5. Tatt i betraktning at over 50% av proteiner har molekylvekt som strekker seg 40 til 200 kDa 1,2, lykkes i å avbilde disse små proteiner dokumentert at OpNS metoden er et nyttig verktøy for å skyve på konvensjonell EM grensen mot små og asymmetriske strukturbestemmelser og mekanisme funn . Således er den detaljerte protokollen gitt som nedenfor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:547px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Stain: Uranyl Formate</td>
			<td style="width:159px;">The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td>
			<td style="width:137px;">02545-AA</td>
			<td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">SYRINGE: 1ML NORM-JECT</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-491</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Syringe filter: 0.2 &#956;m&#160;</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">28145-487</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Syringe filter: 0.02 &#956;m filter (Anotop 10)</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">6809-1002</td>
			<td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:159px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">470152-246</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td>
			<td style="width:159px;">Pacific Grid-Tech</td>
			<td style="width:137px;">Cu-300CN</td>
			<td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">CF200-Cu</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Tweezer: Dumont Tweezer L5</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">72882-D</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Milli-Q Advantage A10</td>
			<td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Filter Paper: Grade 1 circles</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">1001-090</td>
			<td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
			<td style="width:137px;">NA</td>
			<td>Any type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glow Discharge Unit</td>
			<td style="width:159px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:137px;">91000</td>
			<td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-520</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-524</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Filter Tips: VWR Signature 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">37001-528</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Pipet</td>
			<td style="width:159px;">Pipetman</td>
			<td style="width:137px;">F161201 and F167300</td>
			<td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy

Strukturbestemmelse av proteiner er ganske utfordrende for proteiner med molekylmasser mellom 40-200 kDa. Tatt i betraktning at mer enn halvparten av naturlige proteiner har en molekylvekt mellom 40 til 200 kDa 1,2, er et robust og high-throughput-metoden med en nanometer oppløsningsevne er nødvendig. Negativ farging (NS) elektronmikroskopi (EM) er en enkel, rask og kvalitativ metode som ofte er blitt brukt i forskningslaboratorier for å undersøke protein-struktur, og protein-protein interaksjoner. Dessverre, konvensjonelle NS protokoller ofte generere strukturelle gjenstander på proteiner, spesielt med lipoproteiner som danner vanligvis presentere rouleaux gjenstander. Ved å bruke bilder av lipoproteiner fra Cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) som en standard, ble de viktigste parametrene i NS prøveopparbeidelse forhold nylig vist og rapportert som den optimaliserte NS-protokollen (OpNS), en modifisert konvensjonell NS-protokollen tre. Gjenstander som rouleaux kan bli sterkt begrenset av OpNS, i tillegg gir høy kontrast sammen med rimelig høy oppløsning (nær 1 nm) bilder av små og asymmetriske proteiner. Disse høy oppløsning og høy kontrast bilder er også fordelaktig for en individuell protein (et enkelt objekt, uten snitt) 3D-rekonstruksjon, slik som et 160 kDa-antistoff, ved å følge prosedyren i elektron tomografi 4,5. Videre kan OpNS være en high-throughput verktøy for å undersøke hundrevis av prøver av små proteiner. For eksempel, tidligere publisert mekanismen for 53 kDa kolesteryl-ester overføringsprotein (CETP) involvert screening og avbildning av hundrevis av prøver 6. Vurderer cryo-EM sjelden vellykket bilder proteiner mindre enn 200 kDa har ennå ikke publisere noen studie som involverer screening over hundre prøveforhold, er det rimelig å kalle OpNS en høy gjennomstrømming metode for å studere små proteiner. Forhåpentligvis OpNS protokoll som presenteres her kan være et nyttig verktøy for å presse grensene for EM og akselerere EM studier i liten protein struktur, dynamikk og mekanismer.

De implementeringer av OpNS omfatter de strukturelle og morfologiske undersøkelser av forskjellige lipoprotein-arter som: begynnende rekombinante HDL (rHDL), sfærisk rekombinante HDL, plasma-HDL, LDL, VLDL og IDL (figur 2) 30; så vel som små proteiner som 53 kDa CETP (blant de minste proteinene vellykket fotografert gjennom EM) (figur 3) 6 og 160kDa IgG antistoffer (en av de mest dynamiske og heterogene proteiner) (figur 4) 4,5,29,52 , og med 28 kDa lipid fri apolipoprotein A-1 (figur 2 L), og GroEL og Proteasomes (figur 2 M og N). Andre eksempler på OpNS som en high-throughput metode undersøker protein-protein interaksjoner for å avdekke protein mekanismer, som for eksempel 53 kDa CETP. Som beskrevet i innledningen, hvor CETP samhandler med forskjellige underklasser av lipoproteiner ble undersokelserted via undersøke mer enn 400 EM eksemplarer 6 Så vidt vi vet, var det ingen slike et tilfelle av cryo-EM studie som involverer screening nesten hundre forskjellige forhold. OpNS kan utvide EM grenser for å studere liten og asymmetrisk protein 3D-struktur og med utvide å oppnå 3D-strukturen danner en enkel og individuelle protein (uten snitt). For eksempel er IgG-antistoff 160 kDa-molekylet med en meget fleksibel struktur, hvor 3D-rekonstruksjon ved mellomliggende oppløsning er vanskelig å oppnå. den OpNS metoden ble brukt for å avbilde et individ IgG-antistoff fra en serie av tippvinkler (figur 4E og H). De rimelig høy oppløsning og høy kontrast protein bilder fra OpNS tillatt for en vellykket rekonstruksjon av et enkelt protein ved enkelt partikkel electron tomography (Ipet) (figur 4E - J) 4,5. I Ipet 3D rekonstruksjon <sup&gt; 4, ble 2D tilt serie av målrettede antistoff gradvis justert til deres beregnet globalt senter via senere iterativ rekonstruksjon for å oppnå en 3D-tetthet med en oppløsning på ~ 14.1 Å (figur 4F og G) 4. Ved den samme metode, ble en enkelt antistoff-peptid-komplekset rekonstruert, og peptid-indusert det indre domene konformasjonsendring fra en enkelt antistoff-partikkel ble påvist (figur 4I og J, ~ oppløsning 16,6 Å) 4,5. Sammenligning av 3D rekonstruksjoner fra ulike individuelle partikler, kan den strukturelle analysen tillate oss å avsløre proteintermodynamiske svingninger, og selv &quot;snap-shot&quot; de mellomliggende stadier av en kjemisk reaksjon 4,5,29,53,54. I sammendraget, proteiner med molekylvekt mellom 40 kDa - 200 kDa er utfordrende for standard EM strukturelle undersøkelser og rekonstruksjoner. Tatt i betraktning at over 50%av proteiner har molekylvekt som strekker seg 40 til 200 kDa 1,2, avdekker et OpNS Fremgangsmåte som en robust og high-throughput verktøy for å presse den konvensjonelle EM grensen mot små og asymmetriske strukturbestemmelser og selv mekanistiske undersøkelser. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Rouleau gjenstand av lipoproteiner ved konvensjonell negativ farging (NS) EM. Elektronmikrografer (ovenfor paneler) og utvalgte partikler (herunder paneler) viser forskjellige lipoproteiner med rouleaux etter NS med fosforwolframsyre (PTA) under standard blanding prosedyre. (A) rekonstituert HDL (rHDL) med apoE4, (B) ApoA-I-holdige 9,6 nm skiveformede rHDL, (C) apoB inneholdende plasma-LDL, (D) ikke-apolipoprotein-inneholdende liposomer POPC. Barer: 50 nm. Vindusstørrelse: A og C, 20 nm; B, 30 nm. The Journal of Lipid Forskning først publisert dette arbeidet 29,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Protein struktur ved optimalisert negativ farging (OpNS) EM elektronmikro viser ulike lipoproteiner og liposomer uten rouleaux artefakt av OpNS (A) apoE4 holdig rHDL;.. (B) 7.8 nm rHDL, (C) 8.4 nm rHDL; ( D) 9,6 nm rHDL, (E) 9,3 nm sfærisk rHDL, (F) Humant plasma α-HDL, (G) plasma HDL, (H) Humant plasma LDL; (I) Humant plasma IDL, (J) Humant plasma VLDL; <strong&gt; (K) POPC liposom, (L) lipid fri ApoA-I. Tilleggs Verifikasjonen ble gjort ved hjelp av (M) GroEL og (N) Proteasome prøver. Mikrografer (over paneler) og utvalgte partikler (under paneler). Barer: 50 nm. Vindusstørrelse: A - D, 20 nm; E og F, 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; Jeg, 50 nm; J og K, 100 nm; L, 80 nm., Unntatt lipid gratis ApoA-I, GroEL og Proteasome, Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Lipid Forskning 29,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. OpNS elektronmikro av CETP. (A) Oversikt micrograph med CETP (stiplet sirkler) bananformede partikler. (B) WindoweD Velg rå partikler. (C) Tre enkelts rå CETP partikkel bilder som tydelig viser en større, tyngre og større globular tips inkludert den andre mindre, lettere og smalere spiss (venstre panel), topp utsikt viser lignende terminal regioner med mindre samlet kurvatur (midten panel), og slutten utsikt ned den lange aksen av CETP (høyre panel) (D) superimposing krystallstrukturen (PDB:. 2OBD) på disse rå CETP partikkelbilder, matcher godt i både strukturelle form og domene størrelse som viser retningen kan være nesten direkte definert, selv uten hjelp av en datamaskin (tilsvarende paneler til (C).) (E) Referanse frie 2D klasse gjennomsnitt (ab initio prosess for å beregne likhets (krysskorrelasjonsberegnings) i disse tilfeldig orienterte partikler, idet partiklene har en stor likhet til hverandre ble gruppert, justert og deretter i gjennomsnitt for å redusere bakgrunnsstøy og forbedret partikkelbildet contrast. Referanse gratis 2D klasse gjennomsnitt beregnes ved refine2D.py programvare i EMAN pakken, der, ikke noe menneske har gjort første modellen var involvert i denne klassen gjennomsnittet. Referanse klassen gjennomsnitt kan anvendes som en uavhengig fremgangsmåte for å validere 3D rekonstruksjon fra enkeltpartikkeloppbyggingen). (F) som er valgt referanse frie 2D klasse gjennomsnitt viser et større distale ende i forhold til den andre. (G) Superimposed krystallstruktur (PDB : 2OBD) forhold til referanse gratis gjennomsnitt, jo overlay-bilder viser en nær perfekt samsvar mellom krystallstruktur og referanse-gratis klasse gjennomsnittet i både struktur form og domene størrelse (lav panel) (F) 3D tetthet kartet CETP på en. oppløsning på 13 A ble rekonstruert fra 8879 partikler fotografert av OpNS og single-partikkel rekonstruksjon metoden (øverste panel) og ridged-kroppen dokket inn i denne single-partikkel rekonstruksjon av krystallstrukturen (lav panel). DETfeilte informasjon om enkelt partikkel gjenoppbygging, inkludert bilde forbehandling, første modellen, raffinement prosedyrer, vinkel distribusjon og Fourier Shell korrelasjon (FSC) ble publisert i metode delen og saksdokumenter av den opprinnelige papir (H) Slutt sammenligning av enkelt partikkel rekonstruksjon ( over panel) og ytterligere PDB fit sammenligning (nedre panel) 6. Barer: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. Noen av disse tallene ble tidligere publisert i Nature Chemical Biology seks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. OpNS bilder og rekonstruksjoner av human IgG en antistoff partikler. (A) Oversyn på menneske IgG1 antistoff OpNS bilder. Partikler som vises i hvite sirkler tydelig vise partiklene med tre underdomener. (B) Valgt høyoppløselige råbilder av fem individuelle ukonjugerte antistoff partikler og (c) de tilhørende støyreduserte bilder ved manuelt å redusere støy rundt rå partikkel kanten (uten berørings noen tettheten inne i partiklene) for å visualisere lett. (D) Krystallstrukturen (PDB entry 1IGT) av IgG1 antistoff som var rettet mot en tilsvarende visning til de EM-bilder. Sammenligning av de tilsvarende bildene viser mange fellestrekk mellom EM bilde og krystallstrukturen, inkludert domene stillinger og former. (E) Trinnet-til-trinnsfremgangsmåten fra ab initio 3D rekonstruksjon fra en enkelt forekomst IgG1 antistoff (ingen gjennomsnitt ett enkelt objekt) med individuell-partikkel electron tomography (Ipet) metoden. (F) Den endelige 3D rekonstruksjon av en single antistoff partikkel ved en oppløsning på 14,1 Å viste tre smultringformede domenene danner en &quot;Y&quot; form. (G) Dokking domenene krystallstrukturer i hver av tilsvarende domene tetthetskart henholdsvis, og manuelt å gjenta løkkene mellom domenene. (H) Den trinn-til-trinnsfremgangsmåten fra 3D rekonstruksjon av et enkelt IgG-peptid-kompleks (ingen gjennomsnitt, en enkelt objekt) av Ipet. (I) Den endelige 3D rekonstruksjon av et IgG-peptid-komplekset ble vist ved en oppløsning på 16,6 Å viste tre stang formede domener dannes i en &quot;Y&quot; form (J) henholdsvis docking krystallstrukturen av hver IgG antistoff domener (PDB oppføring: 1IGT). inn hver stang form tettheter viste en dårlig matching med domenekrystallstrukturer, noe som tyder på en indre domene konformasjonsendringen etter peptid konjugering. Den detaljerte prosedyre, ble oppløsningen analyse og statistikk som er beskrevet i den opprinnelige papir <sopp&gt; 5 barer: A, 50 nm; B - D, 10 nm. Dette arbeidet først publisert i PLoS ONE 4 og vitenskapelige rapporter fem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5. Strøm spekter av amorft karbon film avbildes underkant av 1,6 mikrometer defokus av en Zeiss Libra 120 LaB6 TEM. Bildebehandling med høy oppløsning krever tilstrekkelig bevis til å vise at EM har riktig justering og høy oppløsning evne. Analysen av effektspekteret for nærliggende karbon-område på gitteret er en effektiv metode for å kontrollere strålen koherens tilstand forut for datainnsamling. Fourier overføring av bildet av et amorft karbon område viser instrumentet relatert kontrastoverføringsfunksjon (C<html> TF), såkalte Thon-ringer. En riktig justering og sammenheng kan bli reflektert av antall synlige Thon-ringer og den høyeste oppløsningen for synlige Thon ringer under en relativt høy defokus tilstand. Som et eksempel på en nær riktig justering tilstanden til en lab 6 filament utstyrt TEM, er mer enn ~ 20 Thon ringer (~ 5 a) kan genereres fra en karbon film avbildes på 1,6 mikrometer defokus bruker dose 20.4 e - / A 2. Thon ringene oppnådd fra en lav-ende TEM har en lik som fra avanserte TEM, slik som en pistol felt-emisjon (FEG) forbedret TEM operert under en riktig justering tilstand. Dette arbeidet først publisert i Scientific Reports fem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figur 6. Eksempel mikrografer av &quot;ideal&quot; områder for OpNS avbildning. Tre proteinprøver, (A) GroEL (B) Proteasome (C) sfæriske HDL ble brukt som eksempler for å demonstrere de ideelle OpNS for avbildning. Siden flekker er ujevnt fordelt i prøven, vises lav forstørrelse av prøven vanligvis &quot;regn&quot; (lengst til venstre). De ideelle områder for avbildning er normalt lokalisert i grensene av disse &quot;skyer&quot;. Et eksempel på trinn-for-trinn-zoom-i-ett &quot;skyet&quot; flekken region (venstre midtre panelet) viser høy forstørrelse bilder presenterer med høy oppløsning og bilder med høy kontrast av partikler (høyre midtpanelet). Utvalgte bilder av partikler viser strukturen detaljer om proteiner (lengst til høyre). Barer:. 30nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig6highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se et stort</a>r-versjon av denne figuren. <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Et skjematisk diagram av OpNS prosedyrer. (A) EM rutenett inkubasjon stasjon, enkel stasjon å ruge prøveløsningen på glow-utladet rutenett. (B) Farging arbeidsstasjon, designet for å opprettholde vannvaskedråper, og beisdråper over isen seng, samtidig som flekken eksponering for lys. (C) Oversikt over fargingsprosedyre, som viser: blotting retning, 3x skylling med vann, 3 x UF flekk eksponering, Staining inkubasjon med invertert prøven rutenett på flekkdråper, og endelig baksiden prøven blotting for å sikre at et tynt lag av prøven flekken løsning før tørking ved nitrogen luft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av th</a>er figur. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8. Høy - oppløsning av 53kDa lite protein CETP åpenbart fra en modifisert OpNS metode, cryo-positiv-farging (cryo-PS) Fem velge høy oppløsning og sirkulær form myke maskerte rå bilder av CETP partikler (med omvendt kontrast). og kornform maskert rå partikler (manuelt redusert støy som omgir rå partikkel bildenes kanter, men uten å endre noen tetthet innenfor de partikler) for å visualisere lett. All-atom og bånd krystallstruktur forhold til maskert rå partikler justert til lignende orienteringer av hver partikkel til EM bilder. De høyoppløselige detaljer om rå bildeområder vise viss likhet med krystallstrukturen, mens ikke alle krystallstruktur funksjoner kan løses fra rådata. Remarka<html> Bly, disse rå bildene viser likhet i både terminal ender med nærliggende små sirkulære hull sett i manuelt redusert bildestøy (trekanter); Videre har strengene i den C-terminale regioner innen partikkel-bilder utfylle krystallstruktur β-ark (piler) og til slutt, utstikkende løkker på CETP C-terminale region er beslektet med i krystallstrukturen (ruter). (A) Fem velger høyoppløselige og sirkulær form myke maskerte rå bilder av CETP partikler (med omvendt kontrast). (B) lavpassfiltrering til 10A. (C) Høyere lavpassfiltrering til 20A. (D) maskert manuelt støy reduserte bilder. (E) Krystallstruktur sammenligning av båndstrukturen. (F) Krystallstruktur sammenligning av alle atom representasjon. Bar: 5 nm. En del av dette arbeidet ble publisert i Nature Chemical Biology seks.lank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" width="500" /> Figur 9. elektronmikro av liposomer som viser rouleau formasjon ved konvensjonell NS-protokollen (PTA flekken) under ulik saltholdighet. (A) Høy salinitet (~ 0.5 M NaCl). (B) Vanlig salinitet (~ 0,25 M NaCl). (C) Lavt saltinnhold (~ 0.1 M NaCl). (D) Rent vann. Mikrografer (over panel) og velg windowed partikler (under panelet) vist. Barer: 100 nm. Vindusstørrelse: 80 nm. The Journal of Lipid Forskning opprinnelig publisert dette arbeidet 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Mer enn halvparten av proteiner er små proteiner (molekylvekt &lt;200 kDa) som er utfordrende for både elektronmikroskop bildebehandling og tredimensjonale rekonstruksjoner. Optimalisert negativ farging er en robust og høy gjennomstrømming protokollen for å oppnå høy kontrast og relativt høy oppløsning (~ 1 nm) bilder av små asymmetriske proteiner eller komplekser under ulike fysiologiske forhold.

Optimalisert negativ farging: en High-throughput Protokoll for Undersøke Liten og Asymmetric Protein struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Research

JoVE Journal

Environment

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Høy gjennomstrømming Fluorometrisk Måling av mulig Jord Ekstracellulære enzymaktivitet

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Eksperimentell protokoll for Manipulere Plant-indusert Soil Heterogenitet

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodal optisk mikros Metoder Avslør Polyp Tissue morfologi og struktur i Caribbean Reef Bygge Koraller

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Semi-High throughput screening for Potential Tørke-toleranse i Salat (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) genmateriale samlinger

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Høy gjennomstrømming Screening av recalcitrance Variasjoner i lignocellulose Biomasse: Total Lignin, lignin Monomers, og Enzymatisk Sugar Slipp

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Administrere og Oppdager Protein Marks på Leddyr for Spredning Forskning

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

En Push-pull-protokollen for å redusere kolonisering av Bird Nest Esker av Honey Bees

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

En protokoll for Innsamling og Constructing Jord Kjerne lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Høy gjennomstrømming, Mikroskala protokollen for analyse av behandling parametere og ernæringsmessige egenskaper i mais (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensjonale (3D)-skrevet mal for høy gjennomstrømning sebrafisk Embryo stiller opp

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...