Este trabajo ha sido financiado por el Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.

1. Suspensión unicelular de la muestra quirúrgica fresca del glioblastoma para el cultivo de la neurosfera
<ol><li>Con el consentimiento por escrito de los pacientes y de acuerdo con las directrices institucionales, recoger muestras de tumores para cultivo celular inmediatamente después de la cirugía de resección de glioma de alto grado.</li>
	<li>Confirmar el diagnóstico de la muestra tumoral por histopatología. Transporte inmediatamente la muestra desde la sala de operaciones hasta la campana de cultivo de tejido de flujo laminar, para su procesamiento dentro de 1 hora desde la cirugía. NOTA: Para cirugías en un sitio remoto, corte la muestra de tumor en fragmentos más pequeños y colóquela en un tubo que contenga DMEM/F12 (manténgase en el hielo). El tumor se puede procesar varias horas después de la cirugía.</li>
	<li>Comenzando con el magnesio 200-500 del tejido (óptimo), picando la muestra del tumor usando una lámina del bisturí, y transferencia a un tubo de 15 ml que contiene el medio sin suero 10 ml DMEM/F12. Mezcle invirtiendo varias veces, deje que las piezas del tumor se sedimente por gravedad, elimine el medio y repita según sea necesario.</li>
	<li>Prepare la solución de disociación de tejido enzimático y detenga la solución fresca.<ol>
<li>Solución de disociación de tejido enzimático: 5 ml 0.05% Tripsina-EDTA, 2.5 ml Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) libre de calcio y magnesio, 2.5 ml Colagenasa IV solución madre (2,000 U / ml en HBSS con calcio y magnesio).</li>
		<li>Solución de parada: 5 ml de solución inhibidora de tripsina, 5 ml de DMEM/F12, 2 μl de 5.000 U/ml de DNAse I (fabricado en HBSS libre de calcio y magnesio).</li>
	</ol></li>
	<li>Retire el medio y agregue la solución de disociación de tejido enzimático a la muestra de tumor picado, utilizando 2 ml por cada tejido de 0,5 g. Mezclar suavemente invirtiendo.</li>
	<li>Incubar el tejido en solución a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos en rotación durante 30 min.</li>
	<li>Triturar con una pipeta de 2 ml y detener la digestión o volver a la incubadora durante otros 15-30 min de incubación dependiendo del nivel de digestión.</li>
	<li>Detener la digestión añadiendo 2 volúmenes de Solución Stop y triturar mecánicamente con una pipeta serológica de 5 ml.</li>
	<li>Filtre el material no didigido a través de un colador de células de 40 μm. Pellet de las células a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de lavado 3x en 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspend el pellet final de la célula en 5 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Lentamente la capa de la suspensión celular sobre 5 ml de Linfólito-M y pellet a 1.300 x g durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera la capa de interfaz que contiene las células nucleadas a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de DMEM/F12.</li>
	<li>Pellet de las células a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Repetir el lavado con DMEM/F12 2x más.</li>
	<li>Criopreserve las células individuales resultantes para su uso posterior mediante la reutilización del pellet en el medio de congelación de células de recuperación, alícuota en crioviales, congelación lenta y almacenamiento en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Para cultivar, resuspend las células en medio de neuroesfera suplementado con factores de crecimiento (NMGF), y la placa a una densidad relativamente baja (<1 x 105 células / ml) en un matraz de cultivo de tejido T25 regular en condiciones estándar, 5% de CO2,37 ° C, incubadora de cultivo de tejido humidificado (Figura 1A).<ol>
<li>Preparar NMGF usando la siguiente receta<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">Para 500 ml de DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Solución de stock</td>
					<td>volumen</td>
					<td>concentración final</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Suplemento de N2 (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 mg/ml de solución común de BSA</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml Reactivo de gentamicina</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibiótico/antimicótico</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml de bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml de EGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transferir neuroesferas que se forman durante 1-3 semanas (Figuras 1B-E) a frascos frescos, para separar de las células adheridas y los desechos. Realice cambios parciales de medios cada 3-4 días. NOTA: Si disocia el tumor orthotopic del xenoinjerto usando el protocolo antedicho, los pasos 1.11-1.13 pueden ser omitidos.</li>
</ol>2. Mantenimiento del cultivo de la neuroesfera de glioblastoma y aplicaciones aguas abajo
<ol><li>
Disociación :Monitorizar los cultivos de neuroesfera y realizar cambios parciales de medios cada 3-4 días. Cuando la mayoría de las neuroesferas multicelulares del matraz alcancen los 100 μm de diámetro, se desvinculen en una suspensión unicelular:<ol>
<li>Transferir el medio que contiene las neuroesferas a un tubo de 15 ml, sedimentar por gravedad las neuroesferas durante unos 5 min, retirar el medio y resuspend el pellet celular en 10 ml de DPBS libre de calcio y magnesio.</li>
		<li>Mezclar e incubar durante 10 min a temperatura ambiente, ya que las células sedimenta por gravedad.</li>
		<li>Retire 7-8 ml de DPBS y luego disocida las neuroesferas mecánicamente con una pipeta serológica prewetted.</li>
		<li>Pellet de las células disociadas a 800 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging: Resuspend las células disociadas (paso 2.1.) en NMGF y dividir en el número necesario de matraces (1:3), e incubar en condiciones estándar. Las neuroesferas secundarias se formarán, y deben ser posteriormente disociadas para la formación de esferas terciarias.</li>
	<li>
Evaluación de la auto-renovación a largo plazo: Repetir el procedimiento de disociación hasta que el cultivo de la neuroesfera logre al menos 10 pasajes, lo que equivale a un mínimo de 2 meses en cultivo.</li>
	<li>
Congelación: Para criopreservar las neuroesferas, disociar las neuroesferas (paso 2.1.) y resuspend el pellet celular en medio de congelación de células de recuperación, alícuota en crioviales, congelación lenta, y almacenar en nitrógeno líquido.<ol>
<li>Para cultivar células de la neuroesfera a partir de un stock congelado: descongelar las células a 37 °C y transferirlas inmediatamente a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de DMEM/F12. Mezcle el tubo suavemente y luego gire las células a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Lave el pellet celular una vez más y resuspend las células en NMGF y transferir a un matraz de cultivo de tejido T25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Suspensión celular para implante intracraneal en ratón inmunocomprometado:<ol>
<li>Disociar las neuroesferas (paso 2.1.) y resuspend el pellet celular en DPBS libre de calcio y magnesio. Cuente las células viables usando un hemocytometer y la exclusión azul del trypan.</li>
		<li>Calcule el número de células necesarias para el implante, típicamente 3 x 105 células/ratón, transfiera el número deseado de células en un vial y g.</li>
		<li>Resuspend el pellet celular en un volumen apropiado para el implante (5 μl/ratón) tocando suavemente el tubo de microcentrífuga. Coloque la suspensión celular sobre hielo y use dentro de las 2 horas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Protocolo alternativo para el cultivo de células de glioblastoma tumorigénicas (para los casos en que el cultivo de neuroesfera falla)
<ol><li>Complemente el medio NMGF con suero bovino fetal a una concentración final de FBS/NMGF del 2%.</li>
	<li>
Comenzando con células en cultivo NMGF:Cosechar células viables del matraz NMGF(Figura 1F),resuspend en FBS/NMGF al 2% y placa a densidad relativamente baja (<1 x 105 células/ml) en un matraz de cultivo de tejidos T25 regular, y cultivo en condiciones estándar, 5% de CO2,37 °C, incubadora de cultivo de tejido humidificado(Figura 1G).</li>
	<li>
Comenzando con células congeladas nunca cultivadas (paso 1.14.): Descongelar las células, lavar en medio libre de suero y placa en FBS/NMGF al 2% y cultivar como se describe en el paso 3.2. El cultivo en NMGF durante 3 días antes de transferir células viables al 2% de FBS/NMGF es una alternativa para preseleccionar las células diferenciadas.</li>
</ol>4. Análisis Morfológico y Molecular de Neuroesferas por Inmunohistoquímica
<ol><li>Cultivar las neuroesferas hasta que la mayoría de los esferoides multicelulares flotantes alcancen los 100 μm de diámetro.</li>
	<li>Retire los frascos de cultivo de la incubadora e inmediatamente peletizar las neuroesferas, retire el medio y agregue 10 ml de DPBS sin alterar el pellet. Retire DPBS, resuspend en 10% neutro buffered formalina e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pellet de los esferoides, resuspend en etanol al 30% e incubar durante 30-45 min.</li>
	<li>Reemplace el etanol al 30% con etanol al 50%, incube durante 15 min y reemplácelo con etanol fresco al 50%, incube otros 30 min.</li>
	<li>Repetir (paso 4.4.) con etanol al 70%.</li>
	<li>Reemplazar con etanol al 95% dos cambios de 10-20 min cada uno, y repetir con etanol absoluto hasta que los esferoides sean de color blanco brillante y condensados.</li>
	<li>Haga un pequeño cono de papel de filtro con papel de lente y colóquelo en un pequeño embudo en un beaker. Moje el papel de la lente con alcohol absoluto.</li>
	<li>Afloje ligeramente el pellet con etanol fresco al 100%, vierta el exceso de etanol y vierta los esferoides a través del cono de papel de la lente, asegurándose de que vayan a la punta del cono. Enjuague el tubo con etanol absoluto adicional y vierta los esferoides restantes a través del cono de papel de la lente.</li>
	<li>Retire el cono de papel del embudo y mueva cuidadosamente los esferoides a la parte inferior del cono. Doble el papel en un cuadrado y asegúrese de que los esferoides estén lo más bien cerrados posible.</li>
	<li>Transfiera las neuroesferas empaquetadas a un casete y transfiéntelos a un procesador de tejido automático.</li>
	<li>Programe el procesador de tejido automático de la siguiente manera: etanol absoluto, 10 min, xileno, 15 min (2x), parafina, 10 min (4x).</li>
	<li>Extraiga el cassette del procesador y colócalo en la parte calentada de un sistema de incrustación de parafina. Asegúrese de que toda la superficie esté libre de fragmentos, polvo u otros desechos y sifón toda la parafina de los pozos de calentamiento de las autocarzas. Caliente las órceps libres de parafina limpia y agregue una pequeña cantidad de parafina a un molde de base calentado.</li>
	<li>Abra el cassette, retire el paquete y colócalo en la parte calentada del sistema de incrustación. Abra cuidadosamente el cono de papel hasta que los esferoides sean visibles. Reúna la mayor cantidad posible de material con las autorúceps precalentadas y transfiérame a la parafina líquida en el molde base.</li>
	<li>Repita el artículo según sea necesario para recuperar tantos esferoides como sea posible. Raspe suavemente el papel de seda con una cuchilla de afeitar limpia precalentada que se ha limpiado con etanol para recoger los esferoides residuales sin meter ningún papel en el bloque.</li>
	<li>Rompa cuidadosamente cualquier grupo esferoide con las autonúcciones calientes. Mueva los esferoides lejos de las esquinas en una capa central uniforme. Mueva el molde base al área de enfriamiento para asegurar los esferoides en su lugar, agregue el cassette, llene lentamente con parafina y enfríe bien.</li>
	<li>El bloque de la parafina de la neuroesfera se puede utilizar para el seccionamiento normal y el immunohistochemistry.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li><li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro.">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li><li>Joo, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo.">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma.">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li><li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria.">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li><li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours.">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li><li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype.">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li><li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells.">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La disociación enzimática apropiada de la célula del tumor es un paso crítico en este protocolo. El tejido deberá ser picado bien antes de la incubación en solución de disociación celular a 37 °C bajo rotación, durante un mínimo de 30 min, cuando el tejido deba ser triturado mecánicamente y verificada la extensión de la disociación. Dependiendo del grado de cohesión del tejido, la incubación se puede extender durante 15-30 minutos adicionales, según sea necesario para completar la disociación en células individuales. No se recomienda la incubación en solución de disociación durante más de 1 hora debido a la disminución de la viabilidad celular. Aunque la cantidad óptima de tejido que comienza sea magnesio 200-500, este protocolo ha llevado a las culturas acertadas de la neuroesfera de tan poco como el magnesio 50 del tejido del tumor.
El NMGF sin suero es un medio selectivo, y un porcentaje de células neoplásicas que comprenden la mayor parte del tumor, así como las células huésped, no sobrevivirá, mientras que otras se unirán al matraz tratado cultivo de tejidos después del revestimiento. Es fundamental que las neuroesferas que se formarán durante 1-3 semanas(Figuras 1B-E)se transfieran a matraces frescos, para separar de las células tumorales diferenciadas y los restos.
Las células GBM disociadas enzimáticamente y nunca cultivadas (paso 1.10) pueden ser criopreservadas como fuente de respaldo de células para cultivar en medios alternativos, en caso de que el cultivo de la neuroesfera falle. Hemos obtenido con éxito cultivos de neuroesfera de tales poblaciones congeladas, así como células monocapa que crecen en 2% FBS / NMGF.
Conceptualmente, la "célula madre cancerosa" es un trabajo en progreso y este campo emergente se beneficiará de una clarificación adicional, ya que las implicaciones clínicas son considerables, particularmente en la generación de heterogeneidad tumoral, plasticidad y resistencia a la terapia19,20. Además de ser vitales para generar modelos animales de GBM específicos para cada paciente, los cultivos de neuroesfera también son valiosos para estudios in vitro como la alteración en la señalización celular y la expresión génica en respuesta a factores de crecimiento, hipoxia y agentes farmacológicos11,21. Hemos optado por utilizar secciones transversales de neuroesferas fijas de formol y parafina incrustadas, preservando la arquitectura 3D, para estudiar la expresión de proteínas y las modificaciones postraduccionales por inmunohistoquímica11,debido a la localización subcelular superior en relación con el método más común de etiquetado e imagen de toda la esfera.
Se ha demostrado que no todas las células dentro de las neuroesferas derivadas del cerebro de mamíferos adultos son células madre22. Del mismo modo, las neuroesferas cultivadas a partir de tumores GBM probablemente no son clonales, debido a la presencia de células progenitoras cancerosas más diferenciadas y la autoa agregación, que se sabe que ocurren a altas densidades celulares23,lo que es considerado una limitación de este método por algunos. Para favorecer el enriquecimiento de las células madre autorrenovadoras a largo plazo, a diferencia de los progenitores que pueden crecer transitoriamente como neuroesferas22,las neuroesferas primarias se disocian para la formación de la neurosfera secundaria, y se pasan por un mínimo de 10 pasajes, aproximadamente equivalentes a 2 meses en cultivo continuo, lo que es una indicación de una población enriquecida en células madre22. En nuestra experiencia, las culturas de la neurosfera de GBM que alcanzan esa marca pueden continuar siendo ampliadas como neuroesferas indefinidamente. El grado tumoral importa, ya que hemos obtenido cultivos exitosos de GBMs y astrocitomas anaplásicos, grado IV y III de la OMS, respectivamente, pero no de gliomas de grado inferior.
El método más prevalente de cultivo de células de glioblastoma, en el medio de crecimiento tradicional complementado con FBS al 10%, conduce a una considerable divergencia genómica y fenotípica de los tumores originales 4. Por otro lado, los cultivos de neuroesfera son una fuente estable y a largo plazo de células que presentan el fenotipo4de células madre cancerosas. El método de la neuroesfera se ha vuelto cada vez más popular para el enriquecimiento de CSC en cultivos a largo plazo para modelos de xenoinjerto de ratón ortotópico, a pesar de no tener éxito para todas las muestras de astrocitomas de alto grado, lo que representa la principal debilidad de este método. Los estudios para entender cómo las características moleculares de los tumores parentales pueden afectar a la formación de la neurosfera están en curso. Se concede la exploración de métodos alternativos prácticos para cultivar gliomas de alto grado, seguida de una validación exhaustiva, dadas las ventajas trascendentales de tener modelos de GBM específicos para el paciente, a medida que avanzamos hacia una era de medicina personalizada, alimentada por la accesibilidad de la información "ómica" y el aumento del número de terapias dirigidas potenciales.

El glioblastoma (GBM), un astrocitoma de grado IV de la OMS, es el tumor cerebral primario más prevalente y agresivo. Diversos fenotipos de desarrollo son adoptados por las células tumorales GBM, incluyendo células que exhiben características de "células madre cancerosas" (CSC), como la expresión de marcadores de células madre neurales (NSC), auto-renovación a largo plazo, y el potencial de dar lugar a células más diferenciadas que expresan marcadores astrocíticos y forman la mayor parte del tumor1-3. Mientras que la clarificación todavía es necesaria con respecto a identidad molecular de CSC e implicaciones clínicas, el foco del actual trabajo está en la definición operacional de CSC: la uno mismo-renovación de largo plazo in vitro y la capacidad de distinguir y de reproducir el tumor original sobre la implantación orthotopic en roedores immunocompromised.
Las células del glioblastoma se han cultivado durante décadas en el medio tradicional que contiene el suero bovino fetal del 10% (FBS) y varias variedades de células del GBM cultivadas suero del suero del alto paso comercial son tumorigenic en roedores immunocompromised, pero hay considerable divergencia genomic y molecular del tumor original4,limitando su uso como modelos clínico relevantes. Más recientemente, se identificaron células con fenotipo madre/progenitor sensible al EGF y al bFGF en los GBMs2. Posteriormente, se cultivaron muestras de tumores gbm disociados en un medio libre de suero3,originalmente formulado para la selección y expansión de células madre neurales del cerebro de mamífero adulto5. Estas condiciones de cultivo dificultan el crecimiento de la mayoría de las poblaciones de células tumorales no neoplásicas y más diferenciadas, a la vez que favorecen el crecimiento de células madre y progenitoras como esferoides multicelulares flotantes, o neuroesferas3,imitando el comportamiento de las células madre neurales de mamíferos adultos5. La comparación completa lado a lado de las células primarias de GBM cultivadas en cualquier medio de la neuroesfera complementado con factores de crecimiento (NMGF) o en el medio de crecimiento tradicional complementado con FBS del 10%, reveló que las neuroesferas de GBM eran tumorigenic, presentaron potencial de la diferenciación del multilineage, y preservaron el genotipo del tumor original, en contraste con las culturas del 10% FBS que no eran tumorigenic en los pasos bajos y divergieron considerablemente de los tumores originales en los últimos pasajes4.
También se ha propuesto el aislamiento de CSC de tumores de GBM disociados por clasificación celular basada en la expresión del supuesto marcador CSC CD1336,7,pero trabajos posteriores indicaron que el fenotipo CSC no está definitivamente asociado a la expresión de talesmarcadores 8-10,disminuyendo el entusiasmo inicial por esta estrategia, mientras que nuevos marcadores aún están siendoprobados 10. La indisponibilidad hasta la fecha de un conjunto validado de marcadores que definen CSC, junto con el objetivo de la amplificación a gran escala de estas células para estudios preclínicos, hace que el uso de la clasificación celular sea poco práctico para los cultivos rutinarios enriquecidos con CSC. Las células GBM seleccionadas por la capacidad de crecer como neuroesferas en NMGF invariablemente expresan marcadores de células madre neurales. Hemos observado que Sox2 y nestin se expresan ubicuamente en cultivos de neuroesfera, mientras que la proteína CD133 está presente en un subconjunto de las neuroesferas GBM (datos inéditos y referencia11).
Varios laboratorios están persiguiendo cultivos de neuroesfera de tumores de glioblastoma utilizando el mismo enfoque general de disociación enzimática y cultivo en medio libre de suero complementado con factores de crecimiento3,4,11-14,mientras que otros colegas han reportado intentos de cultivar cultivos de neurosfera a largo plazo a partir de muestras de GBM sin éxito. El método general para la disociación enzimática y la cultura de la neuroesfera de los gliomas de alto grado presentados aquí es similar a qué se ha delineado en las publicaciones antedichos. Hemos optimizado el protocolo basado en nuestra experiencia de disociación y cultivo de más de 100 muestras GBM. La eficiencia de la obtención de cultivos de neuroesfera a largo plazo a partir de muestras frescas de GBM aplicando el protocolo aquí presentado es superior al 40%, similar a los pocos informes que muestran datos de eficiencia3,15,lo que lleva a la exploración de protocolos alternativos como el cultivo de células de forma continua o intermitente en medio sérico en presencia de EGF y bFGF como monocapas en superficies recubiertas con proteína ECM16,17. Los cultivos de neuroesfera siguen siendo el enfoque más validado y cada vez más popular para preservar las características moleculares de los tumores GBM y el potencial tumorigenic3,4,11-14,por lo tanto, nuestro enfoque es intentar los cultivos de neuroesferas primero, mientras que concomitantemente probamos métodos alternativos para cultivar células GBM que no pueden formar neuroesferas autorrenuentes a largo plazo(Figura 1),para aumentar la representación de los tumores GBM que se pueden utilizar en modelos animales. Aquí presentamos un protocolo para el cultivo de neuroesferas a partir de GBMs. Para las células que no logran formar neuroesferas, mostramos una modificación simple en el medio de crecimiento, como el primer intento de cultivar células tumorígenas de la no neuroesfera formando GBMs, con resultados prometedores y aún en proceso de validación extensa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin - EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14170-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type 4</td>
			<td style="width:143px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Albumin from Bovine Serum, cell culture grade</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lympholyte-Mouse</td>
			<td style="width:143px;">Cedarlane Laboratories Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">CL5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:143px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histoplex Tissue Cassettes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-146-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#160;Supplement</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KnockOut D-MEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stem Pro Neural Supplement&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>A1058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in  clinically relevant animal models and 3d immunochemistry

Los glioblastomas, la forma más común y agresiva de astrocitoma, son refractarios a la terapia y molecularmente heterogéneos. La capacidad de establecer cultivos celulares que preserven el perfil genómico de los tumores parentales, para su uso en modelos in vitro e in vivo específicos para pacientes, tiene el potencial de revolucionar el desarrollo preclínico de nuevos tratamientos para el glioblastoma adaptados a las características moleculares de cada tumor.
Comenzando con los tumores frescos del astrocytoma de alto grado disociados en solas células, utilizamos el análisis de la neurosfera como método del enriquecimiento para las células que presentan fenotipo de la célula madre del cáncer, incluyendo la expresión de los marcadores de los nervios de la célula madre, la uno mismo-renovación a largo plazo in vitro,y la capacidad de formar tumores orthotopic del xenograft. Este método ha sido propuesto previamente, y ahora está en uso por varios investigadores. De acuerdo con nuestra experiencia de disociar y de cultivar 125 especímenes del glioblastoma, llegamos al protocolo detallado que presentamos aquí, conveniente para el cultivo rutinario de la neurosfera de astrocytomas de alto grado y la extensión en grande de células tumorigenic para los estudios preclínicos. Divulgamos sobre la eficacia de culturas a largo plazo acertadas usando este protocolo y sugerimos alternativas asequibles para cultivar las células disociadas del glioblastoma que no pueden crecer como neuroesferas. También describimos en detalle un protocolo para preservar la arquitectura 3D de las neuroesferas para la inmunohistoquímica. Los cultivos celulares enriquecidos en CSCs, capaces de generar modelos de xenoinjerto ortotópicos que preservan las firmas moleculares y la heterogeneidad de los GBMs, son cada vez más populares para el estudio de la biología de los GBMs y para el diseño mejorado de las pruebas preclínicas de terapias potenciales.

Se ha aplicado el protocolo descrito anteriormente para disociar y cultivar 125 muestras frescas de glioblastoma quirúrgico(Figura 1),88 tumores recién diagnosticados y 37 recurrentes(Tabla 2),con el consentimiento del paciente aprobado y bajo directrices institucionales. La eficiencia del protocolo para el establecimiento de cultivos de neuroesfera a largo plazo fue de 41,6%, y similar para los tumores recién diagnosticados y los tumores recurrentes (Tabla 2). Para algunas muestras de GBM, las neuroesferas se forman en los primeros días (Figuras 1B y 1C), mientras que para otras se requiere un tiempo de cultivo más largo (Figuras 1D y 1E).
La eficiencia de la formación de la neuroesfera no dependió exclusivamente del nivel de necrosis en el tejido, como lo ejemplifican los resultados de un tumor recién diagnosticado con alta densidad celular (GBM1) y un tumor recurrente y necrótico (GBM2) procesado según los Protocolos 1 y 2, ambos produciendo cultivos de neuroesfera(Figura 2).
La prueba del potencial tumorigenic de cada cultura de la neurosfera en ratones immunocompromised es la validación crucial de este acercamiento para el enriquecimiento de CSCs. Usando un protocolo similar a18,GBM1 y GBM2 previamente las neurosferas fueron implantadas en los cerebros de ratones immunocompromised, bajo pautas institucionales y del cuidado animal de IACUC. Los tumores de xenoinjerto presentan características morfológicas de los GBMs, tales como invasión en el parénquima cerebral y necrosis (Figura 2).
Gbm3 fue disociado (Figura 1A) y cultivado en medio de la neuroesfera (Figuras 1D y 1E), y en 2% FBS /NMGF (Figuras 1D, 1G, y 1H). Se disociaron las células monocapa cultivadas en FBS/NMGF al 2% y las células de la neuroesfera cultivadas en NMGF y se implantó el mismo número de células en ratón desnudo, utilizando el mismo procedimiento que en la Figura 2. No se observaron diferencias en la supervivencia, la dinámica del crecimiento tumoral o la morfología entre los dos métodos de cultivo preimplantacional (Figuras 3A-C). Las características del crecimiento del tumor no cambian hasta el último paso probado, P20 para las neuroesferas, y P10 para el 2% FBS/NMGF. Mientras que los marcadores de células madre neurales, incluyendo Sox2, están regulados a la baja en la mayoría de las células primarias gbm cultivadas en 10% FBS 3,4,11,NMGF complementado con 2% FBS permite la retención de la expresión de Sox2(Figura 3D).
Las neuroesferas fueron procesadas de acuerdo con el Protocolo 4, y etiquetadas con H&E(Figura 4A),anticuerpo anti-Sox2, mostrando localización nuclear(Figura 4B),y anticuerpo EGFR, localización de la membrana celular(Figura 4C). Este protocolo se ha aplicado para acceder a alteraciones dependientes de estímulos en la expresión de nestina, GFAP, y el marcador de proliferación Ki6711.
Tabla 2. Eficiencia de derivar cultivos de neuroesfera auto-renovación a largo plazo de GBMs.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Patología</td>
			<td>N</td>
			<td>Porcentaje de muestras que producen neuroesferas autorrenonunudas a largo plazo (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - no tratado, primera cirugía</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma recidivante</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Figura 1. Cultivo celular a partir de muestras quirúrgicas de glioblastoma fresco. Los tumores frescos se disocian enzimáticamente en células individuales. La interfaz celular nucleada del medio de separación de densidad se platea en NMGF. Las neuroesferas disociadas se platean en NMGF, y típicamente 1 día después de la galjanoplastia hay células muertas, escombros, células individuales unidas y células de división ocasionales en suspensión(A). La formación de la neuroesfera es más rápida para algunos casos (B, C), y más lenta para otros (D, E). Todas las neuroesferas se disocian y se replated para por lo menos 10 pasos, 41.6% GBMs rinden neurosferas auto-renovación a largo plazo. Las células disociadas viables de GBM que no logran crecer como neuroesferas(F)se pueden transferir a condiciones de cultivo alternativas, por ejemplo, 2% FBS/NMGF(G,H). Barra (A), 100 μm, se aplica a todas las imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Figura 2. Generación de la neuroesfera y xenografts orthotopic del ratón de los tumores de GBM. Una muestra tumoral que presentaba alta densidad celular (GBM1) y un tumor con alto contenido necrótico (GBM2) fueron disociados y las neuroesferas cultivadas para 10 pasajes según los Protocolos 1 y 2. Los ratones immunocompromised fueron implantados con 3 x 105 células disociadas de la neuroesfera y sacrificados cuando moribundos. Los cerebros del ratón eran formalina fija y la parafina encajada para la coloración de H&E y la detección immunohistochemistry de marcadores humanos, de mitocondrias humanas (hMit) o de la subunidad importante HLA-A (MHC-I) de la clase I de la histocompatibilidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Figura 3. Crecimiento tumoral similar en ratones implantados por vía intracraneal con células GBM3 cultivadas como neuroesferas en NMGF o como monocapas en FBS/NMGF al 2%. (A)Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para GBM3 cultivadas como neuroesferas en NMGF o monocapas en 2%FBS/NMGF (ambos pasajes <10) no muestran diferencia en la supervivencia (n=10, p=0,7174, prueba de log-rank). (B)El crecimiento tumoral monitoreado por imágenes de bioluminiscencia en vivo (BLI) no muestra diferencias significativas en la dinámica del crecimiento tumoral entre los dos grupos. (C)La morfología tumoral es indistinguible para 4 xenoinjertos GBM3, 2 cultivados en NMGF y 2 cultivados en FBS/NMGF al 2%. Mancha MHC-I como se describe para la Figura 2. Escala, 600 μm. (D)Western blot mostrando la expresión sox2 del fabricante de células madre conservada en cultivos de FBS/NMGF al 2% utilizados para iniciar los tumores de xenoinjerto(A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Figura 4. Análisis de la expresión de proteínas en secciones de neuroesfera por inmunohistoquímica. Las culturas de la neuroesfera eran formalina-fijas y la parafina encajadas según lo descrito en el procedimiento 4, y manchadas con H&E(A),el anticuerpo anti-Sox2(b),y el anticuerpo anti-EGFR(C). Se utilizó sustrato DAB para visualizar(B,C). Barra, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

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Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

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