Name: identification of post-translational modifications of plant protein complexes
Uploaded: 2014-02-22T15:00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes at JoVE.com

ويدعم VN من قبل الجمعية الملكية. JPR هو المستقبل زميل مجلس البحوث الأسترالي (FT0992129). نشكر الدكتور ميريام جيفورد لقراءة نقدية للمخطوطة.

ملاحظة: تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك. 1. إعداد المواد النباتية والمخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لN. benthamiana <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الأجرعية المورمة سلالات من الفائدة للتعبير عابر (في هذا المثال الملف Prf-FLAG، الملف Prf-3xHA، قدرة الإنطلاق-FLAG وناقلات الفارغة كعنصر تحكم) عن طريق هز (200 دورة في الدقيقة) في الثقافة السائل (L المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة) في 28 ° مئوية حتى مرحلة ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وجمع بيليه agrobacteria بواسطة الطرد المركزي (3،000 x ج لمدة 5 دقائق). تجاهل طاف و resuspend agrobacteria مكعبات العازلة في التسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كمية agrobacteria عن طريق الحصول على الكثافة الضوئية (OD) قيمة بأفضل الامتصاصية من 600 نانومتر (عبس 600 نانومتر). ضبط OD من البكتيريا إلى 0،1-0،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل N. 4 الاسبوع القديمة النباتات benthamiana (22 درجة مئوية، 16 ساعة ضوء) مع agrobacteria بواسطة هاند (مع حقنة needleless 1 مل) أو فراغ (إضافة 0.02٪ ت / ت السطحي). ملاحظة: استخدم أول ورقة موسعة تقريبا بالكامل، واثنين من الأوراق القديمة على الفور لأنجع تعبير البروتين. للكشف عن البروتينات ubiquitinated أو الأسيتيل التسلل أوراق مع 100 نيوتن متر MG-132 أو 100 نانوغرام / مل Trichostatin A، على التوالي، في 1 و 2 يوما بعد تسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأوراق تسلل 2-5 أيام آخر تسلل والتجميد في النيتروجين السائل. تخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية. ملاحظة: تحديد أفضل مستوى من التعبير عن بروتين من الفائدة مسبقا من قبل أخذ عينات على مدار الساعة من 5 أيام وكشف عن مستويات البروتين immunoblotting. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لA. thaliana خطوط المعدلة وراثيا مستقرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو A. thaliana البذور في 6 لوحات جيدة تستكمل مع 5 مل من السائل MS المتوسطة (1٪ ث / ت السكروز) لكل بئر. وضع 3-5 بذور (تعقيم والطبقية) من خط المعدلة وراثياالإهتمام أو خط السيطرة هو دون تغيير لكل بئر. يهز في 200 دورة في الدقيقة لمدة يومين قبل نقل لوحة لغرفة النمو ويترك لمدة 2 أسابيع (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحصاد والتجميد في النيتروجين السائل. ملاحظة: يمكنك استخدام كعنصر تحكم خط المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين لا علاقة لها مع نفس العلامة باسم البروتين من الفائدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة ألف دي الغاز المخزن المؤقت لمدة 1-2 ساعة (لRLKs، وغيرها من الغشاء ملزمة البروتينات والبروتينات النووية، إضافة 1٪ ت / ت IGEPAL CA-630 53). ملاحظة: يمكنك الاحتفاظ الاحتياطي A في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. يمكنك استخدام 1٪ ت / ت تريتون بدلا من IGEPAL CA-360. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 80 مل من البرد العازلة B 1-2 على الأقل ساعة قبل الاستخراج. ملاحظة: نسبة مثالية من الأنسجة العازلة مقابل استخراج هو 01:04 (ث / ت). </li></ol></li></ol> 2. استخراج البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل استخراج تحضير 80 مل من البرد العازلة C. <bص /&gt; ملاحظة: إضافة 10 ميكرومتر MG-132 للكشف عن البروتينات ubiquitinated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن 20 غرام من N. benthamiana أنسجة (حوالي 15 ورقة) أو A. thaliana الشتلات (2-4 غ لكل لوحة 6 جيدا) في النيتروجين السائل باستخدام قذائف هاون ومدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 مل من البرد العازلة C إلى 20 غرام من الأنسجة الأرض، وتخلط جيدا، وذوبان الجليد على الجليد. ملاحظة: طحن جميع العينات في نفس الوقت (بروتين من الفائدة والسيطرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس مع 3 رشقات نارية من 10 ثانية لكل بأقصى سرعة مع الخالط الأنسجة (prechilled في 4 درجات مئوية). تصفية من خلال الأنسجة 22-25 ميكرومتر وأجهزة الطرد المركزي في 30،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 ° C. ملاحظة: بدلا من ذلك، التجانس مع هاون ومدقة prechilled الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحجب وغسل الخطوات من المصفوفة تقارب، وإعداد 20 مل من العازلة D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة 100 مل من مناسبة مصفوفة تقارب باستخدام 500 مل من البرد العازلة التي تحتوي على 1٪ D BSA لمدة 5 دقائق عند 4 ° C. ملاحظة: المفضل بالعربيةوتشمل مصفوفات finity مكافحة FLAG M2 الاغاروز، Streptavidin الاغاروز، GFP-Trap_A ومكافحة HA الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X مع 1 مل الباردة العازلة D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من استخراج أوراق والتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون حقنة في أنبوب جديد على الجليد. ملاحظة: يجب أن يكون اللون الأخضر أو ​​الأصفر استخراج، وإذا تحولت العينة البني، وتجاهل والبدء من جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة من استخراج النفط الخام لطخة مناعية، إضافة 5X العازلة SDS-PAGE التحميل ودوامة وتفسد بواسطة عينات المغلي لمدة 10 دقيقة في 80-100 ° مئوية في كتلة الحرارة. </li></ol> 3. مناعي البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم استخراج البروتين إلى قسمين 50 مل أنابيب وإضافة 50 ميكرولتر من المصفوفة تقارب معلقة في الواق D لكل أنبوب. احتضان مع التناوب لطيف لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. ملاحظة: لم يتم العثور حضانات أطول لزيادة الغلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 600 ميكرولتر (6X حجم حبة من مصفوفة تقارب) من شطف العازلة بإضافة لالعازلة D (تركيزات النهائي): 0.5٪ BSA، الببتيد 0.25 ملغ / مل FLAG (لمكافحة FLAG M2 الاغاروز) أو 10 ملي مد البيوتين (لStreptavidin الاغاروز). ملاحظة: لا ينصح شطف في حالة GFP-Trap_A ومكافحة HA المصفوفات، لذلك الانتقال مباشرة لدرجة الغليان في 1X العازلة SDS-PAGE التحميل، خطوة 3.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيب مصفوفة تقارب بواسطة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية (5 دقائق في 1000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة من مستخلص غير منضم لطخة مناعية، وتجاهل بقية طاف، وترك حوالي 500 ميكرولتر في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend والحل الطين مع طرف واسعة الجوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل الطين مختلطة من كل من أنابيب واحد إلى 1.5 مل أنبوب. ملاحظة: من الآن فصاعدا، استخدم 1.5 مل المنخفضة البروتين ملزمة أنابيب microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3X النبض لمدة 5 ثانية باستخدام جهاز للطرد المركزي الفوق لترسيب مصفوفة تقارب وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3-5X مع 1 مل العازلة الباردة D. بين يغسل ترسيب ماتري تقاربس كما هو موضح سابقا وتجاهل طاف. في غسل مشاركة إزالة الزائدة العازلة D مع إبرة حقنة. ملاحظة: A غسل النهائي باستخدام العازلة D مع 0.1٪ IGEPAL يمكن استخدامها لزيادة خفض ملزم غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مع 200 ميكرولتر من شطف العازلة المناسبة (لمكافحة FLAG M2 أو Streptavidin الاغاروز خطوة انظر 3.2) 3X، 5 دقائق في كل مرة مع الهز المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع eluates 3 في أنبوب واحد. تركيز البروتينات باستخدام 30 ميكرولتر من الراتنج الاستيعاب. دوامة، واسمحوا الوقوف لمدة 5 دقائق ويعجل الراتنج (2 دقيقة عند 10،000 x ج). تجاهل طاف. ملاحظة: للحصول على GFP-Trap_A ومكافحة HA الاغاروز، تخطى الخطوات 3.9 و 3.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من 1X العازلة SDS-PAGE التحميل إلى مصفوفة تقارب عجلت أو الراتنج الاستيعاب. دوامة ويغلي لمدة 10 دقيقة في 80-100 ° مئوية في كتلة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمصفوفة تقارب المغلي أو الراتنج لمدة 2 دقيقة في 10،000 ز س. قسامة 5 ميكرولتر من supernatanر لطخة مناعية، وتشغيل مع الكسور الأخرى في الصعود إلى ~ 10 سم طويلة هلام SDS-PAGE (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل وتحديد البروتينات فسفرته بواسطة مطياف الكتلة، تحميل 45 ميكرولتر المتبقية في الصعود إلى ~ طويل 19 سم، وهلام SDS-PAGE إذا كان المطلوب فصل إضافي (الشكل 2). ملاحظة: يمكن تضمين حارة فارغ بين كل العينات للحد من تلوث العينات. </li></ol> 4. هضم البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على هلام SDS-PAGE مع الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) وصمة عار. ملاحظة: تصغير التعامل مع هلام للحد من التلوث مع keratins. تأكد من أن أيا من المعدات أو الأدوات التي استخدمت لimmunoblotting أو غيرها من الأنشطة التي قد لم يقم تلوث البروتين المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يزيل اللون هلام مع الغسيل وفيرة في الماء، ويفضل O / N. خفض الفرقة من الاهتمام من هلام بشفرة حلاقة نظيفة. ملاحظة: محاذاة هلام مع طخة مناعية إذا necessaراي لتحديد المنطقة الصحيحة. كما الفسفرة يمكن تأخير الهجرة من البروتينات على SDS-PAGE قطع المنطقة على الفور فوق وتحت عصابة من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزهر شريحة هلام إلى مكعبات من 2-4 ملم (وهذا يضمن أن الجل ستتم تغطيته من الحلول في أنبوب دون عرقلة نصائح ماصة). وضع في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير الحجم المطلوب للحفاظ على هلام المغمورة أيضا. استخدام هذا المبلغ لاشتقاق، الحضانة مع البروتيني واستخراج الببتيد، ومن ثم استخدام مزدوج إلى وحدات تخزين الثلاثي للغسيل. ملاحظة: في هضم نموذجية مع ما يقرب من 100 ميكرولتر من القطع قطع هلام، واستخدام 500 ميكرولتر حل للغسيل، 2 × 180 ميكرولتر من الجفاف، و 150 ميكرولتر للحد، و 120 ميكرولتر لالألكلة، و 120 ميكرولتر للهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل قطعة هلام 2 × 20 دقيقة (أو حتى destained) وذلك بإضافة 50٪ أسيتونتريل (في بيكربونات الأمونيوم 50 ملم، ABC). ماصة قبالة الحل مع الحرص على عدم إزالة قطعة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى مع 100٪ أسيتوالنتريل لمدة 5 دقائق وإزالة السائل الحرة. ملاحظة: يجب أن تظهر هلام منكمشة والأبيض. إذا استمرت اللون الأزرق، واحتضان أطول في أسيتونتريل / ABC و / أو في درجة حرارة مرتفعة (45-55 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض السندات ثاني كبريتيد البروتين بإضافة 10 ملي DTT في الماء واحتضان لمدة 30-45 دقيقة في 56 درجة مئوية مع الهز. إزالة السائل الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقايا السيستين يؤلكل بإضافة 55 ملي الكلوراسيتاميد (في 50 ملي ABC) لمدة 20-30 دقيقة (درجة حرارة الغرفة، والظلام). إزالة السائل الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل قطعة هلام 2 × 10 دقيقة مع 50٪ أسيتونتريل (في 50 ملي ABC). إزالة السائل الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى القطع هلام مع 100٪ أسيتونتريل لمدة 5 دقائق وإزالة السائل الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهضم زيتية، إضافة 40 ميكرولتر من محلول التربسين العمل (100 نانوغرام من التربسين في المخزن الهضم: 50 ملي ABC، 5٪ أسيتونتريل لمدة متوسطها الفرقة Coomassie الملون). السماح قطعة هلام لترطيب لمدة 10 دقيقة. إضافة ما يكفي من العازلة الهضم لتغطية قطعة هلام إذا لزم الأمر. احتضان عند 37 º CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوقف عملية الهضم واستخراج الببتيدات من القطع هلام، إضافة حمض الفورميك 5٪ (50٪ في أسيتونتريل) (إضافة نفس الحجم، حيث بلغ حجم الهضم). يصوتن لمدة 5-10 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد. كرر استخراج 3X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الببتيدات بواسطة تجفيد (المفضل) أو المكثف فراغ (مثل السرعة بطالة أو سافانت). تخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقدم عينتك لقياس الطيف الكتلي. ملاحظة: نحن لدينا عينة المقدمة إلى مرفق مطياف الكتلة في مختبر سينسبري (نورويتش، المملكة المتحدة). البروتوكولات في مرافق مطياف الكتلة تختلف اختلافا كبيرا، ولكن سيتم حله عادة الببتيدات في حمض trifluoroacetic 0.2٪ مع 2٪ أسيتونتريل قبل تحميل على نظام اللوني السائل إلى جانب الالكتروميكانيكية ورذاذ جنبا إلى جنب مطياف الكتلة. </li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة (مالية أو غيرها).

يمكن توضيح آلية تنشيط مستقبلات بواسطة PAMPs والمستجيبات تسهم إلى حد كبير في فهمنا للمناعة النبات. في السنوات ال 20 الماضية، كانت الشاشتين الهجين الوراثية والخميرة مفيدة لاكتشاف خنازير والبروتينات NB-LRR. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت البروتوكولات المستندة إلى مطياف الكتلة لتحديد البروتينات تنظم بشكل مختلف خلال المناعي إشارة 55-58، PTMs بهم 11،33،59،60، وتكوين المركبات المناعية 61 والمستجيب يستهدف 62. نحن هنا وصف بروتوكول واضحة لتحديد PTMs تنظيم تفعيل المجمعات المناعي. بالمقارنة مع البروتوكولات التي سبق وصفها، وهذا البروتوكول يسمح تحديد مفصل للتغيرات الديناميكية للPTMs. يمكن بروتوكولات النهج البروتينات واسعة النطاق تحديد PTMs من البروتينات ولكن ليست قادرة على الكشف عن اللدونة موقع PTMs بسبب الحدتبلغ إد من البروتين. في حالة البروتين الفسفرة، والنهج البروتينات على نطاق واسع عادة فقط تحديد المواقع الفسفرة السائد 11،33،59. توصيف مفصل للوضع البروتين الفسفرة يتطلب كمية كبيرة من البروتين التي يمكن الحصول عليها إلا من خلال تنقية جزئية من البروتين المستهدف 47. وصف بروتوكول هنا الأزواج نهج تنقية البروتين الذي ينتج كمية كبيرة من البروتين الهدف، مع تحليل الطيف الكتلي من البروتين النقي. بعد هذا البروتوكول، ويعزى هذا الحدث الفسفرة واحد من قدرة الإنطلاق في الغالب إلى سر-198 كما هو موضح سابقا 52 ولكن أيضا أيد بعض أطياف الطيف الشامل حدثا الفسفرة واحد على الثريونين-195-199 أو الثريونين. عندما لوحظت الأحداث الفسفرة ضعف قدرة الإنطلاق، كان الجمع الغالبة من الأحماض الأمينية فسفرته سر-198-199 والثريونين على الرغم من أن مجموعات على مواقع أخرى لوحظت أيضا (الجدول 1). هذه النتائج تظهر بوضوح اللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات والقدرة على البروتوكول وصف لوصف التفاصيل في جميع المواقع الفسفرة ممكن. الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي: 1) استخراج كافية من البروتينات؛ 2) حماية PTMs، و 3) كمية كافية من البروتين الهدف. أولا، لاستخراج ما يكفي من البروتينات، فمن المهم لطحن الأنسجة في النيتروجين السائل وبعد ذلك إلى استخدام الخالط الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول. إذا الخالط الأنسجة غير متوفرة، ويمكن استخدام قذيفة هاون ومدقة. من المهم أيضا لاستخدام نسبة 1-3 (أو أربعة) من غرام من الأنسجة لحجم استخراج العازلة. وهذا النسيج لتخفيف نسبة وقوة عازلة العالية التي نقترح ضمان أن الرقم الهيدروجيني ستبقى محايدة أثناء عملية الاستخراج. وجدنا أن هذا له أهمية خاصة لA. thaliana والطماطم اضافيةctions 52. حماية PTMs يمكن تحقيقه عن طريق بما في ذلك في جميع مخازن مثبطات الانزيمات المناسبة التي يمكن إزالة PTMs. ومن الأهمية بمكان أيضا لأداء جميع الخطوات في 4 درجات مئوية وprechill مخازن والصكوك. ويمكن تحقيق عائدات أعلى من البروتين المستهدفة باستخدام النباتات معربا عن البروتين بكميات كافية وباستخدام كميات عالية من الأنسجة (حوالي 20 غراما). الخطوة الأكثر أهمية للحصول على كميات كافية من البروتين الهدف هو تركيز البروتين الهدف عن طريق مناعي مباشرة. وسلط الضوء على أهمية هذه الخطوة التي كان فشلنا في تحديد PTMs من قدرة الإنطلاق بعد مناعي الملف Prf نظرا لكمية محدودة من coimmunoprecipitated التسليح (الشكل 2B). في المقابل، مناعي مباشرة لجهاز السياحة أسفرت عن الببتيدات إلى حد كبير أكثر قابلية للقياس (الشكل 2C) مما أدى إلى تغطية حوالي 80٪ من بروتين تسلسل وتحديد PTMs (الجدول 1). نحن أيضا شارعيوصي rongly استخدام حاتمة به للبروتين مناعي. بالمقارنة مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد الأم مصفوفة البروتينات حاتمة به تقارب يمكن أن تسفر عن كميات أكبر من البروتين النقي جزئيا. باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتين قدرة الانطلاق الأصلي 51 (الشكل 2A) للمناعي، وكنا قادرين على تحديد واحد فقط من الفسفرة الموقعين الفسفرة الغالبة من قدرة الإنطلاق. وقد وضعت في المقام الأول هذا البروتوكول لتنقية جزئية من N. benthamiana حشوية البروتين وتحديد اللاحقة من المواقع الفسفرة بهم. ومع ذلك، باستخدام التعديلات الموصوفة هنا، وهذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لA. البروتينات thaliana وغشاء ملزمة البروتينات. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لانتاج كميات كافية من البروتين المستهدف لتحديد PTMs وليس لتحقيق أعلى نقاء المجمع. إذا نقاء أعلىمطلوب من المجمع خطوة الثانية من تنقية يمكن أن تضاف إلى هذا البروتوكول 52. في هذه الحالة، فإن الخطوة الأولى تسمح شطف من البروتين الهدف من مصفوفة تقارب دون استخدام أملاح عالية أو حمض والخطوة اللاحقة قد يترتب عليها مصفوفة، الأمر الذي يتطلب ظروف قاسية شطف. من المهم التأكيد على أن اختبرناها فقط هذا البروتوكول لتحديد المواقع الفسفرة وأننا حاليا اختبار قدرتها لتحديد مفصل لPTMs إضافية. نتائجنا تظهر بوضوح ممثل اللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات والقدرة على البروتوكول وصف لتوصيف المواقع الفسفرة. الأهم من ذلك، أنها تسلط الضوء على أن تحديد مواقع الفسفرة تعتمد في كمية قليلة من البروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي والطفرات نقطة واحدة من المواقع لصناعة السيارات في الفسفرة يمكن أن تعطي نتائج مربكة. نعرض هنا وسابقا 47 </sup&gt; يترافق أن الفسفرة ضعف قدرة الإنطلاق على سر-198-199 والثريونين مع تفعيل المجمع الملف Prf / جهاز السياحة. في المقابل، أظهرت النتائج التي نشرت في وقت سابق أن الطفرات 47،63 نقطة واحدة من السير-198-199 والثريونين إلى ألانين، التي تمنع الفسفرة على هذه المواقع، هي قادرة على إشارات تشير إلى أن الفسفرة من هذه المواقع ليست شرطا أساسيا لتفعيل معقدة . ويمكن الآن هذه النتائج يمكن تفسيرها من خلال الفسفرة من الموقع الثانوي الثريونين-195. نظرة مماثلة في اللدونة موقع الفسفرة الأخرى بروتين كيناز يمكن الحصول على هذا البروتوكول التالية. علاوة على ذلك، نهج الجمع باستخدام مواقع الفسفرة نقطة الطفرات، والبروتينات التي يمكن أن تمنع تحركات محددة (المستجيبات) إلى جانب مناعي البروتين وتحليل الطيف الكتلي سوف يؤدي إلى فهم أفضل لأهمية التطورية للاللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات.

مسارات المناعي تعتمد على مختلف التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتينات لتنبيغ بسرعة الإشارات وتنشيط الاستجابات المناعية 1. PTMs هي التعديلات الكيميائية السريعة، وعكسها، ومحددة للغاية من بنية البروتين التي يمكن أن تؤثر على التشكل البروتين، والنشاط، والاستقرار، والترجمة، والبروتين البروتين التفاعلات 2-4. في النباتات، وقد تم تحديد أكثر من 300 أنواع من PTMs بما في ذلك ubiquitination، sumoylation، الكبرتة، ارتباط بالغليكوزيل، والفسفرة 2،5. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة يسلط الضوء على أهمية PTMs في جوانب مختلفة من الحصانة محطة 1،5،6. الفسفرة البروتين، المرفق عكسها من مجموعة الفوسفات إلى سيرين، وبقايا ثريونين أو التيروزين هو منظم من العديد من الوظائف الخلوية وليس من المستغرب أن معظم درس غاية PTM دفاعا النبات يشير شلالات 5-11. التي تعتمد على الفسفرة الإشارات هي جزء لا يتجزأ من defe النباتبدأ تفعيل NSE بعد الإدراك خارج الخلية من الميكروبات عن طريق مستقبلات عبر الغشاء، أو الاعتراف الخلايا من البروتينات المقاومة متعددة المجالات 5،8. عند غزو النباتات، يتم الكشف عن الميكروبات عن طريق مستقبلات غشاء البلازما تسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 12. خنازير المعروفة هي إما مثل مستقبلات البروتينات (RLPs) أو تحركات مثل مستقبلات (RLKs)، وكلاهما يحمل ectodomain ملزم يجند وعلى مسار واحد عبر الغشاء المجال. وعلى النقيض من RLPs، RLKs ديك مجال الخلايا كيناز 13-15. وectodomain من خنازير بربط الحفظ جزيئات ميكروب يسمى elicitor أنماط المرتبطة الممرض الجزيئية (PAMPs) الرائدة، في حالة RLKs، لautophosphorylation ونقل الفسفوريل ضمن المجال داخل الخلايا 6، 16. المصب التي يسببها تصور الفسفرة من خنازير، الفسفرة اللاحقة للبروتينات حشوية بما في ذلك تحركات 17، </suع&gt; 18، E3 ligases 19،-mitogen تنشيط تحركات البروتينات (MAPKs) 20، 21، تعتمد على الكالسيوم تحركات البروتينات (CDPK) 22، 23، وعوامل النسخ 24 و 25 يؤدي إلى الحصانة أثار PAMP (PTI). بالإضافة إلى تصور خارج الخلية من قبل خنازير، ويتحقق الاعتراف الخلايا من مسببات الأمراض من خلال مستقبلات حشوية. هذه المقاومة متعددة المجالات (R) البروتينات تحتوي على متغير نطاق N-محطة، مركزية ملزمة النوكليوتيدات (NB) عزر، ويكرر-يسين الغنية C-محطة (LRR)، وبالتالي تسمى البروتينات NB-LRR 26، 27. البروتينات R تعترف مباشر أو غير مباشر جزيئات الفوعة المستمدة من الممرض دعا المستجيبات، والمعروف أيضا لاستهداف خنازير والعقد الأخرى في الجهاز المناعي. الاعتراف يدفع دفاعات قوية مما يؤدي إلى الحصانة أثار المستجيب (ETI) 28-31. البروتينات NB-LRR ديك requisiعزر الشركة المصرية للاتصالات ATP ملزم ضمن المجال NB 30، 32، لكنهم يفتقرون مجال كيناز. وقد تم الإبلاغ عن الفسفرة من المجالات الحفظ من NB-LRRS في مسح البروتين على نطاق واسع 33، ولكن أهميتها لETI غير واضح. على نحو مماثل لPTI، وتفعيل البروتينات NB-LRR يؤدي إلى الفسفرة من البروتينات السيتوبلازمية بما في ذلك MAPKs 34-37 وCDPKs 38-40. الأهم من ذلك، يمكن أن يؤدي إلى الاعتراف المستجيب الفسفرة من البروتينات الإكسسوارات التي تتفاعل مباشرة مع البروتينات NB-LRR 41. وتشمل بعض الأمثلة RIN4 (نبات الأرابيدوبسيس thaliana) وحديد التسليح (الطماطم، مغد قوطة) البروتينات التي تتفاعل مع البروتينات NB-LRR، RPM1 42 و 43 و 44 الملف Prf، على التوالي. خلال العدوى عن طريق البكتيريا الزائفة syringae، البروتين المستجيب AvrB يدفع RIN4 الفسفرة، وعلى الأرجح من قبل مثل مستقبلات كيناز RIPK 45، <sup&gt; 46. وبالمثل، في الطماطم وP. syringae المستجيبات AvrPto وAvrPtoB لحث الفسفرة من قدرة الإنطلاق 47. وعلى النقيض من RIN4 التي تفتقر مجال كيناز ويجب أن يكون عبر فسفرته، قدرة الإنطلاق هو كيناز نشطة قادرة على صناعة السيارات في الفسفرة 48 وعبر الفسفرة من ركائز 49، 50. في حين يتطلب قدرة الإنطلاق النشاط كيناز من أجل تعتمد على المستجيب بدء الإشارات، المسوخ قدرة الإنطلاق-كيناز القتلى لا تزال قادرة على إشارة على نحو المستجيب مستقلة 51. شرحنا في الآونة الأخيرة هذه الملاحظات من خلال إظهار أن المجمع الملف Prf / جهاز السياحة هو من oligomeric، التي تحتوي على العديد من الجزيئات الملف Prf وقدرة الانطلاق 52 وأن جزيئات جهاز السياحة داخل المجمع نفسه يمكن عبر الفوسفات بعضها البعض 47. اقترحنا نموذج التي جزيء واحد من حديد التسليح (استشعار) تتفاعل مع بروتين المستجيب، مما تسبب في تغير التشكل إلى البروتين NB-LRR (الملف Prf) وهذا بدوره ينشط جزيء قدرة الإنطلاق الثاني (المساعد) الطرافةهين المجمع. في وقت لاحق، والمساعد قدرة الإنطلاق جزيء عبر phosphorylates استشعار قدرة الانطلاق مما يؤدي إلى تنشيط كامل للمقاومة معقدة 47. وتبين هذه الأمثلة أن تحديد مكونات مجمع المناعي وPTMs إمكاناتهم على الاعتراف المستجيب يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للكيفية التي يتم transduced إشارات من المستجيب تصور لأهداف المصب. نحن هنا تصف طريقة تنقية البروتين لNB-LRR-التفاعل البروتينات وتحديد اللاحقة من PTMs بهم. نستخدم نيكوتيانا benthamiana ومجمع الطماطم الملف Prf / جهاز السياحة كنموذج، ولكن يمكن بسهولة أن تطبق نفس البروتوكول لRLKs من N. benthamiana وA. thaliana 53 مع تعديلات صغيرة كما وصفنا في البروتوكول.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

النباتات التكيف بسرعة مع تغير البيئات نظرا لوضع تصور وأنظمة إنذار. خلال الهجوم الممرض والنباتات الاستجابة السريعة للعدوى عن طريق تجنيد وتنشيط مجمعات المناعي. ويرتبط التنشيط في مأمن من المجمعات مع بعض التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتينات، مثل الفسفرة، ارتباط بالغليكوزيل، أو ubiquitination. وفهم كيفية فشلت هذه PTMs يؤدي إلى فهم أفضل للكيفية التي يتم تحقيق المقاومة. نحن هنا تصف طريقة تنقية البروتين لليسين الغنية تكرار ملزمة النوكليوتيدات (NB-LRR) تتفاعل البروتينات وتحديد اللاحقة من التعديلات بعد متعدية الخاصة بهم (PTMs). مع تعديلات صغيرة، وبروتوكول يمكن تطبيقها لتنقية البروتينات النباتية الأخرى المجمعات. ويستند هذا الأسلوب على التعبير عن إصدار الموسومة حاتمة من البروتين من الفائدة، والذي فيما بعد تنقيته جزئيا بذ مناعي وتعرض لمطياف الكتلة لتحديد التفاعل البروتينات وPTMs. هذا البروتوكول يوضح أن: ط). ويمكن الكشف عن التغيرات الدينامية في PTMs مثل الفسفرة بواسطة مطياف الكتلة؛ الثاني). فمن المهم أن يكون بكميات كافية من البروتين من الفائدة، وهذا يمكن أن تعوض عن عدم وجود نقاء immunoprecipitate؛ الثالث). من أجل الكشف عن PTMs من البروتين من الفائدة، وهذا البروتين لابد من immunoprecipitated للحصول على كمية كافية من البروتين.

نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية البروتينات الموسومة المعدلة وراثيا من مستقرة A. thaliana خطوط أو بعد التعبير عابرة للبروتينات في N. benthamiana. كما هو موضح في الشكل رقم 1 يقترن تنقية البروتين المستهدف مع مطياف الكتلة للسماح تحديد التفاعل البروتينات وPTMs من البروتين المستهدفة. وقد تم تصميم بروتوكول لتنقية البروتينات المشاركة في الحصانة النبات وتحديد PTMs ولكن يمكن تطبيقها على تنقية أي البروتينات النباتية الموسومة. كمثال نستخدم تنقية معقدة الملف Prf / قدرة الإنطلاق من N. benthamiana. وN. المعدلة وراثيا خط benthamiana 38-12 54، معربا عن 35S: PTO، تحولت عابر مع 35S: تم immunoprecipitated الملف Prf-FLAG ومعقدة مع المضادة للFLAG M2 الاغاروز (الشكل 2A). وimmunoblots (IB) في الشكل 2Aتوضيح أنه تم immunoprecipitated معظم البروتين المستهدفة (الملف Prf). تم copurified قدرة الإنطلاق والبروتين المستجيب التفاعل مع AvrPtoB الملف Prf والكشف باستخدام الأجسام المضادة وتحليل الطيف الكتلي (أرقام 2A و 2B). وجدنا أن جهاز السياحة أن copurified مع الملف Prf هاجر أبطأ على هلام SDS-PAGE عندما coexpressed مع المستجيب يبني 35S: AvrPto و35S: AvrPtoB (الشكل 2A). كل من البروتينات المستجيب بفعل الهجرة أبطأ من جهاز السياحة الملف Prf-التفاعل (الشكل 2A). هذا المستجيب تعتمد على الاعتراف الهجرة بطء جهاز السياحة ويعزى سابقا إلى الفسفرة كما يمكن إزالته عن طريق العلاج مع الفوسفاتيز 44. للكشف عن مواقع الفسفرة المساهمة في هجرة بطيئة من قدرة الإنطلاق، ونحن يتعرض copurifying الملف Prf قدرة الانطلاق لتحليل الطيف الكتلي. على الرغم من التعبير عالية من التسليح والكشف سهلة مع immunoblots نتمكن من استرداد الببتيدات جovering 57٪ فقط من تسلسل جهاز السياحة وفشلنا في تحديد أي المواقع الفسفرة (الشكل 2B). بعد ذلك، قمنا بتغيير استراتيجيات لاستهداف البروتين قدرة الإنطلاق مع المضادة للFLAG. N. تحولت محطات benthamiana WT عابر مع 35S: الملف Prf-35S 3HA و: PTO-FLAG، مع أو بدون 35S: AvrPto و35S: AvrPtoB كان المبلغ الإجمالي للبروتين قدرة الإنطلاق، التي تضم كلا من الملف Prf المعقد وأشكال حرة، immunoprecipitated مع المضادة للFLAG M2 الاغاروز وتعرض للتجزئة SDS-PAGE، في جل الهضم زيتية والتحليل الطيفي الشامل (الشكل 2C). مع هذا النهج حددنا الببتيدات قدرة الإنطلاق تغطي حوالي 80٪ من تسلسل ومجهول 100 كيلو دالتون بروتين التفاعل. حددنا مجموعة من المواقع الفسفرة مفردة ومزدوجة لجهاز السياحة الببتيدات 187-202 188-202 و(الجدول 1). كانت سر-198-199 والثريونين المواقع الفسفرة السائد ولكن بو أخرىكما تم الكشف عن مواقع sphorylation (الجدول 1). وقد تم تحديد الفسفرة الأكثر أهمية مزدوجة على سر-198-199 والثريونين فقط في وجود إما بروتين المستجيب (الجدول 1). حددنا مؤخرا مجموعة مماثلة من مواقع الفسفرة جهاز السياحة ويتضح أهمية هذا الحدث الفسفرة مزدوجة للانزعاج 47. بعد بروتوكول الموصوفة هنا كنا قادرين على تحديد التغيرات الدينامية في الدولة الفسفرة من البروتين الهدف. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> الشكل 1. التصميم التجريبي عام. البروتين المستهدف لمناعي (IP) غير الموسومة، وأعرب في بلانتا، عابر في نيكوتيانا benthamiana أو ثابت في نبات الأرابيدوبسيس thaliana. بعد استخراج البروتين ووimmunoprecipitated البروتين المستهدفة مع مصفوفة تقارب. يتم فصل البروتينات على هلام الأكريلاميد من قبل الكهربائي. يتم استئصال العصابات هلام. يتم استخراج البروتينات من العصابات هلام وتعرض لمطياف الكتلة. ويتم تحديد مواقع الفسفرة والبروتينات المتفاعلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> الشكل 2. الملف Prf وقدرة الانطلاق مناعي ألف). وبناء 35S: أعرب الملف Prf-FLAG عابر في خط 38-12 (35S: جهاز السياحة) جنبا إلى جنب مع ناقلات فارغة (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB. تم immunoprecipitated ثلاثة أيام آخر تسلل الملف Prf استخدام الألغام المضادة للFLAG تقارب المصفوفة. اللقاحاتأجريت noblots (IB) للالملف Prf، AvrPtoB وقدرة الإنطلاق. كما أشار بواسطة السهام في الجزء السفلي من لوحة جهاز السياحة طخة مناعية، AvrPto وAvrPtoB تحفز على الهجرة أبطأ من قدرة الإنطلاق باء). وبناء 35S: أعرب الملف Prf-FLAG عابر في خط 38-12 (35S: جهاز السياحة) جنبا إلى جنب مع ناقلات فارغة (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB. تم immunoprecipitated ثلاثة أيام آخر تسلل الملف Prf استخدام الألغام المضادة للFLAG الاغاروز وفصلها على SDS-PAGE. كانت ملطخة الجل مع الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) والملف Prf مرئية، تم رفعه جهاز السياحة وAvrPtoB البروتينات العصابات من الجل وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. يشار إلى تغطية نسبة الببتيد قدرة الإنطلاق والملف Prf متواليات التي حددها مطياف الكتلة. C). وأعرب عن قدرة الإنطلاق-FLAG عابر جنبا إلى جنب مع 35S: بنيات 35S: الملف Prf-35S 3xHA وAvrPtoB، 35S: AvrPto أو ناقلات الفارغة (EV) في N. benthamiana. ثلاثة أيام بعد تسلل المبلغ الإجمالي للتم immunoprecipitated قدرة الإنطلاق-FLAG استخدام الألغام المضادة للFLAG الاغاروز وحلها على SDS-PAGE. تم رفعه جهاز السياحة وضوحا وقدرة الإنطلاق-التفاعل نطاقات البروتين من الهلام وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. جهاز السياحة و100 كيلو دالتون قدرة الإنطلاق-التفاعل الفرقة البروتين هي واضحة للعيان على الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) الملون وهلام، في حين أن الملف Prf قليلا أقل وضوحا (كما يتبين من السهام). IP: مناعي؛ IB: طخة مناعية؛ مصرف البحرين المركزي: Coomassie بريليانت الأزرق تلطيخ؛ cCBB: الغروية Coomassie بريليانت الأزرق تلطيخ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> PRF </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> قدرة الإنطلاق الببتيد 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [ص 195 T] HLSTVVK </td><tد&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [ص S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [ص 199 T] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [ص 190 T] ELDQTHLS [ص 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [ص S 198] [ص 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> قدرة الإنطلاق الببتيد 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [ص 195 T] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [ص S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [ص 199 T] VVK </tد&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [ص 195 T] HLS [ص 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [ص S 198] [ص 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> الببتيدات 187-202 188-202 و </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> نسبة الببتيدات مع حدثين الفسفرة </td><td> 0٪ </td><td> 26.9٪ </td><td> 11.2٪ </td></tr><tr><td> قدرة الإنطلاق تسلسل التغطية </td><td> 78٪ </td><td> 79٪ </td><td> 82٪ </td></tr></tbody></table> الجدول 1 الفسفرة مزدوجة من الببتيد قدرة الإنطلاق على تفعيل يشير 35S:. الملف Prf-35S 3xHA و: PTO-FLAG وأعرب عن عابر جنبا إلى جنب مع مشركة خاصة ناقلات (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB في N. benthamiana. ثلاثة أيام آخر تسلل تم immunoprecipitated المبلغ الإجمالي للبروتين قدرة الإنطلاق-FLAG استخدام الألغام المضادة للFLAG تقارب مصفوفة وحلها على SDS-PAGE. تم رفعه العصابات مرئية من قدرة الإنطلاق على الغروية Coomassie الرائعة هلام الملون الأزرق وتحليلها مع مطياف الكتلة. وأشار عدد من الببتيدات تحديدها مع قدرة الإنطلاق 0، 1، 2 والأحداث الفسفرة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> جدول مخازن </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L المتوسطة </td><td> تريبتون </td><td> 10 ز / L </td></tr><tr><td></td><td> خلاصة الخميرة </td><td> 5 ز / L </td></tr><tr><td></td><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 5 ز / L </td></tr><tr><td></td><td> D-الجلوكوز </td><td> 1 جرام / لتر </td></tr><tr><td> العازلة الزراعية تسلل </td><td> MgCl 2 </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ الدفتيريا&gt; <td> 10 ملي </td></tr><tr><td></td><td> ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acetosyringone (اختياري) </td><td> 150 ميكرومتر </td></tr><tr><td> العازلة A </td><td> تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 </td><td> 150 ملي </td></tr><tr><td></td><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 150 ملي </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 ملي </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 مم </td></tr><tr><td></td><td> الغليسيرول </td><td> 5٪ (V / V) </td></tr><tr><td> العازلة B </td><td> العازلة A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2٪ (ث / ت) </td></tr><tr><td> العازلة C </td><td> العازلة B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td></td><td> مصنع المانع البروتياز كوكتيل </td><td> 1٪ (V / V) </td></tr><tr><td></td><td> Phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF) </td><td> 0.5 ملي </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin A </td><td> 50 نانومتر </td></tr><tr><td></td><td> فلوريد الصوديوم (ناف) </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td></td><td> كربونات الصوديوم (نا 2 زارة النفط 4) </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td></td><td> Orthovanadate الصوديوم </td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td></td><td> حمض Okadaic </td><td> 100 نانومتر </td></tr><tr><td> العازلة D </td><td> C العازلة دون PVPP </td><td></td></tr><tr><td> 5X SDS-PAGE العازلة تحميل </td><td> تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 </td><td> 60 ملي </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2٪ </td></tr><tr><td></td><td> الغليسيرول </td><td> 0.15٪ </td></tr><tr><td></td><td> برموفينول الأزرق </td><td> 0.10٪ </td></tr><tr><td></td><td> التلفزيون الرقمي الأرضي (إضافة فقط قبل الاستخدام) </td><td> 50 ملي </td></tr></tbody></table> الجدول 2. العازلة وصفات وسائل الإعلام.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes at JoVE.com

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية وتوصيف المجمعات البروتين النباتي. علينا أن نظهر ذلك من خلال immunoprecipitating بروتين واحد ضمن مجمع، حتى نتمكن من تحديد التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية والشركاء التفاعل فيها.

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

طريقة لعزل وتحديد من microRNAs، وmRNAs ومكونات البروتين من بروتين نووي ريبوزي مجمعات من مقتطفات خلية باستخدام رقاقة RIP

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على<sup&gt; 15</sup&gt; N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...