Name: identification of post-translational modifications of plant protein complexes
Uploaded: 2014-02-22T15:00:00
Duration: 10 min 7 s
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वी.एन. रॉयल सोसायटी द्वारा समर्थित है. JPR एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद भविष्य बंदे (FT0992129) है. हम समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ. मरियम जिफोर्ड धन्यवाद.

लेखकों वे (वित्तीय या अन्य) कोई प्रतिस्पर्धा हितों है कि घोषणा.

PAMPs और effectors द्वारा रिसेप्टर सक्रियण के तंत्र elucidating संयंत्र उन्मुक्ति के बारे में हमारी समझ के लिए काफी योगदान दे सकते हैं. पिछले 20 वर्षों में, आनुवंशिक और खमीर दो संकर स्क्रीन PRRs और नो बॉल LRR प्रोटीन की खोज के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. हाल ही में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटोकॉल 55-58 संकेत प्रतिरक्षा, उनके PTMs 11,33,59,60 दौरान विभिन्न विनियमित प्रोटीन की पहचान के लिए स्थापित किया गया है, प्रतिरक्षा परिसरों 61 और प्रेरक की रचना 62 लक्ष्य. यहाँ हम प्रतिरक्षा परिसरों की सक्रियता को विनियमित करने PTMs की पहचान के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन. पहले वर्णित प्रोटोकॉल के साथ इसकी तुलना में, इस प्रोटोकॉल PTMs के गतिशील परिवर्तन की विस्तृत पहचान देता है. बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण के प्रोटोकॉल प्रोटीन की PTMs पहचान लेकिन सीमित करने के कारण PTMs की साइट plasticity प्रकट करने में सक्षम नहीं हो सकताएड प्रोटीन की मात्रा. प्रोटीन phosphorylation के मामले में बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण आमतौर पर केवल प्रमुख phosphorylation साइटों 11,33,59 पहचान. एक प्रोटीन phosphorylation स्थिति की विस्तृत विशेषताओं केवल लक्ष्य प्रोटीन 47 का आंशिक शोधन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है कि प्रोटीन का एक पर्याप्त राशि की आवश्यकता है. प्रोटोकॉल शुद्ध प्रोटीन का मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ, जोड़ों यहाँ लक्ष्य प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में पैदावार कि एक प्रोटीन शुद्धि दृष्टिकोण का वर्णन किया. इस प्रोटोकॉल के बाद Pto की एकल phosphorylation घटना पहले 52 के रूप में वर्णित Ser-198 के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार ठहराया है, लेकिन कुछ मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्पेक्ट्रा भी Thr-195 या Thr-199 पर एक एकल phosphorylation घटना का समर्थन किया था. Pto की डबल phosphorylation घटनाओं मनाया गया जब अन्य साइटों पर संयोजन भी मनाया गया, हालांकि, phosphorylated अमीनो एसिड के प्रमुख संयोजन (SER-198 और thr-199 थातालिका 1). इन परिणामों से स्पष्ट रूप से प्रोटीन kinases की phosphorylation साइट plasticity और विवरण में हर संभव phosphorylation साइटों को चिह्नित करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल की क्षमता प्रदर्शित करता है. इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: प्रोटीन की 1) पर्याप्त निकासी; PTMs के 2) सुरक्षा और लक्ष्य प्रोटीन की 3) पर्याप्त राशि. सबसे पहले, प्रोटीन की पर्याप्त निकासी के लिए, यह तरल नाइट्रोजन में ऊतक पीसने के लिए और बाद में प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक ऊतक homogenizer का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक ऊतक homogenizer उपलब्ध नहीं है, तो एक मोर्टार और मूसल इस्तेमाल किया जा सकता है. यह तीन (या चार) निष्कर्षण बफर की मात्रा को ऊतक के ग्राम के लिए एक के अनुपात का उपयोग करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. अनुपात और हम सुझाव है कि उच्च शक्ति बफर बफर करने के लिए इस ऊतक पीएच निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान तटस्थ रहेगा यह सुनिश्चित करेगा. हम इस ए के लिए विशेष महत्व का है कि पाया thaliana और टमाटर अतिरिक्तctions 52. PTMs की सुरक्षा के सभी बफ़र्स PTMs निकाल सकते हैं कि एंजाइमों की उचित inhibitors में शामिल करके प्राप्त किया जा सकता है. यह 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों को पूरा करने के लिए और buffers और उपकरणों prechill के लिए भी महत्वपूर्ण है. लक्ष्य प्रोटीन की अधिक पैदावार के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन व्यक्त पौधों का उपयोग करके और ऊतक (लगभग 20 ग्राम) की उच्च मात्रा का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. लक्ष्य प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रत्यक्ष immunoprecipitation द्वारा लक्ष्य प्रोटीन ध्यान केंद्रित कर रहा है. इस कदम के महत्व के कारण coimmunoprecipitated Pto (चित्रा 2 बी) के सीमित राशि को एक PRF immunoprecipitation के बाद Pto की PTMs की पहचान करने के लिए हमारी विफलता से प्रकाश डाला है. इसके विपरीत, Pto के प्रत्यक्ष immunoprecipitation प्रोटीन अनुक्रम और PTMs (1 टेबल) की पहचान की लगभग 80% कवरेज के लिए अग्रणी काफी अधिक औसत दर्जे का पेप्टाइड्स (चित्रा -2) मिले. हम भी सेंटrongly प्रोटीन immunoprecipitation के लिए मिलान टैग के इस्तेमाल की सिफारिश. देशी प्रोटीन का मिलान टैग आत्मीयता मैट्रिक्स के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी की तुलना में आंशिक रूप से शुद्ध प्रोटीन की उच्च मात्रा प्राप्ति कर सकते हैं. Immunoprecipitation के लिए देशी Pto प्रोटीन 51 (2A चित्रा) के खिलाफ उठाया एक एंटीबॉडी का उपयोग करके, हम Pto के दो प्रमुख phosphorylation साइटों के केवल एक phosphorylation की पहचान करने में सक्षम थे. इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से एन के आंशिक शुद्धि के लिए विकसित किया गया है benthamiana cytoplasmic प्रोटीन और उनके phosphorylation साइटों के बाद पहचान. हालांकि, इस के साथ साथ वर्णित संशोधन का उपयोग कर, इस प्रोटोकॉल आसानी ए के लिए अनुकूलित किया जा सकता thaliana प्रोटीन और झिल्ली बाध्य प्रोटीन. इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य PTMs की पहचान के लिए लक्ष्य प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में उपज के लिए और जटिल की उच्चतम शुद्धता को प्राप्त करने के लिए नहीं है. यदि उच्च शुद्धताजटिल आवश्यक है की शुद्धि के दूसरे चरण में इस प्रोटोकॉल 52 में जोड़ा जा सकता है. उस मामले में, एक पहला कदम कठोर क्षालन स्थितियों की आवश्यकता है, जो उच्च लवण या एसिड के उपयोग और बाद के कदम के बिना आत्मीयता मैट्रिक्स से लक्ष्य प्रोटीन की क्षालन एक मैट्रिक्स आवश्यक हो सकता है की अनुमति देगा. यह हम केवल phosphorylation साइटों की पहचान के लिए इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया है और हम वर्तमान में अतिरिक्त PTMs की विस्तृत पहचान के लिए अपनी क्षमता का परीक्षण कर रहे हैं कि है कि उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे प्रतिनिधि परिणाम स्पष्ट रूप से प्रोटीन kinases की phosphorylation साइट plasticity और phosphorylation साइटों को चिह्नित करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल की क्षमता प्रदर्शित करता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, वे मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा और ऑटो phosphorylation साइटों के एकल बिंदु उत्परिवर्तन से प्रोटीन की कम राशि में भरोसा phosphorylation साइटों की पहचान भ्रामक परिणाम दे सकता है कि प्रकाश डाला. हम यहाँ और पहले दिखाने के 47 </sup&gt; Ser-198 और thr-199 पर Pto की है कि डबल phosphorylation PRF / Pto परिसर के सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ है. इसके विपरीत, पहले प्रकाशित परिणामों 47,63 Ser-198 और thr-199 के एकल बिंदु उत्परिवर्तन जटिल सक्रियण के लिए एक शर्त है कि इन साइटों की है कि phosphorylation सुझाव संकेत करने में सक्षम हैं, इन साइटों पर phosphorylation नहीं है जो रोकने, alanine को पता चला है कि . इन परिणामों अब द्वितीयक साइट Thr-195 की phosphorylation द्वारा समझाया जा सकता है. अन्य प्रोटीन kinase की phosphorylation साइट plasticity में इसी प्रकार की अंतर्दृष्टि इस प्रोटोकॉल के बाद प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, phosphorylation साइटों का उपयोग कर एक संयुक्त दृष्टिकोण म्यूटेशन, प्रोटीन kinases की phosphorylation साइट plasticity की विकासवादी महत्व की एक बेहतर समझ को बढ़ावा मिलेगा प्रोटीन immunoprecipitation और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ मिलकर विशिष्ट kinases (effectors) को बाधित कर सकते हैं कि प्रोटीन इशारा करते हैं.

इम्यून रास्ते तेजी से संकेत transduce और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 को सक्रिय करने के लिए प्रोटीन के विभिन्न बाद translational संशोधनों (PTMs) पर भरोसा करते हैं. PTMs प्रोटीन रचना, गतिविधि, स्थिरता, स्थानीयकरण, और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 2-4 प्रभावित कर सकते हैं कि प्रोटीन संरचना का तेजी से प्रतिवर्ती, और अति विशिष्ट रासायनिक परिवर्तन होते हैं. पौधों में, PTMs के 300 से अधिक प्रकार के ubiquitination, sumoylation, Sulfation, ग्लाइकोसिलेशन, और phosphorylation 2,5 सहित पहचान की गई है. सबूत के एक बढ़ती शरीर संयंत्र उन्मुक्ति 1,5,6 के विभिन्न पहलुओं में PTMs के महत्व पर प्रकाश डाला गया. प्रोटीन phosphorylation, एक सेरीन के लिए एक फॉस्फेट समूह की प्रतिवर्ती लगाव, threonine या tyrosine अवशेषों कई सेलुलर कार्यों की एक नियामक है और आश्चर्य नहीं कि सबसे उच्च Cascades 5-11 संकेत संयंत्र बचाव में PTM का अध्ययन किया. Phosphorylation निर्भर संकेतन संयंत्र टॉवर का एक अभिन्न हिस्सा हैएनएसई सक्रियण multidomain प्रतिरोध प्रोटीन 5,8 द्वारा transmembrane रिसेप्टर्स द्वारा रोगाणुओं के बाह्य धारणा, या intracellular मान्यता के बाद शुरू की. पौधों पर हमला करने पर, रोगाणुओं पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) 12 बुलाया प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स द्वारा पता चला रहे हैं. ज्ञात PRRs रिसेप्टर की तरह प्रोटीन (RLPs) या रिसेप्टर की तरह kinases (RLKs), दोनों एक ligand बाध्यकारी ectodomain ले जाने और एक एकल पास transmembrane डोमेन या तो कर रहे हैं. RLPs के विपरीत, RLKs एक intracellular kinase डोमेन 13-15 है. PRRs की ectodomain RLKs के मामले में, intracellular डोमेन 6, 16 के भीतर autophosphorylation और transphosphorylation करने, रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) के प्रमुख बुलाया संरक्षित सूक्ष्म जीव elicitor अणुओं को बांधता है. PRRs की धारणा प्रेरित phosphorylation के बहाव, kinases 17 सहित cytoplasmic प्रोटीन के बाद phosphorylation, </su&gt; 18 पी, E3 19 ligases, mitogen सक्रिय प्रोटीन kinases (MAPKs) 20, 21, कैल्शियम पर निर्भर प्रोटीन kinases (CDPK) PAMP ट्रिगर प्रतिरक्षा (पीटीआई) के लिए 22, 23, और प्रतिलेखन 24 कारकों, 25 होता है. PRRs द्वारा बाह्य धारणा के अलावा, रोगजनकों के intracellular मान्यता cytoplasmic रिसेप्टर्स के माध्यम से हासिल की है. ये multidomain प्रतिरोध (नि.) प्रोटीन एक चर एन टर्मिनस डोमेन, एक केंद्रीय न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी (नो बॉल) आकृति, और सी टर्मिनल leucine संपन्न दोहराता (LRR) होते हैं और इसलिए नो बॉल LRR प्रोटीन 26, 27 कहा जाता है. आर प्रोटीन सीधे या परोक्ष रूप से भी PRRs और प्रतिरक्षा प्रणाली के अन्य नोड्स को लक्षित करने के लिए जाना जाता effectors बुलाया रोगज़नक़ व्युत्पन्न डाह अणुओं की पहचान. मान्यता प्रेरक ट्रिगर प्रतिरक्षा (ETI) 28-31 के लिए अग्रणी मजबूत गढ़ लाती है. नो बॉल LRR प्रोटीन एक requisi हैते नायब डोमेन 30, 32 के भीतर आकृति एटीपी बाध्यकारी, लेकिन वे एक kinase डोमेन की कमी है. नो बॉल Lrrs के संरक्षित डोमेन की phosphorylation एक बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक सर्वेक्षण 33 में सूचित किया गया, लेकिन ETI के लिए अपनी प्रासंगिकता स्पष्ट नहीं है. इसी पीटीआई को, नो बॉल LRR प्रोटीन की सक्रियता MAPKs 34-37 और CDPKs 38-40 सहित cytoplasmic प्रोटीन की phosphorylation की ओर जाता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रेरक मान्यता नो बॉल LRR प्रोटीन 41 के साथ सीधे बातचीत कि गौण प्रोटीन की phosphorylation के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. कुछ उदाहरणों में नो बॉल LRR प्रोटीन के साथ बातचीत प्रोटीन है कि RIN4 (Arabidopsis thaliana) और Pto (टमाटर, टमाटर) शामिल हैं, RPM1 42, 43 और क्रमशः PRF 44,. स्यूडोमोनास syringae बैक्टीरिया से संक्रमण के दौरान, प्रेरक प्रोटीन AvrB, रिसेप्टर की तरह kinase RIPK 45 से सबसे अधिक संभावना है, RIN4 phosphorylation लाती <sup&gt; 46. इसी तरह, टमाटर में पी. syringae AvrPto और AvrPtoB Pto 47 की phosphorylation प्रेरित effectors. एक kinase डोमेन का अभाव है और पार phosphorylated होना चाहिए जो RIN4 के विपरीत, Pto ऑटो phosphorylation 48 और substrates 49, 50 के पार phosphorylation में सक्षम एक सक्रिय kinase है. Pto सिगनल की प्रेरक निर्भर दीक्षा के लिए अपने kinase गतिविधि की आवश्यकता है, kinase मृत Pto म्यूटेंट अभी भी एक प्रेरक स्वतंत्र तरीके से 51 में संकेत कर रहे हैं. हमने हाल ही में PRF / Pto जटिल कई PRF युक्त, oligomeric है और Pto 52 अणु और एक ही परिसर के भीतर Pto अणुओं 47 एक दूसरे के पार phosphorylate कर सकते हैं कि प्रदर्शन से इन टिप्पणियों की व्याख्या की. हम Pto (सेंसर) के एक अणु बारी में एक दूसरे Pto अणु (सहायक) बुद्धि को सक्रिय करता है कि नो बॉल LRR प्रोटीन (PRF) के लिए एक रचना परिवर्तन के कारण, प्रेरक प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान, जिसमें एक मॉडल का प्रस्तावजटिल हिन. इसके बाद सहायक Pto अणु सेंसर Pto जटिल प्रतिरोध 47 से भरा सक्रियण के लिए अग्रणी पार phosphorylates. ये उदाहरण प्रेरक मान्यता पर प्रतिरक्षा जटिल उपकरणों और उनके संभावित PTMs की पहचान संकेत बहाव के लक्ष्यों के लिए प्रेरक धारणा से transduced रहे हैं की एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है. यहाँ हम नो बॉल LRR बातचीत प्रोटीन और उनके PTMs के बाद पहचान के लिए एक प्रोटीन शोधन विधि का वर्णन. हम एक मॉडल के रूप में निकोटियाना benthamiana और टमाटर PRF / Pto जटिल उपयोग करें, लेकिन एक ही प्रोटोकॉल आसानी एन से RLKs के लिए लागू किया जा सकता है benthamiana और ए छोटे संशोधनों के साथ thaliana 53 हम प्रोटोकॉल के भीतर का वर्णन के रूप में.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

संयंत्रों धारणा विस्तृत करने के कारण बदलते परिवेश और प्रणालियों संकेत करने के लिए जल्दी से अनुकूलित. रोगज़नक़ हमले के दौरान, पौधों को तेजी से प्रतिरक्षा परिसरों की भर्ती और सक्रियण के माध्यम से संक्रमण का जवाब. प्रतिरक्षा परिसरों के सक्रियण ऐसे phosphorylation, ग्लाइकोसिलेशन, या ubiquitination के रूप में प्रोटीन के बाद translational संशोधनों (PTMs), के साथ जुड़ा हुआ है. इन PTMs नृत्य कर रहे हैं समझ कैसे प्रतिरोध हासिल की है की एक बेहतर समझ को बढ़ावा मिलेगा. यहाँ हम न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी leucine संपन्न दोहराने (नो LRR) बातचीत प्रोटीन और उनके बाद translational संशोधनों (PTMs) के बाद पहचान के लिए एक प्रोटीन शोधन विधि का वर्णन. छोटे संशोधनों के साथ, प्रोटोकॉल अन्य संयंत्र प्रोटीन परिसरों की शुद्धि के लिए लागू किया जा सकता है. विधि बाद में आंशिक रूप से शुद्ध होता है जो ब्याज की प्रोटीन, बी के एक मिलान टैग संस्करण की अभिव्यक्ति पर आधारित हैY immunoprecipitation और बातचीत प्रोटीन और PTMs की पहचान के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के अधीन है. इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि: मैं). ऐसे phosphorylation रूप PTMs में गतिशील परिवर्तन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जा सकता है, द्वितीय). यह ब्याज की प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में है, और इस immunoprecipitate की शुद्धता की कमी के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं महत्वपूर्ण है, iii). ब्याज की एक प्रोटीन की PTMs का पता लगाने के लिए आदेश में, यह प्रोटीन प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए immunoprecipitated हो गया है.

हम स्थिर ट्रांसजेनिक ए से टैग प्रोटीन की शुद्धि के लिए यहाँ एक प्रोटोकॉल का वर्णन thaliana लाइनों या एन में प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति के बाद benthamiana. चित्रा 1 में सचित्र रूप में लक्षित प्रोटीन की शुद्धि बातचीत प्रोटीन और लक्षित प्रोटीन की PTMs की पहचान की अनुमति मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित है. प्रोटोकॉल संयंत्र उन्मुक्ति और उनके PTMs की पहचान में शामिल प्रोटीन की शुद्धि के लिए डिजाइन किया गया है, लेकिन किसी भी टैग किए गए संयंत्र प्रोटीन की शुद्धि के लिए लागू किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में हम एन से PRF / Pto परिसर के शुद्धीकरण का उपयोग benthamiana. ट्रांसजेनिक एन 35S व्यक्त benthamiana लाइन 38-12 54,: PTO, क्षणिक 35S के साथ बदल गया था: PRF-झंडा और जटिल विरोधी झंडा M2 agarose (2A चित्रा) के साथ immunoprecipitated गया था. चित्रा 2A में immunoblots (आईबी)लक्षित प्रोटीन (PRF) के सबसे immunoprecipitated गया था कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना. पीटीओ और बातचीत प्रेरक प्रोटीन AvrPtoB PRF साथ copurified और (आंकड़े 2A और 2 बी) एंटीबॉडी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग पाया गया. AvrPto और 35S: AvrPtoB (2A चित्रा) हम प्रेरक 35S constructs के साथ coexpressed जब PRF साथ copurified कि Pto एसडीएस पृष्ठ जेल पर धीमी माइग्रेट पाया. दोनों प्रेरक प्रोटीन PRF बातचीत Pto (2A चित्रा) की धीमी प्रवास प्रेरित किया. यह फॉस्फेट 44 के साथ इलाज के द्वारा हटाया जा सकता है के रूप में Pto की इस प्रेरक मान्यता पर निर्भर धीमी माइग्रेशन पहले phosphorylation के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. Pto की धीमी गति से प्रवास करने के लिए योगदान phosphorylation साइटों का पता लगाने के लिए, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करने PRF copurifying Pto अधीन. Pto की उच्च अभिव्यक्ति और immunoblots साथ अपने आसान पता लगाने के बावजूद हम पेप्टाइड्स सी पुनः प्राप्त कर सकताPto अनुक्रम का केवल 57% overing और हम किसी भी phosphorylation साइटों (चित्रा 2 बी) की पहचान करने में विफल रहा. इसके बाद, हम विरोधी झंडा. एन के साथ Pto प्रोटीन को लक्षित करने के लिए रणनीति बदल PRF-3HA और 35S: PTO-झंडा के साथ या 35S बिना: AvrPto और 35S: benthamiana गुम्मट पौधों क्षणिक 35S के साथ बदल रहे थे. AvrPtoB PRF-complexed और मुफ्त रूपों दोनों शामिल Pto प्रोटीन, की कुल राशि immunoprecipitated था विरोधी झंडा M2 agarose और एसडीएस पृष्ठ fractionation में जेल tryptic पाचन और बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण (चित्रा -2) के अधीन है. इस दृष्टिकोण के साथ हम अपने अनुक्रम का लगभग 80% और एक अज्ञात 100 केडीए बातचीत प्रोटीन फैले Pto पेप्टाइड्स की पहचान की. हम Pto पेप्टाइड्स 187-202 और 188-202 (तालिका 1) के लिए सिंगल और डबल phosphorylation साइटों का एक सेट की पहचान की. Ser-198 और thr-199 प्रमुख phosphorylation साइटों लेकिन अन्य फोटो थेsphorylation साइटों को भी पता चला रहे थे (1 टेबल). Ser-198 और thr-199 पर सबसे महत्वपूर्ण बात यह डबल phosphorylation ही प्रेरक प्रोटीन (तालिका 1) या तो की उपस्थिति में पहचान की थी. हमने हाल ही में Pto phosphorylation साइटों की एक समान सेट की पहचान की और 47 संकेतन के लिए डबल phosphorylation घटना के महत्व को सचित्र. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के बाद हम लक्ष्य प्रोटीन की phosphorylation राज्य में गतिशील परिवर्तन की पहचान करने में सक्षम थे. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> चित्रा 1. जनरल प्रयोगात्मक डिजाइन. लक्ष्य प्रोटीन immunoprecipitation (आईपी) के लिए क्षणिक निकोटियाना benthamiana में या stably Arabidopsis thaliana में, Planta में टैग और व्यक्त किया है. प्रोटीन निकासी के बादलक्ष्य प्रोटीन एक आकर्षण मैट्रिक्स के साथ immunoprecipitated है. प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक acrylamide जेल पर अलग हो रहे हैं. जेल बैंड excised हैं. प्रोटीन जेल बैंड से निकाला और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के अधीन हैं. Phosphorylation साइटों और बातचीत प्रोटीन की पहचान कर रहे हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> चित्रा 2. PRF और Pto immunoprecipitation. ए). निर्माण 35S: PRF-झंडा क्षणिक 38-12 रेखा (35S: PTO) में व्यक्त की गई थी खाली वेक्टर (ईवी) के साथ साथ, 35S: AvrPto या 35S: AvrPtoB. तीन दिनों के बाद घुसपैठ PRF विरोधी झंडा आत्मीयता मैट्रिक्स का उपयोग immunoprecipitated गया था. ImmuPRF, AvrPtoB और Pto के लिए noblots (आईबी) का प्रदर्शन किया गया. Pto immunoblot पैनल के नीचे तीरों से कहा, AvrPto और AvrPtoB) Pto. बी की एक धीमी प्रवास को प्रेरित. निर्माण 35S: PRF-झंडा क्षणिक 38-12 रेखा (35S: PTO) में व्यक्त की गई थी खाली वेक्टर (ईवी) के साथ साथ, 35S: AvrPto या 35S: AvrPtoB. तीन दिनों के बाद घुसपैठ PRF विरोधी झंडा agarose का उपयोग immunoprecipitated और एसडीएस पृष्ठ पर अलग हो गया था. जेल कोलाइडयन Coomassie खूब ब्लू (cCBB) और दिखाई PRF साथ सना हुआ था, Pto और AvrPtoB प्रोटीन बैंड जेल से excised और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान Pto और PRF दृश्यों का प्रतिशत पेप्टाइड कवरेज संकेत दिया है. सी). निर्माणों 35S: PRF-3xHA और 35S: PTO-झंडा क्षणिक 35S के साथ व्यक्त किया गया: AvrPtoB, 35S: AvrPto या एन में खाली वेक्टर (ईवी) benthamiana. तीन दिनों में कुल राशि के बाद घुसपैठPTO-झंडा agarose विरोधी ध्वज का उपयोग immunoprecipitated और एसडीएस पृष्ठ पर हल किया गया था. दिखाई Pto और Pto बातचीत प्रोटीन बैंड जेल से excised और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया. PRF (तीर द्वारा संकेत के रूप में) से थोड़ा कम दिखाई देता है जबकि पीटीओ और 100 केडीए PTO-बातचीत प्रोटीन बैंड, कोलाइडयन Coomassie खूब ब्लू (cCBB) दाग जेल पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. आईपी: Immunoprecipitation, आईबी: Immunoblot, CBB: Coomassie खूब ब्लू धुंधला; cCBB: कोलाइडयन Coomassie खूब ब्लू धुंधला हो जाना. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> PRF </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> ईवी </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> पीटीओ पेप्टाइड 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [पी टी 195] HLSTVVK </td><tडी&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [पी एस 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [पी टी 199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> जी [पी टी 190] ELDQTHLS [पी टी 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [पी एस 198] [पी टी 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> पीटीओ पेप्टाइड 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [पी टी 195] एचएलएस TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [पी एस 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [पी टी 199] VVK </tडी&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [पी टी 195] एचएलएस [पी टी 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [पी एस 198] [पी टी 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> पेप्टाइड्स 187-202 और 188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> दो phosphorylation घटनाओं के साथ पेप्टाइड्स का प्रतिशत </td><td> 0% </td><td> 26.9% </td><td> 11.2% </td></tr><tr><td> पीटीओ अनुक्रम कवरेज </td><td> 78% </td><td> 79% </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> तालिका 1 35S संकेत के सक्रियण पर एक PTO पेप्टाइड का डबल phosphorylation:.. PRF-3xHA और 35S: PTO-झंडा क्षणिक उन्हें साथ साथ व्यक्त किया गयाPty वेक्टर (ईवी), 35S: AvrPto या 35S: एन में AvrPtoB benthamiana. तीन दिनों के बाद घुसपैठ PTO-झंडा प्रोटीन की कुल राशि विरोधी झंडा आत्मीयता मैट्रिक्स का उपयोग immunoprecipitated और एसडीएस पृष्ठ पर हल किया गया था. कोलाइडयन Coomassie शानदार नीले दाग जेल पर Pto दिखाई बैंड मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ excised और विश्लेषण किया गया. Pto 0 के साथ की पहचान पेप्टाइड्स, 1, और 2 phosphorylation घटनाओं की संख्या संकेत दिया है. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> बफ़र्स के पटल </td><td></td><td></td></tr><tr><td> एल मध्यम </td><td> Tryptone </td><td> 10 जी / एल </td></tr><tr><td></td><td> खमीर निकालने </td><td> 5 ग्राम / एल </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 ग्राम / एल </td></tr><tr><td></td><td> डी ग्लूकोज </td><td> 1 जी / एल </td></tr><tr><td> कृषि घुसपैठ बफर </td><td> 2 MgCl </td><td> 10 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> एमईएस &lt;/ P&gt; <td> 10 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> 5.5 पीएच को समायोजित करें </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acetosyringone (वैकल्पिक) </td><td> 150 माइक्रोन </td></tr><tr><td> बफर </td><td> Tris-एचसीएल 7.5 पीएच </td><td> 150 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> ग्लिसरोल </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> बफर बी </td><td> बफर </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> बफर सी </td><td> बफर बी </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dithiothreitol (डीटीटी) </td><td> 10 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> प्लांट protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> Phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) </td><td> 0.5 मिमी </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin एक </td><td> 50 एनएम </td></tr><tr><td></td><td> सोडियम फ्लोराइड (NAF) </td><td> 50 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> सोडियम molybdate (2 ना मू 4) </td><td> 10 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> सोडियम Orthovanadate </td><td> 1 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> Okadaic एसिड </td><td> 100 एनएम </td></tr><tr><td> बफर डी </td><td> बफर सी PVPP बिना </td><td></td></tr><tr><td> 5x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर </td><td> Tris-एचसीएल 6.8 पीएच </td><td> 60 मिमी </td></tr><tr><td></td><td> एसडीएस </td><td> 2% </td></tr><tr><td></td><td> ग्लिसरोल </td><td> 0.15% </td></tr><tr><td></td><td> Bromophenol नीले </td><td> 0.10% </td></tr><tr><td></td><td> डीटीटी (बस का उपयोग करने से पहले जोड़) </td><td> 50 मिमी </td></tr></tbody></table> तालिका 2. बफर और मीडिया व्यंजनों.

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Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

हम यहां संयंत्र प्रोटीन परिसरों की शुद्धि और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम एक परिसर के भीतर एक प्रोटीन immunoprecipitating द्वारा, तो हम इसके बाद translational संशोधनों और अपनी बातचीत भागीदारों की पहचान कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है.

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