Name: optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Vi tackar Dr Mickey Yang för redigering och kommentarer, och Drs. Lei Zhang och Bo Peng för hjälp. Detta arbete stöddes av Office of Science, Office of Basic Energivetenskaper av Förenta staternas Department of Energy (avtal nr. DE-AC02-05CH11231), National Heart, Lung, och Blood Institute of National Institutes of Health (no . R01HL115153) och National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health (nr. R01GM104427).

1. Framställning av färska Negativ färgningslösning vid 1% (vikt / volym) <ol><li> Sätt 1 mg AUC Formate (UF) pulver i glasflaska innehållande 100 ml avjoniserat vatten i ett mörkt rum eller låda. </li><li> Rör lösningen O / N vid RT i ett mörkt rum / box. Linda lösningen flaska med aluminiumfolie för att förhindra ljus från att träffa lösningen. </li><li> Filtrera lösningen försiktigt genom 0,2 ^ m (porstorlek) filter monterat på en 5 ml spruta. Den filtrerade lösningen uppsamlades i flera aluminiumfolie täckta Falcon-rör. Filtersprutan måste också lindas med aluminiumfolie för att förhindra ljusexponering. </li><li> Filtrera lösningen på nytt genom 0,02 um (porstorlek) filter monterat på 1 ml spruta. Den filtrerade lösningen uppsamlades och alikvot i 2 ml ampuller. De sprutor och injektionsflaskor är täckt med aluminiumfolie före användning. </li><li> Frys av alikvoter flaskor som länge hanteras pincett dränka flaskorna i en flytande kväve fylld behållaren omedelbartefter det att lösningen filtrerades. </li><li> Överför frysta flaskor i en -80 ° C frys för lagring och framtida användning. </li></ol> 2 Beredning av negativ färgning Workstation och Incubation Workstation <ol><li> Tina en ampull av ett% UF lösning i ett vattenbad vid RT. Se till att aluminiumfolien förblir lindad runt flaskan för att förhindra exponering för ljus. </li><li> Filtrera lösningen efter det är helt upptinad med aluminiumfolie inslagna 1 ml spruta monteras med ett 0,02 pm filter. Samla den filtrerade lösningen i en ny aluminiumfolie inslagna flaskan, och placerade den på isen i en lock täckt isbox väntar på användning. </li><li> Gör lösnings plattorna genom fingret trycka på en ~ 8 tum lång Parafilm arket på ytan av en tom proteinkristallisaplattan. Det kommer att generera rader av cirkulära plattor med en diameter på ~ 5 mm. Gör 6 plattor i varje rad ställe parafilm plattorna på en yta av tillplattad is inuti en is innehållerER lock, såsom ett färgnings arbetsstation. </li><li> Pipettera ~ 35 l avjoniserat vatten på var och en av vänster tre plattor i varje rad, och pipett ~ 35 l filtrerad UF-lösning till höger tre plattor i varje rad. Täck färgning arbetsstation med ett lock för att förhindra exponering för ljus innan färgning proteiner. </li><li> Förbered ett EM rutnät inkubation station genom att fylla en tom ruta till hälften med is, och följs bredvid en hängare som kan monteras på en stödjande bas. Placera prov pincett i hangaren, där pincett tips finns i närheten isytan. Hälften täcker pincett tips från rutan läppen höjden. En idealisk is rutan för att göra en inkubationstid station använder en tom pipettspetsar behållare. </li></ol> 3. OpNS Operation <ol><li> Glöd ladda ur tunna kolfilmen belagd 300 mesh koppar EM galler i 10 sek. </li><li> Plocka upp ett rutnät med pincett och haka pincetten i hangaren genom att hålla nätet i 45 ° lutning och 1 cm ovanför isenytan inuti inkubation stationen. </li><li> Späd proteinprovet med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DBPS) vid slutlig proteinkoncentration av ~ 0,01 till ~ 0,005 mg / ml. Insättning ~ 4 pl utspätt prov omedelbart efter utspädning på kolet sidan av EM rutnät. (DPBS kan ändras till en annan buffert om proteinet är känslig för DPBS) </li><li> Inkubera provet på EM galler för ~ 1 min inne i inkubation stationen. </li><li> Avlägsna överskottslösning igenom snabbt vidröra nätet kant med filterpapper. </li><li> Peka gallret snabbt till den första droppe (~ 35 | il) av ren vattenyta atop Parafilm arket direkt efter överskottslösningen avlägsnades på EM rutnät. Och sedan ta bort överflödigt vatten snabbt med filterpapper. </li><li> Upprepa steg 3,6 ytterligare två gånger genom att tvätta EM rutnät på de återstående två vattendroppar på Parafilm (Steg 3,6 och 3,7 kan hoppas över om provet är mycket känslig för vatten). </li><li> Float EM grid direkt på ytan av den första droppe UF-lösning direkt efter överflödigt vatten på EM gallret togs bort. Och sedan inkubera i 10 sek. Se till att avsluta vattentvättförfaranden inom 3 sekunder innan flytande gallret på ytan av UF-lösning. Ju kortare tvättiden, desto bättre blir kvaliteten vara. </li><li> Rengör pincett genom att tränga tipsen till ett filterpapper för ~ 2 - 3 gånger. </li><li> Avlägsna överflödig lösning på nätet genom att kontakta gallerkant med filterpapper, och sedan flyta gallret på den andra droppe UF. </li><li> Fortsätt ovanstående steg 3.10 på den andra droppen. </li><li> Float rutnätet på den tredje droppe av UF-lösning och täcka färgningsstation för ~ 1 min. </li><li> Valfritt steg: Tvätta gallret snabbt på toppen av vatten enligt 3.6. Detta ytterligare steg kommer att gynna prover innehållande över lastade gratis guldpartiklar eller fläck bakgrund. </li><li> Avlägsna överflödig lösning genom att peka på filterpapper till the hela nätet baksida (mittemot kol sidan). Torka nätet under en svag ström av kvävgas vid RT direkt efter att observera lösningen absorberar till filterpapper. </li><li> Placera gallret på ett ark filterpapper i en petriskål, och täcka skålen delvis med ett lock för att torka i minst 30 minuter enligt RT. För några prover, placera gallret i en 40 ° C inkubator bakning för en hr. </li><li> Förvara nätet i ett EM nätet box för framtida EM undersöka. </li></ol> 4. EM Undersöka <ol><li> Rikta in TEM ordentligt innan EM undersökning av små proteiner på nätet. <ol><li> Kontrollera upplösningen på den högsta synliga Thon-ring som är effektspektrum av en amorf kolfilm att avgöra om TEM har anpassats korrekt. Sedan TEM delas av många olika användare, TEM var ofta inte korrekt inriktad. </li><li> Kontrollera noggrant kraftspektrum på kolfilmen området av provet för att justera inriktningen condition av maskinen. De högsta synliga Thon-ringarna är bättre än den riktade upplösningen. OBS: Som ett exempel på en korrekt inriktning av en LaB6 fila TEM drivs under 120 kV högspänning, kan mer än 20 Thon-ringar visualiseras, där kan motsvarande upplösning bättre än 5,0 Å. Detta Thon-ringen uppnåddes genom Fourier överföring av en amorf kolfilm avbildas i en minskad fokus på ~ 1,6 um och en dos på 20,4 e / A2 (Figur 5). OBS: Observation av den höga upplösningen Thon-ringen är en nödvändig förutsättning, men inte tillräcklig förutsättning för korrekt inriktning. För att verkligen uppnå de högupplösta bilder, många andra parametrar är också viktiga, till exempel provkvalitet, strålningsskador, laddning och drivande samt belysnings dosraten. </li></ol></li><li> Ta med minskad fokus tillbaka till nära-Scherzer fokus för att avbilda de små proteiner på ett idealiskt färgade området. </li><li> Sök efter &quot;molnig&quot; område att image. Ett idealiskt färgade området är oftast placerad nära kanten av en tjockare fläck område, som ser ut som en &quot;grumlig&quot; område på nätet eftersom tjockleken på fläcken är normalt inte jämnt fördelat på kolbelagt grid (Figur 6). Typiskt en låg förstoring (&lt;100x) var att hjälpa till att hitta dessa molniga områden först innan du zoomar in för avbildning. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Jämfört med konventionella NS tekniker, kan OpNS förhindra rouleaux artefakter (Figur 1 och 9), som innehåller tillförlitlig och rimligt hög upplösning (~ 1 nm) strukturella detaljer i små proteiner (Figur 2). Jämfört med Cryo-EM tillhandahåller OpNS en hög genomströmning metod och kan behandla ett stort antal olika proteiner och protein-proteininteraktioner 6. Men fortfarande har OpNS sina nackdelar. Jämfört med konventionella NS, OpNS innebär: i) mer komplicerade steg i extraktion; ii) användning av ett radioaktivt ämne, UF; iii) hålla fläcken fräsch på grund av den kortare styrkan av UF fläcken på grund av dess ljuskänslighet; iv) för att förhindra utfällning av UF Lösningen måste förvaras i -80 ° C och kräver upptining före användning; v) och slutligen alla UF måste hanteras som farligt avfall. Jämfört med Cryo-EM, OpNS ger relativt lägre upplösning och ingen garanti för någon ännu inte upptäckt artefakti framtiden. NS drift processuella effekter på lipoprotein rouleaux bildning NS protokoll för beredning av proteiner för undersökning 16,29-36,55 kan delas in i tre huvudgrupper av metoder 50: blanda 55, drop-by-drop 16, och tvättningsprocedurer 29. i) Blandnings protokollet kräver den preliminära blandning av fläcken och proteinprov vid ett specifikt förhållande, och sedan tillämpa den blandade lösningen på klimatfilm belagd på ett rutnät, äntligen ta bort överflödig lösning med filterpapper innan lufttorkning för EM undersökning 55. ii) drop-by-drop-protokollet innebär att tillämpa (~ 4 l) provfall direkt till en EM rutnät belagd i kolfiber låta sitta för ~ 1 min, därefter avlägsna överskottsprovlösning före applicering av en droppe (~ 4 l) av fläcken lösning på samma sida av nätet. Efter ~ 1 min av inkubation, ta bort excess fläcken genom kontakt med rent filterpapper, äntligen lämna in för lufttorkning 16,56-58. iii) Tvätt protokollet (Figur 7) som kräver provlösning ansökan till en EM galler belagda i kol under 1 min, därefter tvättning med avjoniserat vatten tre gånger direkt efter avlägsnande av överskott av lösning varje gång av filterpapper 3,29,30. OpNS protokollet ändrades från denna tvättproceduren. NS fläcktyper och effekter på lipoprotein rouleaux bildning I NS, starkare elektron spridning på grund av tungmetall fläckar ger kontrast från proteinerna 17-20,59. NS prover kan dessutom drabbas av högre stråldoser, och förbättra proteinfunktioner med en skarpare negativ kontrast 8,9,60. Fläckar av tungmetaller kan klassificeras som: anjoniska, inklusive fosforvolframsyra (PTA) 16, metylamin volframat 14 och kiseltungstate 61; och katjonic, såsom uranylacetat (UA) 62, UF 3,29,30 och Uranylnitrat (FN) 63. En av de anjoniska NS fläckar som oftast används är PTA 33,64-67. PTA är en heteropolysyra, som normalt används runt en pH 7,0-7,5. PTA kan också användas för positiv färgning 3,16,68. De negativa laddningar av PTA kan förmedla elektrostatiska interaktioner med omättade lipider positivt laddade huvudgrupper, som POPC, på båda lipoprotein och liposom- ytor. PTA kan orsaka rouleaux bildning genom denna interaktion 29,30 även under vanliga buffert salthalt 29,30 (figur 1). AUC fläckar, såsom UA, UF och FN finns alternativa val för katjoniska tungmetaller fläckar och UA särskilt ofta används för NS av en mängd olika biologiska prover 62,69,70. Experiment hittade UF orsakar ingen rouleaux av lipoproteiner som innehåller omättade fett sura lipider, såsom POPC. Dock kan UF fortfarande framkalla rouleaux formation på lipoprotein som innehåller mättade fettsyra lipider, såsom dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC) och 1-hexadekanoyl-2-oktadekanoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (PSPC). Den detaljerade mekanismen för denna interaktion är okänd. UA / UF / FN kan alla arbeta vid lägre pH-värden som sträcker sig från 3,5 till 4,6. Sådana lägre pH-värden kanske inte lämpar sig för vissa biologiska makromolekyler som är känsliga för pH 14,71. Intressant nog kan UA / UF fixa proteinstruktur inom några millisekunder genom en okänd mekanism 72. Till skillnad från PTA är UA / UF mer liknar ett salt än en syra. UF uppgift kan ge bättre resultat än UA 73, där, UF och FN fläckar har mindre kornstorlekar än UA (UF: 0,3 nm, FN: ~ 0.5 nm) 3,74. Ett intressant exempel sekundära strukturlika detaljer i ett litet protein (53 kDa CETP) direkt kan visualiseras från rå micrographs när UF användes som negativ-fläck reagens genom att följatidigare rapporterat Cryo-positiv-färgning (kryo-PS) metoden (Figur 8) 6. I Cryo-PS, det färgade provet flash frysas genom att följa Cryo-EM provberedning förfarande istället för torkningsförfarande i OpNS-protokollet, vilket kan leda till sekundära strukturella kollaps. Den kryo-PS är en metod för hög kontrast och hög upplösning avbildning av små proteiner 75. Eftersom kryo-PS bilder har vänt kontrast jämfört med de från den rapporterade Cryo-NS-protokoll 22, men har konsekvent bild kontrast till de konventionella Cryo-EM bilder, så det fick namnet Cryo-PS metoden. De Cryo-PS bilder visar att färgningsreagens, AUC formiat, tränger den molekylära ytan, utmanar den konventionella uppfattningen att färgning kan visualisera bara den yttre ytstruktur. Mekanismen för hur AUC formiat penetrerar den molekylära ytan är okänd. En möjlighet är att den AUC katjon binder tillgängliga protein karboxylgrupper, och sålundaomgivande glaskroppen is har lägre densitet än färgning av protein och AUC grupper, och därmed utgöra en positiv fläck. Cryo-PS-metoden liknar isomorf ersättning (MIR) metoden med flera, som var en gemensam strategi för att lösa problemet fas i röntgenkristallografi 76-78. I MIR, är kristallprover indränkt med en tung atom-lösning, inklusive uran, för att få en isomorf form dess naturliga form. Tillägget av den tunga atomen ibland inte påverkar kristallbildning eller enhetscelldimensioner, men ger ytterligare information om kristallstrukturbestämning 76-78. Genom att dra nytta av den lilla korn av UF, kunde kryo-PS ger en hög kontrast och högupplöst bild av ett enda protein, vilket är viktigt för proteinstrukturen studier, särskilt med tanke på att nästan alla proteiner är naturligt dynamiska och heterogena i lösning. För validering av denna Cryo-PS-metoden, öppnar vi för några blindtest från EM fältet. </p&gt; Saltkoncentration effekter på rouleaux bildning i lipoproteiner Använda normal PTA negativ färgning reagens, observeras rouleaux bildning mer sannolikt relaterade till lipid interaktioner istället för proteininteraktioner. Avbildning av prover av POPC liposomvesiklar framställda under betydande salthalt (0,5 M NaCl), måttlig salthalt (0,25 M NaCl), relativt svag salthalt (0,1 M NaCl), och rent vatten (Figur 9), de elektronmikro visar rouleaux bildningen var korrelerad till saltkoncentration (figur 9A - D). Använda UF som negativ färgning reagens ades ingen rouleaux observerats i POPC liposomvesikel prov 30 (figur 2 liter), vilket tyder på tvättproceduren för att snabbt sänka saltkoncentrationen precis innan färgningen är ett nödvändigt, men inte tillräckligt självständigt steg för att förhindra rouleaux i POPC relaterat prover. TEM imaging litet protein kräver en nära-Scherzer fokustillstånd. Framgångsrik TEM avbildning av små proteiner med högre upplösning kräver två kritiska förhållanden, en riktig ljushöjden och en nära-Scherzer fokus förvärvs skick. i) En riktig ljushöjden kan bedömas genom antalet synliga Thon ringar (effektspektrum) på Fourier överföring av en kol filmbild förvärvats enligt en relativt hög minskad fokus. Ju bättre uppriktningstillståndet av balken, desto fler Thon ringarna visualiseras och mätbara .. ii) förvärva bilden under en nära-Scherzer fokus är ett annat kritiskt tillstånd. En traditionell standardstrategi för avbildning av biologiska prover använder vanligtvis hög defocus (1-2 pm och ännu mer), vilket kan öka det biologiska provet bildens kontrast 79. Denna strategi är väsentlig skiljer sig från den typiska strategi för avbildning atomär upplösning struktur av hårda material, som oftautnyttjar en nära Scherzer fokus (~ 50 nm minskad fokus). Även kan en högre minskad fokus stärka biologiskt prov skulle däremot högupplösta signaler delvis elimineras. Som ett resultat, skulle medverkan av högupplösta signalen vara lägre vid en högre minskad fokus imaging skick. Anledningen är att, TEM bild är faltningen av provstruktur och instrumentets CTF. CTF är en oscillerande kurva mot frekvensen, där kurvan ofta oscilleras korsar noll amplitud vid hög frekvens. Varje gång när CTF över noll, provet strukturella signalen vid denna specifika frekvens kommer att avskaffas (noll gånger varje nummer kommer att vara noll). Den eliminerade signalen vid denna frekvens kan aldrig återvinnas av någon CTF korrigeringsalgoritm (en nolla delat med en nolla kan vara något slumpnummer i stället för den ursprungliga struktursignalen). Under högre defocus imaging kommer CTF oscillera mycket mer aggressivt, sålunda CTF korsar noll amplitud oftare, såsom ett resultat,de strukturella signalerna vid ett större antal specifika frekvenser kommer att försvinna. Ju fler signaler som elimineras, desto mindre medhjälp bilden kommer att ha. Noterbart kan medverkan av bilden inte åter eller korrigeras av någon CTF korrigering. Dock kan ett antal Felaktiga bilder som förvärvats under olika suddig användas för att fylla sina luckor till varandra för att fått en klar strukturell signal av provstrukturen via en medelvärdesmetod, där till och med en atomär upplösning kan uppnås 9-12. Medelvärdesmetoden är en kraftfull metod för att uppnå struktur vissa mycket symmetriska proteiner och strukturellt relaterade stela proteiner. Men, det är fortfarande en utmaning i det strukturella studier av små och asymmetriska proteiner, särskilt för strukturdynamik och flexibla proteiner, till exempel antikroppar och HDL. Medelvärdes baseras på antagandet att proteinpartiklar är identiska i struktur och konformation men different i oriente, är dock många proteiner kända för att undergå termodynamiska fluktuationer i lösning. Genom att tillämpa medelvärdesmetoden utan att först känna till proteintermodynamiska fluktuation svängningar, kan den genomsnittliga strukturen orsakar ofta saknas domäner 10,80 eller lokal variation i upplösning 81 in-EM Cryo rekonstruktioner. Framgången för att uppnå 3D-rekonstruktion av litet protein, som 53 kDa CETP, och 3D-strukturen av ett enda protein, såsom 160 kDa IgG1 antikropp, fördelar med att använda en nära-Scherzer fokus imaging tillstånd under ett korrekt inriktning skick. Även bildkontrasten förefaller lågt i nära-Scherzer fokusbilder, kan kontrasten lätt förbättras genom att helt enkelt applicera en lågpass-filtrering för att reducera högfrekvent brus i bakgrunden. Vi tror, ​​en nära-Scherzer fokusera bilder att motsvara de största strukturella signaler, och kan öka noggrannheten i partikel inriktning och öka effektivitet i enkel-partikel 3D-rekonstruktion och individuell partikel elektron tomografi rekonstruktion.

Förstå proteiners funktion kräver kunskap om proteinstruktur. Strukturbestämning är utmanande för proteiner vars molekylära massorna är inom 40-200 kDa. Röntgenkristallografi är begränsad av proteinkristallisering; kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är begränsad till molekylmassor mindre än 40 kDa, medan kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) har svårt att både bild förvärv och tredimensionella (3D) rekonstruktioner av små proteiner som molekylmassor är mindre än 200 kDa. Noterbart är mer än 50% proteiner har en molekylmassa inom intervallet 40-200 kDa 1,2, eftersom dagens metoder är utmanande att studera proteiner av denna storlek, det behövs en ny metod. Även om de flesta transmissionselektronmikroskop (TEMS) är kapabla atomär upplösning, det vill säga bättre än 3 Å upplösning, uppnå ens en nära nanometer upplösning struktur från ett biologiskt prov är ganska Challenging 7. Skador Strålning, låg kontrast, strukturella avvikelser samt artefakter såsom uttorkning alla hinder högupplösta TEM avbildning 3,8. Bland olika TEM tillvägagångssätt är Cryo-EM en avancerad och banbrytande metod för att uppnå atomär upplösning strukturer mycket symmetriska stora makromolekyler i nära fysiologiska förhållanden 9-12. Den Cryo-EM prov bereds flash frysning provlösningen, bädda makromolekylerna i glaskroppen is, som sedan avbildas vid låga temperaturer såsom flytande kväve eller helium temperaturer 13. Cryo-EM är en fördel i det att prover presentera några artefakter och är nästan infödda struktur 8-12. Cryo-EM har sina nackdelar: i) ytterligare enheter krävs skall installeras eller köpa för att uppgradera en standard TEM instrument för en Cryo-EM kapacitet. Enheter är: anti contaminator, kryo-hållare, låg dos mode programvara och lågdos sensitiv CCD-kamera, även om priserna på dessa enheter är mycket lägre än priset på TEM själva instrumentet; ii) Cryo-EM drift behöver längre tid än NS operation. Undersöka en Cryo-EM provet kräver ofta längre tid att förbereda prover och driva TEM instrument än för NS eftersom Cryo-EM kräver itu ytterligare svårigheter, bland annat: operation flytande kväve temperatur, provladdning, imaging drift, temperaturgradienter, lågdos modell drift, provstrålningskänslighet och begränsningar doserings. Dessa extra åtgärder kommer att sakta ner hastigheten på förvärva användbara data jämfört med NS datainsamling, även om några Cryo-EM bilder kan säkert erhållas i 1 timme eller mindre av Cryo-EM experter med instrumentet beredd med en balanserad temperaturgradient; iii) användare kräver ytterligare utbildning, till exempel hantering av flytande kväve, frysning-EM Cryo galler, lågdos drift, mätning dos, hantering laddningen, drifting och kunskap inom bildbehandling procEssing; iv) brist på repeterbar avbildning för samma Cryo-exemplar under olika TEM sessioner. Cryo-EM exemplar kan lätt skadas av is kontamination under prov lastning och lossning till / från TEM instrumentet. Denna skada är särskilt ett problem när proverna är svåra att isoleras / renas 14; v) små proteiner (&lt;200 kDa molekylmassa) är utmanande att avbildas på grund av låg kontrast; vi) låg kontrast och hög buller-EM Cryo bilder minskar korskorrelationsvärde mellan bilderna, därför minskar totala noggrannheten vid bestämning av protein inriktningar, konformationer och klassifikationer, särskilt för proteiner som är strukturellt flexibla och naturligt varierar i lösning 4,5. Negativ färgning (NS) är en relativt &quot;gamla&quot; och historisk metod som alla laboratorier, med någon typ EM, kan använda för att undersöka proteinstruktur. Brenner och Horne först utvecklat konceptet of negativ färgning ett halvt sekel sedan för att pröva virus 15. NS åstadkommes genom beläggning av provet med laddade tungmetallsalter. Detta koncept ursprungligen kommer från ljusmikroskop och bruket att bädda bakterier i en färglösning som ger mörkret omkring proverna, vilket gör att högre bildkontrast när du visar den negativa bild 16. Eftersom de tunga metalljoner har en större förmåga att skingra elektroner jämfört med mindre täta atomer i proteinerna 17-20 och beläggning heavy metal fläck tillåter en högre dos begränsning med förbättrad kontrast. NS provet kan ge bilder med hög kontrast 8 för enklare partikelorienteringsbestämning och 3D-rekonstruktion än bilder från Cryo-EM. Traditionella NS tyvärr kan producera artefakter inducerade av bets-proteininteraktioner, såsom generell aggregering, molekylär dissociation, avskaffande och stapling 8,21,22. För lipid relaterade proteins, såsom lipoproteiner 16,23-30, en gemensam artefakt leder partiklar som är staplade och packade ihop till en rouleaux (Figur 1) 31-36. Många lipoproteiner studier, till exempel nondenaturing polyakrylamid gradientgelelektrofores, studerar Cryo-EM 13,29,37-40, masspektrometri 39,41, och små vinkel röntgendiffraktionsdata uppgifter 42 alla show lipoproteinpartiklar är isolerade partiklar i stället för naturligt staplade tillsammans bildar en rouleaux 21,29,30,35,42-45. Observationen av rouleaux bildning med konventionella NS är eventuellt orsakats av dynamiska interaktioner mellan lipoproteiner består av apolipoproteiner (apo) och fosfolipider som är strukturellt flexibel lösning 13,29,30,46-49 och känslighet för standarden NS-protokollet. För att identifiera denna artefakt, var apolipoprotein E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) high-density lipoprotein (HDL) prov som används som ett testprov och cryo-EM bilder för en artefakt fri standard 29, screening NS exemplar framställda i en rad villkor. Genom att jämföra partikelstorlekar och former erhållna från NS och Cryo-EM, var den specifika typ av färgning reagens och saltkoncentrationen befanns vara två nyckelparametrar som orsakar de välkända rouleaux fenomen. Sålunda erhölls en optimerad negativ färgning (OpNS) protokollet rapporterats. Genom OpNS ades den välkända rouleaux fenomenet apoE4 HDL elimineras genom OpNS (Figur 2A). Statistisk analys visade OpNS ger mycket liknande bilder (färre än 5% avvikelse) i storlek och form jämfört med de från Cryo-EM, var dock kontrasten elimineras. De valideringar av OpNS utfördes genom att undersöka eliminering av rouleaux artefakt av nästan alla klasser eller underklasser av lipoprotein prover 6,29,30,50,51, inklusive apoA-I 7,8 nm (Figur 2B), 8,4 nm (figur 2C) , 9,6 nm discoidal rekonstituerad HDL (rHDL) (Figur 2D), 9,3 nm sfäriska rHDL (Figur 2E), plasma HDL (Figur 2F), lipid fri apoA-I (figur 2G), plasma-HDL (Figur 2H), low density lipoprotein (LDL ) (Figur 2I), intermediär-density lipoprotein (IDL) (Figur 2J), mycket låg densitet lipoprotein (VLDL) (Figur 2K) och POPC liposomer (Figur 2L) 30. Ytterligare validering utfördes genom att avbilda små och asymmetriska proteiner, inklusive den 53 kDa kolesterylester-transferprotein (CETP) (fig 3A - C) 6,29, och mycket flexibelt 160 kDa IgG-antikropp (Figur 4A och B) 4,5,29 , 52, samt två strukturellt väl kända proteiner, GroEL och proteasom (Figur 2 M och N). För att kräva någon ytterligare validering från colleagues, vi är öppna för eventuella blindtester på denna OpNS metoden. OpNS som en hög genomströmning protokollet har också använts för att studera proteinmekanism genom att granska hundratals prover av små proteiner, såsom CETP som binder till olika proteiner inom en serie villkor (inklusive CETP samverka till 4 klasser av lipoproteiner, modifierat HDL, plasma HDL, LDL och VLDL, med / utan två antikroppar, H300 och N13, under 9 inkuberingstider, inklusive 3 min, 20 min, 1 timme, 2 timmar, 4 timmar, 8 timmar, 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar, under 4 molförhållanden, dvs 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, och 3 utspädningar, dvs 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml och 0.001 mg / ml, plus ytterligare stickprovskontroller, bland annat CETP ensam, LDL ensam och VLDL ensam, med tredubbla tester av ovanstående experiment av olika personer) 6,29. OpNS bilder av CETP tillhandahålls höga bilder kontrast med någorlunda fina strukturella detaljer; tillåter oss att framgångsrikt rekonstruera en 3D-täthet karta över de 53 kDa small protein CETP (Figur 3D - F) genom en enda partikel återuppbyggnad. Dessutom hög kontrast OpNS bilder ger oss en tillräcklig signal från ett enskilt protein (Figur 4A - C), som tillät oss att nå mellan upplösning (~ 1,5 nm) i en enda (ett objekt, utan i genomsnitt) IgG-antikropp 3D-struktur via enskilda partiklar elektron tomografi (IPET) metoden (Figur 4E - J) 5. Den detaljerade beskrivningen av IPET återuppbyggnadsstrategi, metodik, steg-för-steg-processer och strukturvariation analys redovisades tidigare 4. En film om IPET antikroppsrekonstruktionsförfaranden, inklusive rå bilder och delresultat, 3D-densitetskartan och struktur dockning fanns också tillgänglig för allmänheten genom att laddas upp till YouTube 5. Jämförelse av 3D-rekonstruktioner från olika enskilda partiklar antikropps kunde avslöja proteindynamik och conformational förändringar under kemiska reaktioner 4,5. Med tanke på att över 50% av proteiner har molekylmassa som sträcker sig från 40 till 200 kDa 1,2, framgång i att avbilda dessa små proteiner framgår att OpNS metoden är ett användbart verktyg för att driva den konventionella EM gränsen mot små och asymmetriska strukturbestämningar och mekanism upptäckter . Således är den detaljerade protokoll tillhandahålls som nedan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:547px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Stain: Uranyl Formate</td>
			<td style="width:159px;">The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td>
			<td style="width:137px;">02545-AA</td>
			<td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">SYRINGE: 1ML NORM-JECT</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-491</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Syringe filter: 0.2 &#956;m&#160;</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">28145-487</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Syringe filter: 0.02 &#956;m filter (Anotop 10)</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">6809-1002</td>
			<td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:159px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">470152-246</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td>
			<td style="width:159px;">Pacific Grid-Tech</td>
			<td style="width:137px;">Cu-300CN</td>
			<td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">CF200-Cu</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Tweezer: Dumont Tweezer L5</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">72882-D</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Milli-Q Advantage A10</td>
			<td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Filter Paper: Grade 1 circles</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">1001-090</td>
			<td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
			<td style="width:137px;">NA</td>
			<td>Any type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glow Discharge Unit</td>
			<td style="width:159px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:137px;">91000</td>
			<td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-520</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-524</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Filter Tips: VWR Signature 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">37001-528</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Pipet</td>
			<td style="width:159px;">Pipetman</td>
			<td style="width:137px;">F161201 and F167300</td>
			<td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy

Strukturbestämning av proteiner är ganska utmanande för proteiner med molekylmassor mellan 40-200 kDa. Med tanke på att mer än hälften av naturliga proteiner har en molekylvikt mellan 40 till 200 kDa 1,2, behövs en robust och hög genomströmning metod med en nanometer upplösning kapacitet. Negativ färgning (NS) elektronmikroskopi (EM) är en enkel, snabb och kvalitativ metod som ofta har använts i forskningslaboratorier för att undersöka proteinstruktur och protein-proteininteraktioner. Tyvärr konventionella NS protokoll genererar ofta strukturella artefakter på proteiner, speciellt med lipoproteiner som vanligtvis bildar presentera rouleaux artefakter. Genom att använda bilder av lipoproteiner från kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) som standard, var de viktigaste parametrarna i NS provberedningsförhållanden nyligen skärmad och rapporteras som den optimerade NS-protokollet (OpNS), en modifierad konventionell NS-protokoll 3. Artefakter som rouleaux kan i hög grad begränsad av OpNS, dessutom ger hög kontrast tillsammans med någorlunda hög upplösning (nära 1 nm) bilder av små och asymmetriska proteiner. Dessa högupplösta och bilder med hög kontrast är även gynnsam för en enskild protein (ett enda objekt, ingen genomsnittlig) 3D-rekonstruktion, till exempel en kDa antikropp 160, genom metoden för elektron tomografi 4,5. Dessutom kan OpNS vara en hög genomströmning verktyg för att undersöka hundratals prover av små proteiner. Till exempel, den tidigare publicerade mekanism av 53 kDa kolesterylester-transferprotein (CETP) involverade screening och avbildning av hundratals prover 6. Med tanke på Cryo-EM sällan framgångsrikt bilder proteiner under 200 kDa har ännu inte publicera någon studie med screening över hundra provförhållanden, är det rimligt att kalla OpNS en hög genomströmning metod för att studera små proteiner. Förhoppningsvis OpNS protokollet presenteras här kan vara ett användbart verktyg för att tänja gränserna för EM och påskynda EM studier av små proteinstruktur, dynamik och mekanismer.

De implementationer av OpNS inkluderar strukturella och morfologiska undersökningar av olika lipoproteiner arter såsom: begynnande rekombinant HDL (rHDL), sfärisk rekombinant HDL, plasma HDL, LDL, IDL och VLDL (figur 2) 30; samt små proteiner såsom 53 kDa CETP (bland de minsta proteinerna framgångsrikt avbildas genom EM) (Figur 3) 6 och 160kDa IgG-antikroppar (en av de mest dynamiska och heterogena proteiner) (Figur 4) 4,5,29,52 , även 28 kDa-lipid fri apolipoprotein A-1 (fig 2L) och GroEL och proteasomer (Figur 2 M och N). Andra exempel på OpNS som en hög genomströmning metod undersöker protein-proteininteraktioner för att avslöja protein mekanismer, såsom 53 kDa CETP. Som beskrivits i inledningen, hur CETP interagerar med olika underklasser av lipoproteiner var utredted via undersöka mer än 400 EM exemplar 6 Så vitt vi vet finns det ingen sådan ett fall av Cryo-EM studie som involverar screening nästan hundra olika förutsättningar. OpNS kan utöka EM gränser för att studera små och asymmetrisk protein 3D-struktur och även expandera för att uppnå 3D-strukturen utgör en enda och individuell protein (utan genomsnitt). Till exempel är IgG-antikroppar 160 kDa molekyl med en mycket flexibel struktur, där 3D-rekonstruktion vid mellanliggande upplösningen är utmanande att uppnås. den OpNS metod användes för att bild en individ IgG-antikropp från en serie av tippningsvinklar (figur 4E och H). De någorlunda högupplösta och hög kontrast protein bilder OpNS tillåts för en framgångsrik rekonstruktion av ett enda protein av enskilda partiklar elektron tomografi (IPET) (Figur 4E - J) 4,5. I IPET 3D-rekonstruktion <sup&gt; 4, 2D lutning serien riktade antikroppen successivt anpassats till deras beräknade globala centrum via därefter iterativ rekonstruktion för att uppnå en 3D densitet vid en upplösning på ~ 14,1 Å (Figur 4F och G) 4. Genom samma tillvägagångssätt, var en enda antikropp-peptidkomplex rekonstrueras och peptiden inducerade den interna domänen conformationaländring av en enda antikropp partikel upptäcktes (Figur 4I och J, upplösning ~ 16,6 Å) 4,5. Jämföra 3D rekonstruktioner från olika enskilda partiklar, kan den strukturella analysen tillåter oss att avslöja proteintermodynamiska fluktuationer, och till och med &quot;snap-shot&quot; de mellanliggande faserna av en kemisk reaktion 4,5,29,53,54. Sammanfattningsvis proteiner med molekylmassa mellan 40 kDa - 200 kDa är utmanande för standard EM strukturella undersökningar och rekonstruktioner. Med tanke på att över 50%av proteiner har molekylmassa som sträcker sig från 40 till 200 kDa 1,2, rapporterar vi en OpNS metoden som en robust och hög genomströmning verktyg för att driva den konventionella EM gränsen mot små och asymmetriska strukturbestämningar och även mekanistiska studier. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1 Rouleau artefakt av lipoproteiner genom konventionell negativ färgning (NS) EM. Elektronmikro (ovan paneler) och utvalda partiklar (nedan paneler) visar olika lipoproteiner med rouleaux efter NS med fosforsyra (PTA) vid standard mix förfarande. (A) Utspädd HDL (rHDL) med ApoE4, (B) apoA-I-innehållande 9.6 nm skivformad rHDL, (C) apoB innehållande plasma LDL, (D) icke-apolipoprotein innehållande POPC liposomer. Bars: 50 nm. Fönsterstorlek: A och C, 20 nm; B, 30 nm. The Journal of Lipid Research ursprungligen publicerat detta arbete 29,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2 Protein struktur genom optimerad negativ färgning (OpNS) EM Elektronmikro visar olika lipoproteiner och liposomer utan rouleaux artefakt från OpNS (A) apoE4-innehållande rHDL,.. (B) 7.8 nm rHDL, (C) 8.4 nm rHDL; ( D) 9.6 nm rHDL, (E) 9.3 nm sfärisk rHDL, (F) Human plasma α-HDL, (G) Plasma HDL, (H) Human plasma LDL, (I) Human plasma IDL, (J) Human plasma VLDL; <strong&gt; (K) POPC liposomer, (L) lipid fri apoA-I. Ytterligare kontroll gjordes med hjälp av (M) GroEL och (N) Proteasome prover. Micrographs (ovan paneler) och utvalda partiklar (nedan paneler). Bars: 50 nm. Fönsterstorlek: A - D, 20 nm; E och F, 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; I, 50 nm; J och K, 100 nm; L, 80 nm., Utom lipid fri apoA-I, GroEL och Proteasome, Denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Lipid Research 29,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3. OpNS elektronmikrofotografier av CETP. (A) Översikt mikrofotografi med CETP (streckad cirklar) bananformade partiklar. (B) Windowed Välj råa partiklar. (C) Tre enstaka partikel bilder rå CETP som tydligt visar en större, tyngre och större klotformiga spetsen inklusive andra mindre, lättare och smalare spets (till vänster), ovanifrån visar liknande terminal regioner med mindre total krökning (mitten panelen), och slutet vy längs den långa axeln av CETP (höger panel) (D) Lagra kristallstrukturen (PBF:. 2OBD) på dessa partikel bilder råa CETP, matchade väl i både strukturell form och domänstorlek visar orienteringen kan vara nästan direkt definieras även utan hjälp av en dator (motsvarande paneler till (C)). (E) Referens fria medelvärden 2D klass (en ab initio processen att beräkna likheter (korskorrelationsberäknings) av dessa slumpvis orienterade partiklar, de partiklar som har en hög likhet till varandra grupperades, i linje och därefter i genomsnitt för att minska bakgrundsljud och ökad partikelbild contrast. Referens gratis 2D genomsnitt klass beräknas av refine2D.py programvara i EMAN paketet, där, ingen någon människa gjort ursprungliga modellen var inblandad i denna klass genomsnittet. Medelvärden referensklassen kan användas som en oberoende metod för att validera den 3D-rekonstruktion från återuppbyggnad singel-partikel). (F) Vald referensfria 2D medelvärden klass visar en större distal ände jämfört med den andra. (G) Inspeglad kristallstruktur (PDB : 2OBD) jämfört med de referens fria snitten, överlagrings bilderna visar en nästan perfekt matcher mellan kristallstruktur och referens-fri klass genomsnittet i både struktur form och domänstorlek (lågt panel) (F) 3D täthet karta över CETP på. resolution av den 13 Å rekonstruerades från 8879 partiklar avbildas av OpNS och återuppbyggnad enda partikel-metoden (övre panelen) och räfflade body dockad i denna enda partikel återuppbyggnad av kristallstrukturen (lågt panel). DETailed information om den enda partikel återuppbyggnad, inklusive bildbehandling, ursprungliga modellen, förfining förfaranden, vinkelfördelning och Fourier Shell Korrelation (FSC) publicerades i metoddelen och styrkande uppgifter i den ursprungliga papper (H) Slutlig jämförelse av enda partikel återuppbyggnad ( ovanför panelen) och ytterligare PBF fit jämförelse (nedre panelen) 6. Barer: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. En del av dessa siffror tidigare publicerad i Nature Chemical Biology 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4 OpNS bilder och rekonstruktioner av Human IgG partiklar 1 antikroppar. (A) översyn på mänskliga IgG1 antikropp OpNS bilder. Partiklar som visas i vita cirklar visar tydligt partiklarna med 3 domäner. (B) Valda högupplösta råbilder av fem individuella okonjugerade antikropps partiklar och (C) deras motsvarande brusreducerade bilder genom att manuellt minska bullret kring råpartikelkanten (utan kontakt någon täthet inuti partiklarna) för att visualisera lätt. (D) Kristallstrukturen (PDB posten 1IGT) av IgG1 antikropp som var inriktad på ett liknande sätt visar att EM-bilderna. Jämförelse av de motsvarande bilderna visar många gemensamma drag mellan EM bilden och kristallstrukturen, inklusive domän positioner och former. (E) Förfarandet för en från början 3D-rekonstruktion från en enda instans IgG1 antikropp steg till steg (inget genomsnitt, ett enskilt objekt) med hjälp av individuella-partikel elektron tomografi () metoden IPET. (F) Den slutliga 3D-rekonstruktion av en single antikropps partikel vid upplösning på 14,1 Å visade tre donut formade domäner bildar ett &quot;Y&quot; form. (G) Docking domänerna kristallstrukturer i vardera av motsvarande domän täthet kartor respektive och manuellt upprepa slingorna bland domänerna. (H) Proceduren steg till steg i 3D-rekonstruktion av ett enda IgG-peptidkomplex (ingen genomsnitt en enskilt objekt) genom IPET. (I) Den slutliga 3D-rekonstruktion av en IgG-peptid komplex visades på upplösning på 16,6 Å visade tre stav formade domäner bildas i ett &quot;Y&quot; form (J) respektive dockning kristallstrukturen för varje IgG antikroppsdomäner (PDB post: 1IGT). in i varje stavform tätheter visade ett dåligt matchning med domänkristallstrukturer, vilket tyder på en inre domän conformationaländring Efter peptid konjugering. Det detaljerade förfarandet, upplösning analys och statistik beskrevs i den ursprungliga papper <sup&gt; 5 Bars: A, 50 nm; B - D, 10 nm. Detta arbete ursprungligen publicerades i PLoS ONE 4 och vetenskapliga rapporter 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5 Ström spektrum av amorft kol film avbildas i 1,6 um minskad fokus av en Zeiss Libra 120 LaB6 TEM. Högupplöst avbildning kräver tillräckliga bevis för att visa att EM har rätt inriktning och högupplöst förmåga. Analysen av effektspektrum närheten kol område på nätet är en effektiv metod för att kontrollera strålen samstämmighet tillstånd före datainsamling. Fourier överföring av bilden av ett amorft kol området visar instrumentet relaterade kontrastöverföringsfunktionen (C<html> TF), sk Thon-ringar. En korrekt inriktning och sammanhang kan reflekteras av antalet synliga Thon-ringar och den högsta upplösningen av synliga Thon ringar under ett relativt högt minskad fokus skick. Som ett exempel på en nära korrekt inriktning kondition ett labb 6 filament utrustad TEM, mer än ~ 20 Thon ringar (~ 5 A) kan genereras från ett kol-film avbildas på 1,6 um minskad fokus med hjälp av dos 20,4 e - / Å 2. De Thon ringarna uppnås från en low-end TEM har en liknande den från high-end TEM, t.ex. en fältemissions pistol (FEG) förstärkt TEM drivs under ett korrekt inriktning skick. Detta arbete ursprungligen publicerades i Scientific Reports 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figur 6 Exempel mikrofotografier av &quot;ideal&quot; områden för OpNS avbildning. Tre proteinprover, (A) GroEL (B) Proteasome (C) Sfärisk HDL, användes som exempel för att visa den perfekta OpNS för avbildning. Eftersom fläckar är ojämnt fördelade i provet visas låg förstoring av prov brukar &quot;grumlig&quot; (längst till vänster panel). Den idealiska områden för avbildning normalt belägna i gränserna för dessa &quot;moln&quot;. Ett exempel på steg-för-steg zooma in en &quot;grumlig&quot; fläckområdet (vänster mellersta panelen) visar hög förstoring bilder som uppvisar hög upplösning och hög kontrast bilder av partiklar (högra mellersta panelen). Valda bilder av partiklar visar strukturen uppgifter om proteiner (längst till höger panel). Bars:. 30nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig6highres.jpg" target="_blank">klicka gärna här för att se en stor</a>r version av denna siffra. <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7 En schematisk ritning av OpNS förfaranden. (A) EM galler inkubation station, enkel station att ruva provlösningen på glöd-urladdat rutnät. (B) Färgning arbetsstation, utformad för att bibehålla vattentvättdroppar, och fläckdroppar över en is säng, och samtidigt minimera fläck exponering för ljus. (C) Översikt över färgningsprocedur, illustrerar: läsk riktning, 3x vattensköljning, 3x UF fläck exponering, färgning inkubation med inverterad prov rutnät på fläckdroppar, och slut baksidan prov läsk att säkerställa ett tunt lager av provfärglösning före torkning av kväve luft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" target="_blank">klicka gärna här för att se en större version av th</a>är figur. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8. Hög - upplösning av 53kDa litet protein CETP visade från en modifierad OpNS metod, kryo-positiv-färgning (kryo-PS) Fem välj högupplösta och cirkulär form mjuka maskerade råa bilder av CETP partiklar (med omvänd kontrast). och partikelform maskeras råa partiklar (manuellt reducerat brus omgivande partikel bilder råa &quot;kanter, men utan att ändra något täthet i partiklarna) för att visualisera lätt. All-atom och bandkristallstruktur jämfört med maskerade råa partiklar i linje med liknande inriktningar i varje partikel till EM bilder. De högupplösta detaljer i de råa bildområdena visar viss likhet med kristallstruktur, samtidigt som inte alla kristallstruktur funktioner kan lösas från rådata. Remarka<html> Bly, dessa råbilder visar likhet i båda ändarna med närliggande små runda hål sett i manuellt reducerade brus (trianglar); Dessutom strängarna i C-terminala regioner inom partikel bilder kompletterar kristallstruktur β-ark (pilar) och slutligen utstickande öglor på CETP C-terminala regionen är besläktad med i kristallstrukturen (diamanter). (A) Fem välj högupplösta och rund form mjuka maskerade råa bilder av CETP partiklar (med omvänd kontrast). (B) lågpassfiltrering till 10A. (C) Högre lågpassfiltrering till 20A. (D) Maskerade manuellt buller reducerade bilder. (E) Kristallstruktur jämförelse med bandstruktur. (F) Kristallstruktur jämförelse av alla atom representation. Bar: 5 nm. En del av detta arbete publicerades i Nature Chemical Biology 6.stripigt &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" width="500" /> Figur 9 Elektronmikro av liposomer som visar Rouleau bildning genom konventionell NS-protokollet (PTA fläck) under olika salthalt. (A) Hög salthalt (~ 0,5 MNaCl). (B) Vanlig salthalt (~ 0,25 M NaCl). (C) Låg salthalt (~ 0,1 M NaCl). (D) Rent vatten. Micrographs (ovanför panelen) och välj fönster partiklar (under panelen) som visas. Bars: 100 nm. Fönsterstorlek: 80 nm. The Journal of Lipid Research ursprungligen publicerat detta arbete 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Mer än hälften av proteiner är små proteiner (molekylmassa &lt;200 kDa) som utmanar både elektronmikroskop imaging och tredimensionella rekonstruktioner. Optimerad negativ färgning är en robust och hög genomströmning protokoll för att med hög kontrast och relativt hög upplösning (~ 1 nm) bilder av små asymmetriska proteiner eller komplex under olika fysiologiska förhållanden.

Optimerad Negativ Färgning: a hög kapacitet protokoll för prövningen Liten och Asymmetric Protein Structure genom elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Research

JoVE Journal

Environment

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Hög kapacitet Fluorometrisk Mätning av Potential Soil Extracellulär Enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Experimentell Protokoll för Manipulera växt-inducerad Soil Heterogenitet

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Multimodal optisk mikroskopi Metoder Reveal Polyp vävnadsmorfologi och Struktur i Karibien Reef Building Koraller

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Semi-högkapacitetsscreening för Potentiell torka-tolerans Sallad (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) arvsmassa samlingar

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Hög genomströmning Screening av motsträvighet Variationer i lignocellulosabiomassa: Total Lignin, Lignin monomerer, och enzymatisk Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Administrera och detektion av protein Marks på Leddjur för Dispersal forskning

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

En push-pull protokoll för att minska koloniseringen av Bird holkar av honungsbin

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Ett protokoll för insamling och konstruera Jord Kärn lysimetrarna

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Hög genomströmning, hur provtagningsutrustningen skall protokollet för analys av bearbetning parametrar och näringsvärde i majs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensionell (3D)-tryckt mall för hög genomströmning zebrafiskar Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...