Name: study of cell migration in microfabricated channels
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00
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Os autores agradecem grandemente a plataforma PICT IBISA no Institut Curie (CNRS UMR144). Este trabalho foi financiado por concessões: o Conselho Europeu de Investigação para AM.LD (Strapacemi 243103), a Associação Nationale pour la Recherche (ANR-09-piri-0027-PCVI), a fundação InnaBiosanté (Micemico) para MP e PM. LD ea ERC Strapacemi jovem concessão investigador AM.LD.

Importante: Este protocolo assume que o molde contendo a forma para os microcanais desejados já foi feita. Outras informações sobre a preparação do molde já foi publicado em 10 de. Este protocolo também assume que DCs medula óssea cultura é conhecido. 1. Chip Fabrication <ol><li> Misture o óleo de PDMS e agente de cura em um 10:1 de peso em um copo de plástico. Misturar os dois compostos completamente. </li><li> Lançai a mistura ao longo dos microcan...

<ol>
	<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. 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Immunol. 30, 1-22 (2012).</li><li>Faure-Andr&#233;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74,+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain.">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li><li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration.">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li><li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions.">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li><li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels.">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li><li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li><li>Heuz&#233;, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Dum&#233;nil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+confinement:+a+micro-channel-based+assay.">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li><li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+method+for+modifying+poly(dimethylsiloxane)+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules.">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li><li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Teflon+microfluidic+chips.">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li><li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+World+Cell+Race.">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li></ol>

Descrevemos aqui um dispositivo composto por microcanais como um método para estudar as propriedades migratórias de grande número de células em experiências individuais. Este sistema experimental imita as restrições ambientais confinados encontradas em tecidos de células migratórias endógenos. No entanto, forçando a migração de uma única dimensão, que facilita o controle automático de células e a extracção da mensuráveis ​​(Figura 5). Também mostram que o nosso dispositivo é co...

A migração é uma função celular complexa que é importante para diversos processos fisiológicos em organismos multicelulares, incluindo o desenvolvimento, respostas imunitárias, e a regeneração de tecidos. Além disso, certas situações patológicas, tais como a invasão do tumor e metástases dependem de motilidade celular 1. Por estas razões, a migração celular tornou-se um importante campo de estudo no contexto de investigação fundamental e de translação. In vivo, a maioria dos tecidos são caracterizado por uma matriz extracelular rica e elevada densidade celular. A migração celular, por conseguinte, em condições fisiológicas, ocorre num ambiente confinado complexo. Classicamente, muito provavelmente devido a razões históricas e limites técnicos, a migração de células foi estudada em sistemas 2d plana que não se reproduzem muitas das propriedades ambientais encontradas em tecidos, tais como o confinamento. Além disso, os factores como a adesão de células, que são essenciais para a motilidade em 2D, foram recentemente mostrou não ser necessariamente necessária para a migração in vivo, ou dentro geles, o que sugere que os mecanismos que governam a locomoção das células em 2D e em outros ambientes são distintos 2. Vários sistemas têm sido desenvolvidos para imitar as propriedades do complexo de tecidos, o mais famoso géis de colagénio, sendo que visam recapitulando as propriedades da composição da matriz extracelular 3. Aqui propomos microcanais como método complementar simples que permite a migração de células de estudo em uma dimensão em um ambiente confinado. Neste sistema, as células migram ao longo de microcanais em que eles entram espontaneamente. Células migratórias então adquirir a forma dos canais, que adopta uma geometria tubular que provavelmente reforça a sua polaridade. O movimento linear das células dos canais permite o seguimento automático de células e a extracção de parâmetros quantitativos obtidos em experiências. Do ponto de vista técnico, este sistema é fácil e flexível. O coating das paredes do canal pode ser manipulado, o tamanho e a forma dos canais pode ser adaptado, e um grande número de células pode ser analisada em experiências individuais. Este sistema pode também ser ampliado para realizar a análise de tela intervalo médio de moléculas envolvidas na motilidade celular. O protocolo aqui descrito foi normalizado utilizando células dendríticas (DC) como um modelo celular. Estas células são a chave para o sistema imunitário que eles participam na iniciação e manutenção de respostas imunitárias específicas 4. In vitro, DCs foram mostrados para migrar espontaneamente em ambientes confinados, e são, portanto, um bom modelo para estudar a motilidade celular em microcanais 5,6 . Importante, este sistema pode ser ampliado para analisar a migração de qualquer outro tipo de células móveis, como os linfócitos T, neutrófilos, células de tumor ou 7-9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:273px;">PolyDimethylSiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:131px;">GE Silicones</td>
			<td style="width:139px;">RTV615</td>
			<td style="width:405px;">Package of 90% silicone base and 10% curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Core sample cutter</td>
			<td>Ted Pella Int.</td>
			<td>Harris Uni-Core&#160;</td>
			<td>Diameter 2,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass-bottom dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Fluorodish FD 35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>Branson 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC 32 G</td>
			<td>For small samples (35 dishes). A bigger version is also available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)</td>
			<td>Susos</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of cell migration in microfabricated channels

O método descrito aqui permite o estudo de migração celular sob confinamento numa dimensão. Ele baseia-se no uso de canais microfabricados, que impõem um fenótipo de células polarizadas por constrangimentos físicos. Uma vez que os canais internos, as células têm apenas duas possibilidades: seguir em frente ou para trás. Esta migração simplificada em que a direcionalidade é restrito facilita o rastreamento automático de células e extração de parâmetros quantitativos para descrever o movimento celular. Estes parâmetros incluem a velocidade da célula, mudanças de direcção e pausas durante o movimento. Microcanais também são compatíveis com a utilização de marcadores fluorescentes e são, portanto, adequados para estudar a localização de organelos e estruturas intracelulares durante a migração celular em alta resolução. Finalmente, a superfície dos canais podem ser funcionalizados com diferentes substratos, permitindo que o controlo das propriedades adesivas dos canais ou o estudo de haptotaxia. Em resumo, o sistema de here descrito destina-se a análise da migração de grandes números de células em condições em que tanto a geometria e a natureza bioquímica do ambiente são controlados, facilitando a normalização e reprodutibilidade de experiências independentes.

Em cada experimento, a superfície do PDMS revestido com uma molécula adaptado para o interesse do estudo. Figura 2 mostra os canais revestidos com uma molécula fluorescente, PLL-g-PEG, antes e após a lavagem (passo 2.4). Tal experiência permite o controlo da homogeneidade do revestimento dos canais. Após o carregamento da célula, microscopia de vídeo pode ser realizada a seguir a migração celular. Figura 3A mostra um exemplo de DC migrando em micro...

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Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.

Estudo da migração celular em Canais microfabricados

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

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