Name: visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00
Duration: 10 min
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Wir danken Geoff Daniels für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von R01 AI067946 zu JSO finanziert

1. Coat Deckgläser mit Antikörper <ol><li> Vorgewärmte (37 ° C) 30 ml RPMI-10% FCS-Medium und 1 ml BD Cytofix / Cytoperm. </li><li> Eine Lösung von 5 ug / ml gereinigtem Antikörper in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zur Aktivierung der NK92-Zelllinie, die Verwendung von anti-CD18-und Anti-NKp30 empfohlen. <ol><li> Mark etwa ein Cent großen Kreis für jede Bedingung auf einem Deckglas # 1.5 mit einem PAP-Stift. Unbefleckt, Dual gefärbt, und zwei Einzelbuntbedingungen: Für ein Zweifarben-Experiment sollte es vier Bedingungen. Verzichtet werden 200 ul der Antikörperlösung in jedem Bereich und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Waschen Deck durch leichtes Eintauchen jeweils in 50 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen bei Raumtemperatur. Waschen sollte unmittelbar vor der Zugabe von Zellen und darauf geachtet werden, um Antikörper Trocknen auf dem Deckglas zu vermeiden auftreten. </li></ol></li></ol> 2. Aktivieren NK-Zellen auf Deckrutscht, Fix und permeabilisieren <ol><li> Isolieren Sie 5 x 10 5 Zellen pro NK92 Zustand. Zentrifugen und Dekantierstand. Einmal mit 10 ml vorgewärmtem Medium aus Schritt 1.1 waschen. Zentrifugen und Dekantierstand. <ol><li> Die Zellen in vorgewärmten Medien aus Schritt 1.1 in einer Konzentration von 2,5 x 10 6 / ml. </li><li> Vorsichtig dekantieren 200 ul zum Zentrum der Region in Abschnitt 1.2.1 erstellt. Inkubieren bei 37 ° C für 20 min bei 5% CO 2. (Anmerkung: diese Zeit verlängert oder verringert werden, je nach der biologischen Funktion von Interesse für die NK-Zell-Granulat Polarisation, 20 min ausreichend.). </li></ol></li><li> Nach der Inkubation der Zellen vorsichtig waschen Deckgläser durch Eintauchen jeweils in 50 ml PBS Raumtemperatur in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> 1 ul Triton X-100 zu 1 ml vorgewärmten Fix / Perm-Lösung aus Schritt 1.1 und gründlich vortexen. Fix und permeabilisieren durch Zugabe von 200 ul Fix / Perm-Puffer (Schritt 2.3) zu den Zellen. Inkubation: 10 min der Dunkelheit bei Raumtemperatur. </li></ol> 3. Stain Cells <ol><li> Vorbereitung Färbepuffer: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1% BSA, 0,1% Saponin. <ol><li> Bereiten Lösung des primären Antikörpers in 200 ul Färbepuffer (siehe Schritt 3.1). (Anmerkung: Antikörper sollte vor Gebrauch titriert werden). Vermeiden Sie die Verwendung von primären Antikörper, der in den gleichen zum Beschichten der Deckglas (Schritt 1.2) Arten ausgelöst wird. Vermeiden Sie auch Strepatividin-Biotin-Bindungen für STED-Bildgebung. </li><li> Nach Abschnitt 2.3.1, vorsichtig waschen Deckgläser in 50 ml Puffer Färbung. Dab Kanten der PAP-Pen-Region mit Wattestäbchen, um überschüssige Puffer zu entfernen. Bewerben Antikörper-Lösung in Abschnitt 3.1.1 erstellt. Inkubieren 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. (Empfohlen: Inkubation Deckschieber in-Box mit einem feuchten Papiertuch, um Feuchtigkeit zu halten). </li></ol></li><li> Bereiten Lösung des sekundären Antikörpers in 200 ul FärbungPuffer. Empfohlene Fluorophore Alexa Fluor 488, Pacific Orange und V500. Im Allgemeinen ist eine 1:200-Verdünnung für STED-Bildgebung. <ol><li> Behutsam Deckgläser in 50 ml Puffer Färbung. Dab Kanten der PAP-Pen-Region mit Wattestäbchen, um überschüssige Puffer zu entfernen. Bewerben sekundären Antikörperlösung. Inkubieren 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Wiederholen Waschen und Färbung für zusätzliche Proteine ​​von Interesse. Erfassen, wenn F-Aktin mit Phalloidin, kann dies mit sekundären Antikörper enthalten, die allgemein bei einer 1:200 Verdünnung. </li></ol> 4. Berg Deckgläser auf Folien <ol><li> Bereiten Montagemedium. Hinweis: Verlängern oder Prolong Gold-vorzuziehen. Vectashield müssen vermieden werden, da es nicht mit STED kompatibel. 2,2-thiodioethanol muss vermieden werden, wenn Phalloidin verwendet werden. Mowiol akzeptabel ist. </li><li> Es werden ca. 10-20 ul Eindeckmedium auf einer Folie. Invert Deckglas (Zellseite nach unten) und montieren Deckglas vorsichtig, wobei darauf zuvermeiden Einführung von Luftblasen. Die Objektträger für 24 h (Deckglas nach oben) vor der Bildgebung. </li><li> Siegel Kanten des Deckglases mit Nagellack. </li></ol> 5. Versuchsaufbau <ol><li> Initiieren erforderlich Laser-und Software. Initiieren STED Erschöpfung Laser bei 100% Leistung. Richten STED-Laser, der im Falle von kommerziellen Systemen ist oft ein automatisiertes Verfahren. </li><li> Fokus der Probe, beginnend mit Einzelbuntkontrolle, am Mikroskop mit Okularen. </li></ol> 6. Optimierung der Einstellungen <ol><li> Scannen Sie den ersten Kanal und optimieren Laserleistung, Erregung Strahlposition und Detektor-Bereich. Wenn möglich, vermeiden einen Gewinn von&gt; 100. Nehmen Sie das Bild in der konfokalen, um die Einstellungen zu optimieren. Linien-und / oder Bildmittelung wird die Auflösung zu erhöhen. Überprüfen Sie für Pixelsättigung. Hinweis: Einige Sättigung ist in der konfokalen akzeptabel Anwendung der STED wird die Intensität der Emission zu reduzieren. Für STED wird eine optimale Pixelgröße unter 30 nm sein, wieimmer bessere Auflösung wird mit kleineren Pixelgrößen erreicht werden. Die Größe der Region von Interesse, das abgebildet wird die untere Grenze der Pixelgröße zu diktieren. Kleinere Pixelgrößen Photobleaching zu erhöhen. <ol><li> Bewerben STED Erschöpfung Strahl und Bildaufnahme, beginnend mit 50% Erschöpfung Laserleistung. Wenn eine Verbesserung der Auflösung zu sehen ist, können weitere Verarmung Laserleistung aufgebracht werden. Auf dieser Stufe kann es notwendig sein Anregungslaserleistung, Leitungs Durchschnitt und / oder Verstärkung einzustellen. </li><li> Bewerben Zeit-Gating in den Hintergrund (mindestens 0,3 ns) zu reduzieren. Passen Sie die Einstellungen, bis eine Verbesserung der Auflösung über konfokalen gesehen werden kann. Auflösung kann durch Schätzen Halbwertsbreite (FWHM) angenähert werden. Dies ist der Abstand, bei dem die Hälfte der maximalen Intensität eines Gaußschen Spitzen erstellt, indem eine Linie Profil über die Struktur von Interesse, und ist eine weit verbreitete Methode zur Schätzung Auflösung. </li><li> Sobald der erste Kanal zufriedenstellend ist, initiieren eine zweite Folge für sichQuential Scannen. In der Regel ist es am besten, die längere Wellenlänge Fluorophor ersten scannen. Wiederholen Sie Schritt 6.1 auf zweiten Kanal. </li></ol></li><li> Mangel an spektrale Überlappung Bestätigen System einzelne Bunt Kontrollen mit beiden Scan-Sequenzen. Mild spektrale Überlappung kann mit spektralen un-Mixing-Funktionen in der Software korrigiert werden, jedoch sollte nach Möglichkeit vermieden werden. </li></ol> 7. Image Acquisition <ol><li> Erwerben Bilder. Für die quantitative Bildgebung, ist es empfehlenswert, mindestens 20 Bilder / Zustand zu erhalten. Die genaue Zahl sollte jedoch nach der experimentellen Frage im Konzert mit einem statistischen Ansatz wie Probengrößenberechnung definiert werden. Sparen Experiment. </li></ol> 8. Entfaltung <ol><li> Öffnen Sie die Datei mit Entfaltungs Software oder Stapelverarbeitung. Überprüfen Sie die Parameter für jeden Kanal mit Hilfe von Software. Bestätigen Anregungs-und Emissionsspektren der einzelnen Kanäle, STED Erschöpfung Emission und Bildrichtungtion (nach oben oder unten, wenn das Bild 3-dimensional) im besonderen. </li><li> Entfalten, mit der Entfaltung Assistenten. Standardeinstellungen sind in der Regel ausreichend, jedoch Rausch-Verhältnis (sntr) Signal vom Fluorophor Fluorophor variieren und müssen für jeden Kanal und jedes Experiment individuell bestimmt werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren. Teilweise Veröffentlichung Kosten dieser Artikel wurde von Leica Microsystems, Inc. bestritten

Die Verbesserung der Auflösung über konfokale wird etwas abhängig von Faktoren, die nicht kontrolliert werden können. Diese Faktoren schließen kleinere Aberrationen in Deckglasdicke und Ungereimtheiten bei der Montage Medien. Es ist wichtig, die Temperatur und Feuchtigkeit in dem Abbildungsraum so konstant wie möglich zu halten, und die STED-Strahl sollte etwa alle 60 min ausgerichtet werden. Wie im Verfahren erwähnt, muss Einsatz von Vectashield Montagemedium vermieden werden, da dies nicht mit der STED-kompatibel. Zusätzlich zu dem, sollte man immer mit # 1.5 Deckgläser, und wenn vorhanden, verwenden solche, die zu einer bestimmten Dicke verifiziert worden sind. Eine Modifikation der hier beschriebenen Ansatz ist es, Bild zusätzliche Kanäle in der konfokalen mit Fluorophore, die bei einer längeren Wellenlänge als der STED-Strahl emittieren. Auf diese Weise kann ein Bild bis zu vier Kanälen (zwei in der konfokalen, zwei in STED). Wenn die diesen Ansatz jedoch die Kanäle mit Fluorophore emitting über der STED-Laser Erschöpfung müssen zuerst abgebildet werden, als Anwendung der STED-Strahl Photonen in diesen Kanälen führen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Anwendung von Zeit-Gating, die auch in der konfokalen Auflösung zu verbessern, indem Emission von Photonen mit kurzer Lebensdauer 34. Insbesondere wird der Einsatz von Zeit-Gating, den Zeitpunkt der Emissionsdetektoren mit gepulster Anregung STED entsprechen, Hintergrundfluoreszenz von Reflexion Deckglas zu verringern, wenn die Abbildung in dessen Nähe. Selbst in einem Experiment nicht für STED geeignet, wenn mit einem gepulsten Anregungsquelle, Zeit-Gating kann ein nützliches Instrument zur Verbesserung der Auflösung in der konfokalen sein. Es gibt verschiedene Modifikationen, die genutzt werden können, um die Auflösung in der STED verbessern. Einer ist, die Größe der Lochblende von der Standard 1 Airy Einheit zu verringern, obwohl dies auch die Menge an Licht, das die Probe zu verringern. Dies kann durch Erhöhung las kompensiert werdener Macht oder Gewinn. Eine andere ist, Rauh erhöhen, was die Menge an Informationen für jedes Photon gesammelt erhöhen wird, die Verbesserung der Auflösung. Wiederum kann dies jedoch auf Kosten der Photobleichung der Probe sein, damit ein Gleichgewicht muss zwischen Auflösung und Bleich gefunden werden. Ebenso wird die Verwendung von fluoreszierenden Proteine ​​wie GFP sorgfältige Optimierung erfordern, um die Bleich vermeiden. Dies kann durch eine Verringerung der STED-Laserleistung bei Bedarf durchgeführt werden. Längere Zeitpunkte werden auch für größere Photonen Erholung zu ermöglichen und zu reduzieren Bleichen. Korrektur für Photobleaching sollte bei der Analyse von Live-STED berücksichtigt werden. Natürlich ist Bildgebung in 3 Dimensionen in STED auch möglich, und wird auch eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Abbildung geben. Dies gilt insbesondere, wenn es in Kombination mit Dekonvolution durchgeführt wird, wobei darauf zu achten, um die Drift, die während der Bild mehreren Ebenen in der z-Achse erfolgt korrigieren. Bei Verwendung von Huygens Softwarezu entfalten, ist diese Korrektur mit der &quot;Bild stabilisieren&quot;-Funktion erhalten. Mit diesem Ansatz wird eine Auflösung in der z-Achse verbessert werden. Dies ist eine große Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Bildgebung, die schlechte axiale Auflösung hat, und sogar über sich selbst nur STED, die auch eine relativ schlechte Auflösung der z-Achse. Während Erwerb mehrere Stapel in STED, muss darauf geachtet werden, um ein Ausbleichen der Probe zu vermeiden, und wenn nötig kann man Linie Mittelung oder Laserleistungsstärke, um so zu tun zu reduzieren. Wiederum sei darauf hingewiesen, dass, wenn die Abbildung anderer Fluorophore, die nicht geeignet sind für STED Anwendung des Verarmungsstrahls in der ersten sequentiellen Abtastung würde Emission aus diesen Kanälen zu verhindern. Daher ist eine gemischte STED / konfokalen Ansatz (bei Verwendung der konfokalen Scan in Kanäle, die bei einer Wellenlänge größer als 592 nm emittieren) wird leider nicht geeignet für 3D sein. Zusammenfassend haben wir STED als Ansatz aufgrund seiner relativen Einfachheit der App ausgewähltlichung und Verbesserung der Auflösung gegenüber Standard-konfokale Bildgebung. Für die Abbildung der Immunsynapse ist es eine effektive und wertvolle Technik, die uns zu Details in F-Actin-Architektur nicht möglich, bei einer Auflösung von mehr als 200 nm sehen können bewährt. Während viele dieser Details scheinen subtile, können sie eine tiefgreifende Wirkung auf die NK-Zell-Funktion. So werden wir die Anwendung der neuesten Imaging-Technologie, um nanoskopische Gewinnung von Informationen, die entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gesundheit des Menschen ist.

Die immunologische Synapse ist ein komplexes Milieu von Signalproteinen und Zytoskelett-Elemente. Die zytolytische Synapse wurde ursprünglich als mit einer &quot;Bullaugen&quot;-Struktur mit einem Ring aus Aktin und Adhäsionsmoleküle um einen zentralen sekretorischen Domain 1-4 beschrieben. Allerdings wissen wir jetzt, dass es aus der mikroskopischen Domänen aktives Melde, die eine kontinuierliche dynamische Reorganisation des Zytoskeletts für die Funktion benötigen 5-11. Viele der Informationen, die wir jetzt haben, über die Synapse ist von Mikroskopie abgeleitet und Immunologen haben Early Adopters von innovativen Imaging-Technologie. Eine dieser neuen Technologie ist Super-Resolution-Mikroskopie. Konventionelle Lichtmikroskopie ist räumlich durch die Beugungsgrenze des Lichts, das die untere Grenze der Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie für alle, einschließlich der konfokalen, bei ca. 200 nm setzt begrenzt. In den letzten Jahren wurden verschiedene Techniken wurden developed, die Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze zu ermöglichen. Dazu gehören Stimulation Emission Depletion-Mikroskopie (STED), Structured Illumination Microscopy (SIM), stochastisch gelöst Mikroskopie (STORM) und photoaktivierbares Lichtmikroskopie (PALM). Diese Techniken wurden an anderer Stelle ausführlich 12-15 gelesen, dennoch werden im Folgenden erläutert. Subdiffraction begrenzte Auflösung wird in einzigartiger Weise in jedem System erzeugt. Die Auswahl der Super-Auflösungstechnik sollte daher durch das Experiment und Versuchssystem von Interesse bestimmt werden. STED Super Resolution wird mit einem hochintensiven Ringkernstrahl Erschöpfung, die selektiv &quot;Schweigen&quot; Fluoreszenz um jedes Fluorophor von Interesse nach der Anregung, was subdiffraction begrenzten Fluoreszenzmikroskopie 16-18 erreicht. Ein Vorteil ist, dass STED-Bildaufnahme ist schnell und erfordert relativ wenig Nachbearbeitung. Während die Farbstoffauswahl wird durch die Spezifikation vorgegebenLaufstellung der Sperrbalken, der in dem im Handel erhältlichen Systems bei 592 nm liegt, sind mehrere im Handel erhältliche Farbstoffe zur Verfügung, die Kombinationen von zwei Fluorophoren zu ermöglichen. Zusätzlich können häufig verwendete fluoreszierende Reporter wie GFP abgebildet werden, wodurch der Lebendzellexperimente möglich 19,20. Wir haben früher verwendet STED zur Identifizierung und Quantifizierung Regionen von F-Aktin Hypodensität die von NK-Zellen für die Degranulation 21,22 verwendet werden. Wir schlagen vor, dass STED ist eine gute Wahl für die Abbildung der Immunsynapse aufgrund seiner relativ flexible Verfügbarkeit der Fluorophore und überlegene Verbesserung der Auflösung in der xy-Achse. Zusätzlich zu den im Handel erhältlichen STED System für diese Experimente verwendet, ermöglicht eine schnelle Erfassung von Bildern mit minimalen Schäden an Proben die Verwendung einer hohen Geschwindigkeit (12.000 Hz) Tomographen. Eingeschränkte Flexibilität in Farbstoffauswahl gilt als ein Nachteil der STED-12,jedoch zweifarbigen STED ist relativ einfach mit einigen handelsüblichen Fluorophore. Die Integration der STED mit einem konfokalen Laserrastermikroskop bietet außerdem zusätzliche konfokale Bildgebung in Kombination mit STED, also, während STED ist auf zwei Kanäle, zusätzliche Strukturen in der konfokalen mit einer Auflösung von etwa 200 nm (E. Mace, unveröffentlichte Beobachtungen abgebildet werden ). Während wir beschreiben die Verwendung von STED zum Abbilden Immunzellen ist diese Technologie auf eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich neuronaler Zellen, und zur Visualisierung einer Vielzahl von Zellstrukturen 23-26 angelegt. SIM verwendet einen anderen Ansatz, um subdiffraction begrenzte Bilder zu erzeugen. Durch die Visualisierung bekannten periodischen Erregungsmuster können dann Informationen über den unbekannten Struktur, die folgende mathematische Transformation 27 studierte erhalten werden. Dies ergibt eine Erhöhung der Auflösung auf ~ 100 nm seitlich 28,29. Der Vorteil ist, dass es SIM-is mit allen Standard-konfokalen Farbstoffe und Sonden-kompatibel, aber der Nachteil ist, dass es viel langsamer, um Bilder zu erwerben und diese erfordern eine lange Post-Processing-12. Dies schränkt auch die Verwendung für Live Cell Imaging. Schließlich kann Super-Resolution-Bilder durch stochastische Foto-Schalt Fluorophore erzeugt werden. Dieser Ansatz wird in photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) und stochastischen optischen Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) ausgebeutet. Durch das Scannen von mehreren Kamerarahmen und Lokalisierung von aktivierten Moleküle zufällig &quot;on&quot; und &quot;off&quot;, die im Laufe der Zeit eingeschaltet sind, werden die Bilder mit 20-30 nm Auflösung von angesammelten 30-32 Frames generiert. Die Trade-off für diese Auflösung ist die erforderliche Zeit, um Bilder zu erwerben. Hier zeigen wir im Detail, das Protokoll für die Vorbereitung und Dual Imaging Farbproben in STED. In diesem System ist die Anregung mit einer gepulsten, abstimmbaren, Weißlichtlaser. Aufgrund der Naturder gepulsten Anregungsstrahl wird die Zeit-Gating Nachweis möglich gemacht und ein weiterer Anstieg Auflösung. Darüber hinaus ist das System mit Gadolinium Hybrid (HYD)-Detektoren, die empfindlicher als herkömmliche Photovervielfacherröhren sind ausgestattet, so dass für niedrigere Laserleistungsanforderungen. Die Erschöpfung Strahl zur STED kontinuierlich angelegt und auf 592 nm, die die Wahl von Farbstoffen für die zwei Farb STED verfügbar diktieren abgestimmt. Häufig verwendete Farbstoff-Kombinationen sind in der Regel eine erregbare von 488 nm (wie Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights grün oder Chromeo 488) und eine erregbare von 458 nm (wie Pacific Horizon orange oder V500). Während also Detektion der beiden Farbstoffe wird in einem ähnlichen Bereich (und beide sind durch die Verarmungslaser zugänglich), Erregung mit verschiedenen Wellenlängen liegen. Mit einem abstimmbaren Weißlichtlaser und abstimmbare Detektoren, die Maximierung Signal, während die Beseitigung spektrale Überlappung ist ziemlich leicht gemacht. Als solche haben wir gute Erfolge mit Kombination hatteIonen von kommerziell erhältlichen Farbstoffen, wie Pacific Orange und Alexa Fluor 488 (verwendet). Unser Protokoll ist auf maßgeschneiderte und beschreibt die Bewertung der menschlichen NK-Zellen wie den historischen Schwerpunkt unserer Labor darstellt. Wir sind speziell die Nutzung der NK92-Zelllinie in diesem Beispiel, wie das ist, den wir regelmäßig in unserer experimentellen Arbeit 21,33 aufgebracht.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:602px;" width="602">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:230px;">#1.5 cover slips</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td style="width:222px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:150px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:222px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S450941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Falcon centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Fetal calf serum (FCS) (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:150px;">S11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Goat anti-rabbit Pacific Orange</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P31584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Laboratory tissue wipers</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Nail polish</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">100491-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">NK-92 cells</td>
			<td style="width:222px;">ATCC</td>
			<td style="width:150px;">CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phalloidin Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Prolong anti-fade reagent</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-CD18</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">301202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-NKp30</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">325202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-perforin</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">308102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">RPMI 1640 medium (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Saponin from Quillaja bark</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Super PAP pen</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">008899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:222px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:150px;">22142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Material Name</td>
			<td style="height:27px;">Company</td>
			<td style="height:27px;">Catalogue Number</td>
			<td style="height:27px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Huygens deconvolution software</td>
			<td style="height:27px;">SVI</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td style="height:27px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

Natürliche Killerzellen bilden streng reguliert, fein abgestimmte immunologischen Synapsen (IS), um viral infizierte oder tumorerzeugende Zellen zu lysieren. Dynamische Aktinreorganisation ist entscheidend für die Funktion der NK-Zellen und die Bildung des IS. Imaging von F-Aktin an der Synapse ist traditionell genutzt konfokale Mikroskopie, aber die Beugungsgrenze des Lichts beschränkt Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskopie, konfokale darunter, etwa 200 nm auf. Jüngste Fortschritte in der Imaging-Technologie haben die Entwicklung der subdiffraction begrenzten Super-Resolution Imaging aktiviert. Um F-Actin-Architektur an der IS visualisieren rekapitulieren wir die NK-Zell-zytotoxischen Synapse durch Ankleben NK-Zellen zu aktivieren Rezeptor auf Glas. Wir haben dann Bild Proteine ​​von Interesse mit Zwei-Farben-stimulated emission depletion-Mikroskopie (STED). Dies führt zu &lt;80 nm Auflösung an der Synapse. Hier beschreiben wir die Schritte der Probenvorbereitung und der Akquisition von Bildern mit Dual-col beschreibenSTED Nanoskopie oder F-Aktin an der NK visualisieren IST. Wir veranschaulichen auch die Optimierung der Probennahme mit Leica SP8-Software und gated STED-Zeit. Schließlich nutzen wir Huygens-Software für die Nachbearbeitung Entfaltung der Bilder.

Klar ist, dass ein Hauptziel der Super-Resolution Imaging eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Allerdings gibt es einige Fallstricke, die zu suboptimalen Auflösung führen kann. Diese verlangen, dass jedes Experiment individuell optimiert werden. In unserer repräsentativen Experiment, wir sind die Abbildung der F-Actin-Netzwerk in einem NK-Zellen durch Antikörper gebunden an Glas aktiviert. Häufige Ursachen von (und für Korrekturen) einen Mangel der verbesserten Auflösung der STED über konfokalen sind wie folgt: <ol><li> Unter-Abtastung (Abbildung 1a). Dies kann zu Körnigkeit und Verlust von Pixelinformationen führen, wie durch schlechte Auflösung von F-Aktin-Filamenten gezeigt. Erhöhte Linie oder Bildmittelung kann oft korrigieren. </li><li> Bleich-und / oder Überabtastung (Abbildung 1b). Dies kann durch langwierige Pixelverweilzeit infolge übermäßigen Mittellinie hervorgerufen werden. Alternativ kann es aufgrund der Überabtastung des Bildes vor der Übernahme, einschließlich Übernutzung seindie Verarmungs Laser. Dies führt häufig in trübe oder unscharfe Bilder. Dies kann durch das Scannen des Interessengebiet nur minimal vor dem Erwerb oder, wenn möglich, die Erhöhung Laserscangeschwindigkeit korrigiert werden. Wenn das Problem weiterhin besteht, können die Erschöpfung Laserleistung reduziert werden. </li></ol> Mit dem Erreichen der richtigen Balance von Pixelverweilzeit, Erregung Laserleistung und Erschöpfung Laserleistung, ein Bild mit verbesserter Auflösung und ausreichende Informationen generiert werden können (Abbildung 1c). Auflösung kann durch die Verwendung der Entfaltungs (1d) verbessert werden. Beim Erwerb optimiert ist, wird Entfaltung Auflösung qualitativ und quantitativ zu verbessern und sub-100 nm Auflösung sollte routinemäßig erreichbar sein. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> Abbildung 1. Optimierung der Erwerb und die Fallstricke des STED-Bildgebung. NK92-Zellen wurden auf Anti-CD18 und NKp30-beschichtetes Glas für 20 min aktiviert, dann fixiert, permeabilisiert und für die F-Aktin mit Phalloidin Alexa Fluor 488 gefärbt. A) Ein Beispiel für Verlust von Bildinformationen durch Unterabtastung. b) Ein Beispiel für Verlust der Auflösung durch Bleichen / Oversampling c) Bedingungen optimiert d) optimierten Bedingungen führen zu einer größeren Verbesserung der Auflösung mit Entfaltung. Maßstabsbalken = 5 um.

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Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Hier veranschaulichen wir das Protokoll für die Bildgebung durch Zwei-Farben-STED Nanoskopie die zytotoxische Immunsynapse von NK-Zellen auf Glas rekapituliert. Mit dieser Methode erhalten wir sub-100 nm Auflösung von Synapsen-Proteine ​​und des Zytoskeletts.

Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

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