Name: optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим доктора Микки Ян для редактирования и комментарии, и доктора. Lei Zhang и Бо Пэн за помощью. Эта работа была поддержана Управлением науки, Управления основной энергии наук Соединенных Штатов Министерства энергетики (контракт No. DE-AC02-05CH11231), Национального сердца, легких и крови Института Национальных Институтов Здоровья (нет . R01HL115153), и Национальный Институт общей медицинских наук Национальных Институтов Здоровья (нет. R01GM104427).

1 Получение Свежий отрицательного окрашивающим раствором в количестве 1% (вес / объем) <ol><li> Положите 1 мг уранила формиат (UF) порошок в стеклянной бутылке, содержащей 100 мл деионизированной воды в темной комнате или коробке. </li><li> Раствор перемешивают O / N в РТ в темной комнате / коробке. Оберните бутылку решение с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить свет от удара решение. </li><li> Фильтр раствор осторожно через 0,2 мкм (размер пор) фильтр, установленный на 5 мл шприца. Отфильтрованный раствор собирали в нескольких из алюминиевой фольги, покрытых пробирки Фалкон. Фильтр шприц также должны быть обернуты алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить попадания света. </li><li> Фильтр решение снова через 0,02 мкм (размер пор) фильтра, установленного на 1 мл шприц. Отфильтрованный раствор собирали и аликвоты по 2 мл в ампулах. В шприцы и флаконы прикрываясь алюминиевой фольги перед использованием. </li><li> Немедленно заморозить аликвоту флаконов, используя длинной ручкой пинцета погрузив флаконов в жидком азоте заполнено контейнерепосле того, как раствор фильтруют. </li><li> Перенесите замороженных флаконов в -80 ° C морозильник для хранения и дальнейшего использования. </li></ol> 2 Получение отрицательного окрашивания Workstation и инкубации Workstation <ol><li> Оттепель флакон 1% раствора UF на водяной бане при комнатной температуре. Убедитесь, что алюминиевая фольга остается обернуты вокруг флакона с целью предотвращения воздействия света. </li><li> Фильтр решение после его полностью оттаять с помощью алюминиевой фольги завернутые 1 мл шприц, установленный с фильтром 0,02 мкм. Соберите отфильтрованный раствор в новой алюминиевой фольги, обернутой флакон, и положил его на льду внутри крышки покрыты ледовой коробке ждет использования. </li><li> Сделайте раствор пластины пальцем, нажав ~ 8 дюймовый долго парафильмом лист на поверхность пустой кристаллизации белка пластины. Он будет генерировать ряда круглых пластин диаметром ~ 5 мм. Сделайте 6 пластин в каждом ряду место парафильмом плиты на поверхности уплощенной льда внутри льда содержатьэ крышка, в качестве рабочей станции окрашивания. </li><li> Пипеток ~ 35 мкл деионизированной воды на каждый из оставшихся трех пластин в каждой строке, и пипеток ~ 35 мкл отфильтрованного раствора UF на правой трех пластин в каждой строке. Накройте рабочую станцию ​​окрашивания с крышкой для предотвращения попадания света перед окрашиванием белков. </li><li> Подготовка EM сетки инкубации станции путем заполнения наполовину пустой коробки со льдом, и выдерживать рядом с вешалкой, которые могут быть установлены на опорном основании. Поместите образец пинцетом в вешалке, в которой советы пинцет »находятся неподалеку поверхность льда. Половина покрытия советы пинцет »от высоты коробки губ. Идеальный коробка льда, чтобы сделать инкубационный станции использует пустую советы Внесите контейнер. </li></ol> 3 маркировок Эксплуатация <ol><li> Тлеющего разряда тонкая углеродная пленка с покрытием 300 сетки меди EM сеток в течение 10 сек. </li><li> Возьмите сетку с помощью пинцета и крючком пинцетом в вешалку, сохраняя сетку на дюйм 45 ° наклона и 1 выше льдуПоверхность внутри инкубационного станции. </li><li> Развести образца белка с Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (ППД) в конечной концентрации белка ~ 0,01 до ~ 0,005 мг / мл. Депозит ~ 4 мкл разбавленного образца сразу же после разбавления по углерода стороне EM сетки. (DPBS могут быть изменены в другой буфер, если белок чувствителен к DPBS) </li><li> Выдержите образец на сетках ЭМ для ~ 1 мин внутри инкубационного станции. </li><li> Удалить избыток раствора через быстро касаясь сетки край с фильтровальной бумагой. </li><li> Нажмите на сетку быстро первой капли (~ 35 мкл) чистого поверхности воды поверх листа Parafilm сразу после того, как избыток раствора удаляют на EM сетки. А потом удалить лишнюю воду быстро фильтровальной бумагой. </li><li> Повторите шаг 3,6 в течение еще два раза путем промывки сетки ЭМ на остальных двух капель воды на парафильмом (Шаг 3,6 и 3,7 могут быть пропущены, если образец очень чувствительна к воде). </li><li> Float ЭМ гриD сразу на поверхности первой капли раствора UF справа после избытка воды на сетке EM был удален. А потом инкубировать в течение 10 сек. Убедитесь, чтобы закончить процедуру мытья воды в пределах 3 сек до плавающей сетки на поверхности раствора UF. Чем короче время стирки, тем лучше качество будет. </li><li> Очистите пинцеты, проникая ее концы в фильтровальную бумагу для ~ 2 - 3 раза. </li><li> Снимите излишки раствора на сетке через контакт сетки край с фильтровальной бумаги, а затем плавают сетку на второй капли UF. </li><li> Продолжить выше шаг 3,10 на втором капли. </li><li> Float сетку на третьей капли раствора UF и самого окрашивания станцию ​​для ~ 1 мин. </li><li> Дополнительный этап: мыть сетку быстро на верхней части воды, как описано в 3.6. Этот дополнительный шаг пойдет на пользу образцы, содержащие более нагруженных свободных частиц золота или пятен фоне. </li><li> Снимите излишки раствора, коснувшись фильтровальную бумагу к йВесь электронной сетки задней (напротив углерода стороне). Сушат сетку в слабом токе азота при комнатной температуре сразу после наблюдения поглощающего к фильтровальной бумаге раствором. </li><li> Поместите сетку на листе фильтровальной бумаги внутри чашки Петри, и самого блюдо частично с кепкой, чтобы высохнуть в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. Для некоторых образцов, поместите сетку в 40 ° С инкубатор выпечки в течение часа. </li><li> Храните сетку в сообщение сетки окна EM для будущего EM изучения. </li></ol> 4 EM экспертизы <ol><li> Совместите ПЭМ должным образом перед EM экспертизы малых белков на сетке. <ol><li> Проверьте разрешение высшего видимого Тон-кольцо, которое является спектр мощности аморфной углеродной пленки для определения ТЕА был выровнен. С ТЕА разделяют многие разных пользователей, ТЕА часто не выровнены. </li><li> Тщательно проверьте спектр мощности на площади углеродной пленки образца для выравнивания отелю обн машины. Самые высокие видимые Тон кольца лучше, чем целевой резолюции. Примечание: В качестве примера правильного выравнивания LaB6 нитей, работающим в соответствии ТЭМ 120 кВ высокого напряжения, более 20 Тон кольца могут быть визуализированы, в котором, соответствующее решение может быть лучше, чем 5,0 Å. Это Thon кольцо было достигнуто переводом Фурье аморфной углеродной пленки изображаемого под расфокусировки ~ 1,6 мкм и дозе 20,4 электронной / a2 (рисунок 5). ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдение высокого разрешения Тон-кольца является необходимым условием, но не достаточным условием для правильного выравнивания. Чтобы действительно достичь изображения с высоким разрешением, многие другие параметры также важны, как качество образца, радиационное повреждение, зарядки и дрейфующего а также мощности дозы освещения. </li></ol></li><li> Принесите расфокусировки обратно в ближайшем Scherzer фокусе для визуализации малых белков на идеально витражного области. </li><li> Поиск &quot;облачного&quot; области к ИМАГэ. Идеально окрашивали площадь, как правило, находится на краю более толстым области пятен, которая выглядит как &quot;облачный&quot; области на сетке так как толщина пятна, как правило, не равномерно распределены по угольной пленкой сетки (рисунок 6). Обычно малое увеличение (&lt;100x) было помочь найти эти мутные области, прежде чем масштабирования для визуализации. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Понимание функции белка требует знания структуры белка. Структурное определение является сложной задачей для белков, молекулярная массы в пределах 40 - 200 кДа. Рентгеновской кристаллографии ограничено кристаллизации белка; ядерного магнитного резонанса (ЯМР) ограничивается молекулярными массами менее 40 кДа, в то время как крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) испытывает трудности в обоих получения изображений и трехмерных (3D) реконструкций небольших белков, которые молекулярные массы являются менее чем 200 кДа. Следует отметить, что более 50% белки имеют молекулярную массу в пределах от 40 - 200 кДа 1,2, а в настоящее время методы являются сложными в изучении белков такого размера, новый метод не требуется. Хотя большинство просвечивающей электронной микроскопы (TEMS) способны атомным разрешением, то есть, лучше, чем 3 резолюции А, достижения даже вблизи структуру нанометровым разрешением от биологического образцов довольно ChallenГинг 7. Радиационные повреждения, низкая контрастность, структурные отклонения а также артефакты, такие как обезвоживание все препятствовать высоким разрешением ТЕМ изображений 3,8. Среди различных подходов ТЕМ, крио-ЭМ является передовым и резки метод край для достижения атомные структуры разрешением высокой симметричных крупных макромолекул в условиях, близких физиологических условиях 9-12. Образец крио-ЭМ получают вспышку замораживание раствора образца, встраивания макромолекул в стекловидного льда, который затем отображаемого при криогенных температурах, таких как жидкий азот или гелий температурах 13. Cryo-EM выгодно тем, что образцы не представляют артефакты и почти родной в структуре 8-12. Cryo-EM имеет свои недостатки: я) дополнительные устройства, необходимые для установки или приобрести обновить стандартный ТЕМ инструмент для возможности крио-ЭМ. Устройства включают в себя: анти-загрязнитель, крио-держатель, режим программного обеспечения низкой дозы и низкой дозы Sensiный ПЗС-камера, хотя цены этих устройств значительно ниже, чем стоимость самого инструмента ТЕА; II) операция крио-ЭМ нужно больше времени, чем операции NS. Исследование образца крио-ЭМ часто требуется больше времени, чтобы подготовиться образцы и работать ТЕА инструмент, чем у NS потому крио-ЭМ требует решения дополнительных трудностей, в том числе: жидкого работы температуры азота, образца зарядки, дрейфа изображений, температурных градиентов, низких доз Модель функционирования, чувствительность излучения образца и ограничения лекарственные. Эти дополнительные шаги будут замедлять скорость приобретения полезных данных по сравнению с приобретением данных NS, хотя несколько изображений крио-ЭМ, безусловно, может быть получена в 1 ч или менее эксперты крио-ЭМ с прибором, подготовленного со сбалансированной градиента температуры; III) пользователи нуждаются в дополнительной подготовке, например, обработки жидкого азота, замораживание крио-ЭМ решеток, рабочих низкой дозы, измерение дозы, обработки зарядку, дрейфующих и знания в визуализации прокэссинга; IV) отсутствие повторяемости изображений для тех же крио-образца во время различных сессий ТЕМ. Крио-EM образцы быстро выходят из строя в результате загрязнения льда во время образца погрузки и разгрузки к / от инструмента ПЭМ. Это повреждение особенно проблемой, когда образцы трудно быть выделено / очищено 14; V) маленькие белки (&lt;200 кДа молекулярная масса) являются сложными для включения в образ из низкой контрастностью; VI) с низким и высоким контрастом шум крио-ЭМ изображений уменьшает значение взаимной корреляции между изображениями, таким образом, уменьшая общую точность при определении белковых ориентаций, конформации и классификаций, особенно для протеины, которые структурно гибким и, естественно, колеблются в растворе 4,5. Отрицательный окрашивание (NS) является относительно «древний» и исторический метод, который любой лаборатории, с любым типом EM, могут использовать для изучения структуры белка. Бреннер и Хорн впервые разработал концепт Oе отрицательное окрашивание полвека назад для изучения вирусов 15. NS осуществляется через покрытие образца с заряженными солями тяжелых металлов. Эта концепция изначально идет от световой микроскопии и практике внедрения бактерий в пятно решение, обеспечивающее тьму вокруг образцов, что позволяет более высокую контрастность изображения при просмотре негативный образ 16. Так как ионы тяжелых металлов имеют большую способность для разгона электронов по сравнению с менее плотными атомов в белках 17-20, и покрытие тяжелых металлов пятно позволяет более высокой дозировке ограничение с улучшенной контрастностью. NS образец может обеспечить высокую контрастность изображения 8 для облегчения определения ориентации частиц и 3D реконструкции, чем изображения с крио-ЭМ. Традиционные NS, к сожалению, может производить артефакты, вызванные пятно-белковых взаимодействий, таких как генеральной совокупности, диссоциации молекул, сплющивание и укладки 8,21,22. Для окисления липидов, связанных с защмодули, такие как липопротеины 16,23-30, общий артефакт приводит частиц, которые укладываются и упакованные вместе в ROULEAUX (Рисунок 1) 31-36. Многие исследования липопротеинов, такие как нативных полиакриламидном градиентного гель-электрофореза, крио-ЭМ изучает 13,29,37-40, масс-спектрометрии 39,41 и малый угол дифракции рентгеновских лучей данных 42 все частицы липопротеинов показывают единичные частицы, естественно, вместо сложены вместе, образуя ROULEAUX 21,29,30,35,42-45. Наблюдение образования монетных столбиков с помощью обычных NS, возможно, вызваны динамических взаимодействий между липопротеинами, состоящих из аполипопротеинов (APO) и фосфолипидов, которые структурно гибким в растворе и чувствительностью 13,29,30,46-49 со стандартным протоколом NS. Чтобы определить этот артефакт, аполипопротеина E4 (apoE4) пальмитоил-oleoylphosphatidylcholine (POPC) липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) образец были использованы в качестве опытного образца и криоЭм изображения артефакта бесплатно стандарта 29 скрининга образцов NS подготовленные в рамках ряда условий. При сравнении размеров и формы частиц, полученных из NS и крио-ЭМ, конкретный тип окрашивающего реагента и концентрации соли Было обнаружено, что две ключевые параметры, вызывающие хорошо известные ROULEAUX явления. Таким образом, было сообщено оптимизирован отрицательное окрашивание (маркировок) протокол. По маркировок, известно ROULEAUX явление ApoE4 HDL был ликвидирован маркировок (рисунок 2А). Статистический анализ показал, маркировок урожаи очень похожие изображения (менее 5% отклонения) в размере и форме по сравнению с теми, от крио-ЭМ, однако контраст был ликвидирован. В валидации из маркировок проводились путем изучения ликвидацию монетных столбиков артефакта почти всех классов или подклассов образцов липопротеинов 6,29,30,50,51, в том числе апоА-I 7,8 нм (Рисунок 2B), 8,4 нм (рис 2С) , 9,6 нм гiscoidal воссоздана HDL (рЛВП) (Рисунок 2D), 9,3 нм сферической рЛВП (Рисунок 2E), человеческой плазме ЛПВП (Рисунок 2F), липидов бесплатно апоА-I (Рисунок 2G), плазменный HDL (Рисунок 2H), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП ) (Рисунок 2I), средней плотности липопротеинов (IDL) (Рисунок 2J), очень низкой плотности липопротеинов (ЛПОНП) (Рисунок 2K), и POPC липосомы (Рисунок 2 л) 30. Дополнительные валидации были выполнены визуализации малых и асимметричные белки, в том числе 53 кДа белок передачи эфиров холестерина (CETP) (Рисунок 3A - C) 6,29, и очень гибкий 160 кДа IgG антитела (рисунок 4А и В) 4,5,29 , 52, и два структурно известные белки, GroEL и протеасомы (рисунок 2 М и N). Для требуя дополнительной проверки от сolleagues, мы открыты для любых слепых тестах на этом методе маркировок. Маркировок, как это протокол с высокой пропускной также используется для изучения механизма белка с помощью изучения сотен образцов малых белков, таких как СЕТР, который был связывания с различными белками в соответствии с условиями серии (в том числе СЕТР взаимодействующих с 4 классами липопротеинов, ЛПВП рекомбинации, плазмы ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП, с / без 2 антител, H300 и N13, по времени 9 инкубации, в том числе 3 мин, 20 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 24 часов, 48 часов и 72 часов, 4 под молярные отношения, то есть 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, 3 и разведения, т.е. 0,1 мг / мл, 0,01 мг / мл и 0,001 мг / мл, плюс дополнительные контрольные образцы, в том числе одна СЕТР, одна ЛПНП, и ЛПОНП в одиночку, с тройным испытаний выше экспериментов разными лицами) 6,29. Маркировок образы ПООППО условии высокую контрастность изображения с достаточно мелкими деталями строения; позволяет нам успешно реконструировать 3D карту плотности 53 кДа SMALL белок СЕТР (Рисунок 3D - F) по реконструкции одного частиц. Кроме того, высокая контрастность маркировок изображения обеспечивают нам достаточное сигнал от отдельного белка (Рисунок 4А - C), что позволило нам добиться промежуточного разрешение (~ 1.5 нм) из одного (одного объекта, не средняя) IgG антитела 3D структуру с помощью метода (Рисунок 4E - J) индивидуально-частиц электронной томографии (МПГЭ) 5. Подробное описание МПГЭ стратегии реконструкции, методологии, шаг за шагом процессов и анализа структурно вариации были ранее сообщалось 4. Фильм о процедурах восстановления МПГЭ антител, в том числе необработанных изображений и промежуточных результатов, карте плотности 3D и структурной стыковки была также доступна для общественности по загружены на YouTube 5. Сравнение 3D реконструкции из разных индивидуальных антител частиц может выявить динамику белков и Сonformational изменения во время химических реакций 4,5. Учитывая, что более 50% белков имеют молекулярную массу в пределах от 40 - 200 кДа 1,2, успех в визуализации эти маленькие белки свидетельствует, что метод маркировок является полезным инструментом, чтобы подтолкнуть условную границу EM к малым и асимметричных структурных определений и открытий механизма . Таким образом, Подробный протокол обеспечивается, как показано ниже.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:547px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Stain: Uranyl Formate</td>
			<td style="width:159px;">The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td>
			<td style="width:137px;">02545-AA</td>
			<td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">SYRINGE: 1ML NORM-JECT</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-491</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Syringe filter: 0.2 &#956;m&#160;</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">28145-487</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Syringe filter: 0.02 &#956;m filter (Anotop 10)</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">6809-1002</td>
			<td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:159px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">470152-246</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td>
			<td style="width:159px;">Pacific Grid-Tech</td>
			<td style="width:137px;">Cu-300CN</td>
			<td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">CF200-Cu</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Tweezer: Dumont Tweezer L5</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">72882-D</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Milli-Q Advantage A10</td>
			<td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Filter Paper: Grade 1 circles</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">1001-090</td>
			<td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
			<td style="width:137px;">NA</td>
			<td>Any type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glow Discharge Unit</td>
			<td style="width:159px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:137px;">91000</td>
			<td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-520</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-524</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Filter Tips: VWR Signature 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">37001-528</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Pipet</td>
			<td style="width:159px;">Pipetman</td>
			<td style="width:137px;">F161201 and F167300</td>
			<td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy

Структурное определение белков, а вызов для белков с молекулярными массами от 40 - 200 кДа. Учитывая, что более половины природных белков имеют молекулярную массу между 40 - 200 кДа 1,2, надежный и высокой пропускной метод с разрешающей способностью нанометрового необходимо. Отрицательный окрашивание (NS) электронная микроскопия (ЭМ) является простым, быстрым и качественный подход, который часто используется в научно-исследовательских лабораториях для изучения структуры белков и белок-белковых взаимодействий. К сожалению, обычные NS протоколы часто генерируют структурные артефакты на белки, особенно с липопротеинов, что, как правило, формируют представления ROULEAUX артефакты. Используя образы липопротеинов из крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) в качестве стандарта, ключевые параметры в NS условий приготовления образца были недавно был показан и сообщил, как оптимизированного протокола NS (маркировок), модифицированной традиционной протокола NS 3. Артефакты, как роuleaux может быть значительно ограничен маркировок, дополнительно обеспечивая высокую контрастность наряду с разумно высоким разрешением (около 1 нм) образы малых и асимметричных белков. Эти высоким разрешением и высокой контрастностью изображения даже благоприятным для отдельного белка (единый объект, не средняя) 3D реконструкции, например кДа антитела 160, с помощью метода электронного томографии 4,5. Кроме того, маркировок может быть высокой пропускной инструментом для изучения сотен образцов малых белков. Например, ранее опубликованные механизм 53 кДа белка-переносчика эфиров холестерина (CETP) включает скрининг и визуализации сотен образцов 6. Учитывая крио-ЭМ редко успешно изображения белки менее 200 кДа до сих пор не публиковать любую исследование с участием скрининга более ста условия выборки, это справедливо для вызова метода высокой пропускной для изучения малых белков маркировок. Надеюсь протокол маркировок, представленные здесь может быть полезным инструментом для раздвинуть границы ЕМ и ускорить исследования EM на мелкие структуры белка, динамики и механизмов.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Более половины белков небольшие белки (молекулярная масса &lt;200 кДа), которые являются сложными как для электронного микроскопа изображений и трехмерных реконструкций. Оптимизированная отрицательное окрашивание это протокол надежной и высокой пропускной получить высокую контрастность и относительно высокое разрешение (~ 1 нм) образы малых асимметричных белков или комплексов при различных физиологических условиях.

Оптимизированная Отрицательный Окрашивание: Высокая пропускная протокол за рассмотрение Малый и Asymmetric Protein Structure по электронной микроскопии

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Research

JoVE Journal

Environment

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Высокая пропускная Флуорометрический Измерение Потенциал почвы внеклеточных активности ферментов

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Экспериментальный протокол для работы с завод-индуцированной неоднородности почвы

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Мультимодальные оптической микроскопии Методы Reveal полип Tissue морфологии и структуры в карибских рифовых рифостроители

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Полу-высокопроизводительного скрининга для потенциальных засухой толерантности в салат (<em&gt; Lactuca посевная</em&gt;) зародышевой плазмы Коллекции

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Высокая пропускная способность Скрининг непокорности Вариации в лигноцеллюлозной биомассы: Total лигнина, лигнин мономеров и ферментативной сахара версии

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Администрирование и обнаружения меток белка на членистоногих для разгона исследований

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

Протокол Двухтактный уменьшить колонизацию птичье гнездо Коробки от медоносных пчел

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Протокол для сбора и построения Основных лизиметрах Почвы

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Высок объём, микромасштабной протокол для анализа обработки параметров и питательными качествами в кукурузы (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Трехмерный (3D)-напечатан шаблон для высокой пропускной способности Zebrafish эмбриона одевающ

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...