Name: primary culture of human vestibular schwannomas
Uploaded: 2014-07-20T14:00:00
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Soporte: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17

Declaración de Ética: el uso de las muestras de tumores humanos en este protocolo fue aprobado por la Universidad de Iowa Junta de Revisión Institucional (IRB). 1. Configuración del día de antes de la cosecha del tumor <ol><li> Placas de cultivo Escudo celulares: En una campana de cultivo estéril, añadir una cantidad suficiente (solución al 0,01%) de poli-L-ornitina para cubrir el fondo de una cultura de poliestireno / plástico y / plato, reemplace las tapas, y deje reposar a temp...

<ol>
	<li>Arthurs, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+treatment+modalities+for+vestibular+schwannoma.">A review of treatment modalities for vestibular schwannoma.</a> Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).</li><li>Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+2+[Bilateral+acoustic+neurofibromatosis,+central+neurofibromatosis.">Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis.</a> NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).</li><li>Anniko, M., Noren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Acoustic+Neurinoma+in+Organ-Culture+.1.+Methodological+Aspects.">The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects.</a> Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).</li><li>Manent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+cell+sorting+for+enriching+Schwann+cells+from+adult+mouse+peripheral+nerves.">Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves.</a> J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).</li><li>Nair, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+human+vestibular+schwannoma:+selective+growth+of+schwannoma+cells.">Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells.</a> Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).</li><li>Baur, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+promotes+differentiation,+adhesion+and+proliferation+of+cell+cultures+derived+from+human+acoustic+nerve+schwannoma.">Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma.</a> Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).</li><li>Cravioto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+neurinoma+in+tissue+culture.">Experimental neurinoma in tissue culture.</a> Acta Neuropathol. 21 (2), 154-164 (1972).</li><li>Kaasinen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+acoustic+neuroma--methodological+aspects.">Culturing of acoustic neuroma--methodological aspects.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 520 Pt 1, 25-26 (1995).</li><li>Kredel, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+of+Intracranial+Tumors+with+a+Note+on+the+Meningiomas.">Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas.</a> Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).</li><li>Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+versus+fibroblast+as+the+origin+of+the+specific+nerve+sheath+tumor:+Observations+upon+normal+nerve+sheaths+and+neurilemomas+in+vitro.">Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro.</a> Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).</li><li>Cravioto, H., Lockwood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavior+of+acoustic+neuroma+in+tissue+culture.">The behavior of acoustic neuroma in tissue culture.</a> Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).</li><li>Lee, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+alterations+of+the+NF2+gene+in+sporadic+vestibular+schwannomas.">Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas.</a> PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).</li><li>Wippold, F. J., 2nd, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology+for+the+neuroradiologist:+Antoni+A+and+Antoni+B+tissue+patterns.">Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns.</a> AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).</li><li>Mennel, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+tissue+culture+observations+of+experimental+primary+and+transplanted+nervous+system+tumors.">Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).</li><li>Rosenbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Schwann+cells+from+neurofibromatosis+type+2+patients.">Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients.</a> Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).</li></ol>

Historia de cultivos in vitro Schwannoma Los esfuerzos por establecer en cultivos in vitro schwannoma comenzaron tan sólo unas décadas después de que el neuroma acústico inicial resección quirúrgica abierta se produjo en 1894 12. Los primeros cultivos fueron grabadas por Kredel en la década de 1920, que intentó sin éxito para crecer tumor triturado por &quot;método de la gota colgante&quot; 12 . Más tarde, los Dres....

Schwannomas vestibulares (VSS) representan Schwann células (SC), los tumores del nervio vestibular, lo que compromete el 10% de todas las neoplasias intracraneales 1-3. VS ocurre en (neurofibromatosis tipo 2, NF2) formas ya sea esporádica o familiar, tanto asociados a defectos de inactivación del gen supresor tumoral NF2 gen. El tratamiento para la VS es generalmente la resección quirúrgica o radiocirugía, sin embargo, la morbilidad de estos procedimientos incluyen sordera, neuropatías faciales, fuga de líquido cefalorraquídeo, el desequilibrio, y el nuevo crecimiento del tumor 1. Además no todos los pacientes son candidatos para la cirugía o la radiación aceptables. Tal morbilidad significativa, así como una falta de terapias alternativas ha impulsado la investigación en la biología molecular única de VS en la esperanza de desarrollar nuevos tratamientos de 3,4. El cultivo celular permite el análisis rápido, fácil, y en profundidad del comportamiento molecular y celular y la detección del potencial terapéutico comlibra. Históricamente, la falta de acceso a los especímenes de tejido fresco y el hecho de que las células no se inmortalizan schwannoma han obstaculizado significativamente el uso de cultivos primarios para la investigación de la tumorigénesis schwannoma. Para superar la limitada oferta de los cultivos primarios, la línea celular inmortalizada HEI193 VS se generó por transducción con VPH E6 y E7 oncogenes 5. Esta transducción oncogénico introdujo alteraciones moleculares y fenotípicos significativos a las células, que limitan su uso como un modelo para los tumores schwannoma humanos. Culturas SC derivados de líneas de ratones transgénicos que carecen de un gen NF2 funcional representan otra alternativa para investigar la tumorigénesis SC NF2 in vitro dependiente. Estas culturas, sin embargo no pueden recapitular la naturaleza heterogénea de las VS humana o dar cuenta de la conducta humana específica. La mayoría de las técnicas anteriores cultura VS requieren tiempos de procesamiento relativamente largas y complicadas técnicas de cultivo selectivos 6-8.Aquí se presenta un protocolo simple, reproducible para primaria VS cultivo celular con un proceso completo en menos de 3 horas, con un 95% de pureza de las células tumorales como se determina por inmunotinción.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4957</td>
			<td style="width:167px;">Cell Culture Surface Treatment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laminin Mouse Protein&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">23017-015 / L2020</td>
			<td>Cell Culture Surface Treatment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2674</td>
			<td>Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TPS 100mm Round Culture Dish</td>
			<td style="width:71px;">Midwest Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Permanox 4 well slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1256521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Permanox 8 well slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1256522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Suction Filter Flask</td>
			<td style="width:71px;">Midwest Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TP99500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15ml Conical Tube</td>
			<td style="width:71px;">Midwest Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">50ml Conical Tube</td>
			<td style="width:71px;">Midwest Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TP91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2mL Round Bottom Tube</td>
			<td style="width:71px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small Scissor</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small Forceps</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Handle</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">#11 Scalpel Blade</td>
			<td style="width:71px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-9801-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-820-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">P1000 Pipetteman</td>
			<td style="width:71px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">P3963-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Serological Pipetteman</td>
			<td style="width:71px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">R3073-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips</td>
			<td style="width:71px;">Midwest Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TD1250R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulated Ice Cooler</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Baker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf -5810R</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td>Schwannoma Culture and Media Components</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-112</td>
			<td>Schwannoma Culture and Media Components</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Schwannoma Culture and Media Components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td>Schwannoma Culture and Media Components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td>Schwannoma Culture and Media Components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin - Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-163</td>
			<td>Schwannoma Culture and Media Components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Insulin (1mg/ml 200x)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td>Schwannoma Culture and Media Components</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of human vestibular schwannomas

Schwannomas vestibulares (VSS) representan Schwann células (SC), los tumores del nervio vestibular, lo que compromete el 10% de todas las neoplasias intracraneales. VS ocurre en (neurofibromatosis tipo 2, NF2) formas ya sea esporádica o familiar, tanto asociados a defectos de inactivación del gen supresor tumoral NF2 gen. El tratamiento para la VS es generalmente la resección quirúrgica o radiocirugía, sin embargo, la morbilidad de estos procedimientos ha conducido investigaciones sobre los tratamientos menos invasivos. Históricamente, la falta de acceso a los especímenes de tejido fresco y el hecho de que las células no se inmortalizan schwannoma han obstaculizado significativamente el uso de cultivos primarios para la investigación de la tumorigénesis schwannoma. Para superar la limitada oferta de los cultivos primarios, la línea celular inmortalizada HEI193 VS se generó por transducción con VPH E6 y E7 oncogenes. Esta transducción oncogénico introdujo alteraciones moleculares y fenotípicos significativos a las células, que limitan su uso como un modelo para s humanostumores chwannoma. Por lo tanto, ilustramos un protocolo reproducible simplificado para la cultura de los derechos humanos primaria células VS. Esta técnica permite dominar fácilmente para investigaciones moleculares y celulares que recapitulan con más precisión la complejidad de la enfermedad de VS.

La fragmentación del tumor correcta es esencial para la siembra óptima y el crecimiento en las placas de cultivo de tejido (Figura 1). Identificación de células schwannoma durante los primeros días después de la siembra es a menudo difícil, debido a oscurecer cantidades de residuos celulares y las células rojas de la sangre. Por el 4 º o 5 º día, las extensiones celulares cerca de fragmentos tumorales adherentes crearán reconocible &#39;cordón&#39; patrones entre los e...

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Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Cultivo primario de Human vestibular schwannomas

Vestibular schwannomas (VS) son tumores no malignos de células (SC) origen Schwann, asociadas a mutaciones en el gen supresor de tumores NF2. Se presenta un protocolo reproducible, eficiente para la enseñanza primaria humanos VS cultivo celular que permite la manipulación experimental molecular y celular y el análisis y recapitula la naturaleza heterogénea de la enfermedad humana.

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Piel biopsia en sacabocados explante cultura para Derivación de fibroblastos humanos primarios

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Investigación

Medicina

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Procesamiento de mamoplastia de reducción y tejidos humanos Mastectomía para el cultivo celular

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro organoide Cultura de tumores de colon primarios Ratón

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

El aislamiento, la cultura, y de imágenes de Human Fetal pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Un tejido tridimensional Cultura modelo para estudiar primaria médula ósea humana y sus malignidades

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Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias de las arterias y venas caninas

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Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

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Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Los desequilibrios musculares: Pruebas y entrenamiento de fuerza funcional excéntrico isquiotibiales en poblaciones deportivas

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To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...