Name: study of cell migration in microfabricated channels
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00
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Les auteurs remercient grandement la plate-forme IBiSA PICT à l&#39;Institut Curie (CNRS UMR 144). Ce travail a été financé par des subventions de: le Conseil européen de la recherche à AM.LD (Strapacemi 243103), l&#39;Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-Piri-0027-CPV), la fondation InNaBioSanté (Micemico) à MP et AM. LD et l&#39;ERC Strapacemi jeune subvention de chercheur à AM.LD.

Note importante: Ce protocole suppose que le moule contenant la forme pour les microcanaux désirés ont déjà été accomplis. Pour plus d&#39;informations sur la préparation du moule a été déjà publié 10. Ce protocole suppose aussi que la culture des pays en développement de la moelle osseuse est connu. Une. Fabrication de puces <ol><li> Mélanger l&#39;huile PDMS et l&#39;agent de durcissement dans un rapport pondéral 10:01 dans un gobelet en plastiq...

<ol>
	<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres:+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines.">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li><li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decisions+about+dendritic+cells:+past,+present,+and+future.">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. 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Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li><li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions.">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li><li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels.">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li><li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li><li>Heuz&#233;, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Dum&#233;nil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+confinement:+a+micro-channel-based+assay.">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li><li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+method+for+modifying+poly(dimethylsiloxane)+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules.">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li><li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Teflon+microfluidic+chips.">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li><li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+World+Cell+Race.">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li></ol>

Ici, nous décrivons un dispositif composé de microcanaux comme une méthode pour étudier les propriétés migratoires des grand nombre de cellules dans des expériences simples. Ce système expérimental imite les contraintes environnementales confinés trouvés dans les tissus par des cellules migratoires endogènes. Cependant, en forçant la migration dans une seule dimension, il facilite le suivi automatique de la cellule et l&#39;extraction de paramètres mesurables (Figure 5). Nous montrons éga...

La migration est une fonction cellulaire complexe qui est important pour de nombreux processus physiologiques chez les organismes multicellulaires, y compris le développement, les réponses immunitaires, et la régénération des tissus. En outre, certaines situations pathologiques telles que l&#39;invasion tumorale et les métastases reposent sur ​​la motilité cellulaire 1. Pour ces raisons, la migration cellulaire est devenu un domaine d&#39;étude dans le cadre de la recherche à la fois fondamentale et translationnelle. In vivo, la plupart des tissus sont caractérisés par une matrice extracellulaire riche et haute densité cellulaire. La migration cellulaire par conséquent, dans des conditions physiologiques, se produit dans un environnement confiné complexe. Classiquement, probablement pour des raisons historiques et des limites techniques, la migration cellulaire a été étudiée dans les systèmes 2D plats qui ne se reproduisent pas beaucoup des propriétés de l&#39;environnement présentes dans les tissus, tels que l&#39;isolement. De plus, des facteurs comme l&#39;adhésion cellulaire, qui sont essentiels pour la motilité en 2D, ont été récemment montré à ne pas être necessacipalement requis pour la migration in vivo ou à l&#39;intérieur des gels, ce qui suggère que les mécanismes qui régissent la locomotion cellulaire en 2D et dans d&#39;autres environnements sont distincts 2. Plusieurs systèmes ont été développés pour imiter les propriétés complexes des tissus, le plus célèbre des gels de collagène les être, qui visent à récapituler les propriétés de la composition de la matrice extracellulaire 3. Ici, nous proposons des micro-canaux en tant que méthode complémentaire simple qui permet la migration des cellules d&#39;étude dans une dimension dans un environnement confiné. Dans ce système, les cellules migrent le long des microcanaux dans lesquels ils entrent spontanément. Cellules migratrices acquièrent alors la forme des canaux, l&#39;adoption d&#39;une géométrie tubulaire qui renforce probablement leur polarité. Le mouvement linéaire des cellules dans les canaux de la cellule permet un suivi automatique et l&#39;extraction des paramètres quantitatifs à partir d&#39;expériences. Du point de vue technique, ce système est facile et souple. Le Revêtementsg des parois de canal peut être manipulée, la taille et la forme des canaux peuvent être adaptées, et un grand nombre de cellules peut être analysée dans des expériences simples. Ce système peut également être mis à l&#39;échelle en place pour effectuer l&#39;analyse moyen de l&#39;écran de gamme de molécules impliquées dans la motilité cellulaire. Le protocole décrit ici a été normalisé en utilisant des cellules dendritiques (DC) comme un modèle cellulaire. Ces cellules sont la clé du système immunitaire car ils participent à l&#39;initiation et le maintien de réponses immunitaires spécifiques 4. In vitro, les PED ont été montré pour migrer spontanément dans des environnements confinés et sont donc un bon modèle pour étudier la motilité cellulaire dans des microcanaux 5,6 . Surtout, ce système peut être étendu pour analyser la migration de tout autre type de cellules mobiles comme les lymphocytes T, les neutrophiles, les cellules tumorales ou 9.7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:273px;">PolyDimethylSiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:131px;">GE Silicones</td>
			<td style="width:139px;">RTV615</td>
			<td style="width:405px;">Package of 90% silicone base and 10% curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Core sample cutter</td>
			<td>Ted Pella Int.</td>
			<td>Harris Uni-Core&#160;</td>
			<td>Diameter 2,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass-bottom dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Fluorodish FD 35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>Branson 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC 32 G</td>
			<td>For small samples (35 dishes). A bigger version is also available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)</td>
			<td>Susos</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of cell migration in microfabricated channels

La méthode décrite ici permet l&#39;étude de la migration des cellules sous confinement dans une dimension. Il est basé sur l&#39;utilisation de canaux micro-usinés, qui imposent un phénotype de cellules polarisées par des contraintes physiques. Une fois à l&#39;intérieur des canaux, les cellules n&#39;ont que deux possibilités: aller de l&#39;avant ou vers l&#39;arrière. Cette migration simplifié dans lequel la directivité est limitée facilite le suivi automatique des cellules et l&#39;extraction des paramètres quantitatifs pour décrire le mouvement des cellules. Ces paramètres comprennent la vitesse de la cellule, les changements de direction, et les pauses pendant le mouvement. Microcanaux sont également compatibles avec l&#39;utilisation de marqueurs fluorescents et sont donc appropriés pour étudier la localisation des organites intracellulaires et des structures au cours de la migration cellulaire à haute résolution. Enfin, la surface des canaux peut être fonctionnalisé avec des substrats différents, ce qui permet le contrôle des propriétés adhésives des canaux ou l&#39;étude des haptotaxis. En résumé, le système havant que décrit est destiné à analyser la migration des grands nombres de cellules dans des conditions dans lesquelles à la fois la géométrie et la nature biochimique de l&#39;environnement sont contrôlées, ce qui facilite la normalisation et la reproductibilité des expériences indépendantes.

Dans chaque expérience, la surface du PDMS est revêtue d&#39;une molécule adaptée à l&#39;intérêt de l&#39;étude. Figure 2 montre les canaux revêtus d&#39;une molécule fluorescente, PLL-g-PEG, avant et après le lavage (étape 2.4). Une telle expérience permet de contrôler l&#39;homogénéité du revêtement dans les canaux. Après chargement de la cellule, la microscopie vidéo peut être effectuée pour suivre la migration cellulaire. Figure 3A...

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Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Une méthode quantitative pour étudier la migration spontanée des cellules dans un micro-environnement confiné à une dimension est décrite. Ce procédé tire parti de canaux micro-usinés et peut être utilisée pour étudier la migration d&#39;un grand nombre de cellules dans des conditions différentes dans des expériences simples.

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