Name: collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Science Foundation NSF-IOS bevilja # 1144391 till SHB.

Ett. Framställning av växter <ol><li> Arabidopsis frön kan gro direkt på marken eller på MS plattor. Odla växter för fyra till sex veckor i tillväxt kammare med en 12-hr fotoperiod (22 ° C dag, 15 ° C natt 14). Vattenväxter en till två gånger i veckan. Använd bottenbrickan för vattning, inte vattenväxter från toppen, låta facken torka innan åter vattning. Kontrollera växter är väl hydrerad vid tidpunkten för skörd. </li></ol> 2. Beredning av lösningar och rätter <ol><li> K 2-EDTA-lösning: Gör en 100 mM K 2-EDTA-lösning lösning lager, som kan förvaras i kylskåp. På dagen för insamling, späds lösningen 04:59 (en del EDTA-lösning, fyra delar vatten) för erhållande av en 20 mM K 2-EDTA-lösning. </li><li> Fyll ett glas eller en petriskål (diameter 7-15 cm) halvvägs med 20 mM K 2-EDTA-lösning. Om provtagning från olika behandlingar (till exriklig kontroll och salt-stressutsatta plantor eller olika genotyper) förbereds separata rätter för varje behandling. </li><li> Fyll önskat antal 1,7 tuber ml reaktionskärl med 1,4 ml 20 mM K 2-EDTA-lösning. Fyll lika många provrör med 1,4 ml autoklaveras avjoniserat eller Milliporevatten. </li><li> Sätt pappershanddukar på bänken för att ställa växter på, få en ny rakblad och sätta på handskarna. </li></ol> Tre. Insamling av floem Exsudat (Visat i flödesschemat i figur 1) <ol><li> Harvest bladrosetter fyra till sex veckor gamla anläggningar genom att skära dem med rakblad på basen av bladskaft nära centrum av rosetten. </li><li> Placera omedelbart bladen i rätter innehållande 20 mM K 2-EDTA. Se till den avskurna änden av bladskaftets är nedsänkt i lösningen (Figur 2). </li><li> När 15 blad har samlats (ca. 03:57 anläggningar), försiktigt stapla blad ovanpå varandra så thatt den skurna bladskaft är i linje med varandra. Fräs om basen av bladskaft (ca 1 mm) och omedelbart överföra bladen till ett av reaktionsrören med 20 mM K 2-EDTA-lösning. Bladen passar lättast om de är något rullas upp. Undvik att klämma bladen i eftersom detta kan orsaka skador på celler och därmed leder till insamling av löv cellens innehåll. </li><li> Om mer material behövs, försiktigt täcka prover med en våt pappershandduk. Använd en ny uppsättning av rätter om för insamling av prover från olika behandlingar eller genotyper. </li><li> När alla proverna är placerade i reaktionsrör, samla utsöndringarna antingen i mörker eller i ljuset. </li><li> För provtagning i mörker, rad golvet i ett stort grunt skålen med våta pappershanddukar. Placera stället med blad fyllda provrör i skålen och något omslag med våta pappershanddukar eller sätta i en svart plast tillbaka med slitsar för luftning. Placera hela installationen i ett skåp eller ett mörkt rum. </li><li> För insamling i ljuset, linje botten av en klar plexiglas behållare med våta pappershanddukar. Placera stället med blad fyllda reaktionsrör i behållaren och stäng det. </li><li> Efter 1 timme, lämnar bort försiktigt från behållaren och rören reaktionsbetingelserna och tvätta noga med destillerat, avjoniserat eller Millipore vatten för att avlägsna alla EDTA. Detta steg tjänar tre ändamål: (1) det tar bort EDTA till minimeras skada på cellerna, (2) den eliminerar interferensen av EDTA med SDS-PAGE och kromatografi, och (3) tar bort alla föreningar som har ackumulerats från skär / skadad celler. Överför omedelbart in den förberedda reaktionsrören innehåller autoklaveras vatten och återgå till de fuktade insamlingscontainrar för insamling av utsöndringar. Vid denna punkt, tillsätt RNas-inhibitor om exsudatet behöver användas för RNA-extraktion. Valfritt: Proteinasinhibitor kan läggas till om proteinanalys önskas. </li><li> Efter den planerade samlingen tid, dra ut och discard bladen och frysa floem utsöndringar i flytande N 2 för vidare användning. Om förlängd förvaring behövs, frystorka proverna och förvara vid -80 ° C. </li><li> I fallet med Arabidopsis kan metaboliter redan detekteras efter samling av utsöndringar för 1 timme. Dock är kollektionen för 5-8 tim lämpligt om analys av mindre rikliga komponenter planeras. För större anläggningar som Perilla är längre hämtningstider (8 tim) rekommenderas. Exudat uppsamlas från 15 blad är typiskt tillräckligt för ett körfält på en SDS-PAGE-gel (proteiner), för mRNA-utvinning, GC-MS (sockerarter och metaboliter). För lipidanalys sammanslagning av 2-3 prover (exsudat 30-45 blad) rekommenderas och leder till tydligare resultat. </li></ol> 4. Efterföljande analys (Video Vi visar bara 4,4) <ol><li> För proteinanalys, återsuspendera provet i 15 | il vatten och 30 ^ il Lämmli buffert, upphetta till 95 ° C under 5 min, snabbt spinn ner någon precipitates och ladda hela provet på en SDS-PAGE-gel (45 ^ lastning fickor). Prover bör färgas med kolloidalt Coomassie eller andra känsliga fläckar eftersom protein överflöd är mycket låg. </li><li> För socker och små metabolitanalys, tillsätt Derivatiserande medel till det torkade provet som beskrivs i litteraturen 14. </li><li> mRNA kan analyseras med hjälp av RT-PCR, microarray eller RNA-Seq-analys. </li><li> För lipidanalys omedelbart pool 02:58 prover och partitionera mot kloroform: metanol (1:1) i dragskåp enligt följande: tillsätt en lika stor mängd kloroform: metanol till varje prov, virvel i några sekunder och centrifugera i 4 min vid 400 x g. Samla botten (organiska) fasen i ett glasrör med teflonhatt och upprepa partitionen med den övre fasen ytterligare tre gånger. Torka de kombinerade organiska faserna under en ström av N2 och underkasta sig vidare analys (Tunnskiktskromatografi: TLC 14, 37; Vätskekromatografi-Masspektrometri: LC-MS 14). </li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Den EDTA-underlättade samling phloem utsöndringar är mycket enkel, kräver minimal utrustning, och är tillämplig på de flesta växter. Totalt sträcker sig denna metod förmågan att analysera floem utsöndringar från att fler arter. Även exsudatet späds, är det enkelt att samla många olika prover eller från många växter att skala upp till en stor mängd material. Detta möjliggör sedan för detektion av nya föreningar som är i mycket begränsad omfattning och annars skulle förbises. Denna metod kan användas för flera växtarter och fungerar såsom beskrivits för de som förtecknas i detta manuskript. Om nya arter utforskas, de två aspekter som kan behöva ändras är antalet använda löv och tiden för utsöndring. I de flesta fall bör en 07:55 timmars exudation vara lämpliga. För att bekräfta användningen av denna metod för en ny växtart måste exsudat som skall samlas in och en eller flera av den följande analysen som beskrivs i protokoll del 4 nEEDS som skall utföras. Beroende på intensiteten av den observerade signalen kan uppsamlingsvolymen måste skalas upp. I allmänhet kommer lipid och proteinanalys kräver mer material än socker och metabolitanalys eftersom den förstnämnda är mindre rikligt förekommande i floem utsöndringar. Eftersom EDTA-underlättat exsudat kollektion innebär snittytor samt en potentiellt skadlig effekt av EDTA, flera punkter måste beaktas: (1) efter en timmes inkubering med EDTA, bladskaft måste tvättas noggrant. Detta tar bort alla föreningar, erhållen från skadade celler liksom EDTA själv, vilket kan skada celler eller störa utvinning. (2) Positiva och negativa kontroller måste ingå för att säkerställa erhållna data härrör från phloem sav och inte från skadade celler (se kritiska stegen nedan). (3) phloem SAP gör innehåller flera enzymer, vilket skulle kunna vara aktiva under exsudat samling. Följaktligen, i vissa fall kan det vara användbart att samla for olika lång tid. (4) Eftersom metoden involverade exsudation i vatten, är en absolut kvantifiering av föreningarna inte möjlig. Kritiska steg: Nyckeln till framgångsrik användning av denna metod är att använda försiktighet vid hantering av provet för att inte skada några celler samt användning av lämpliga kontroller (se ref 14.). En lämplig kontroll är den samling av floem utsöndringar utan tidigare behandling med EDTA. I detta fall floem kommer att försegla sig själv och ingen exsudat kan uppsamlas. Eventuella kontaminerande föreningar som kommer från de sårade cellerna kommer att upptäckas här. En andra kontroll skulle vara analys av socker i exsudat. I Arabidopsis, bör sackaros vara den dominerande metaboliten inom floem sav, med fruktos till sackaros förhållande av 1:04 till 1:08 (ref 8, 14). För RNA-extraktion användning av en RNas inhibitor är nödvändigt. Dessutom, en positiv kontroll av tidigare som beskrivered floem-lokaliserad mRNA (UBC9: ubikvitinkonjugerande enzym 9, At4g27960, 8, 14) och en negativ kontroll av exempelvis en kloroplast-mRNA (Rubisco LSU) är att rekommendera. Eftersom exsudat innehåller aktiva enzymer, är ett tidsförlopp uppmanas att se förändringar i floem profilen är inte bara på grund av variationer i samlingen tiden. I vissa fall kan det vara fördelaktigt att använda proteinasinhibitorer. Men utredarna måste ha i åtanke att den insamlade exsudat ska vara koncentrerad och att eventuella tillsatta föreningar kommer att till stor del koncentrerad. Ett andra viktigt steg i protokollet är recutting av bladskaftets enligt EDTA. Detta steg tjänar ett dubbelt syfte: det första, det tar bort alla förseglade silplattor samtidigt förhindra bildandet av nya pluggar vilket möjliggör fritt flöde av floem sav. Det andra, det tar bort den kavitationsbubbla i genererade xylem medan skärning och därmed möjliggör xylem transport. Storleken på det andra snittet beros på de använda växterna. I anläggningar med större bladskaft det borde vara flera millimeter (upp till 1 cm) ovanför den första snittet, i växter som Arabidopsis, 1-2 mm är tillräckliga. Användningen av denna metod kan leda till upptäckten av nya föreningar i floem utsöndringar som kunde ha signalering, utvecklingsmässiga eller biomedicinsk konsekvenser. Det har föranlett en mer ingående titt på långväga lipid signalering, som var lite studerade fält inom vetenskap växt på grund av bristande tillgång till floemet.

Växter kan inte flytta fly ogynnsamma förhållanden. Därför var de tvungna att utveckla mekanismer för att upptäcka miljöpåkänningar, framkalla och sända en relaterad signal i hela anläggningen, och justera utvecklingen därefter. Två transportsystem finns för distribution av vatten, näringsämnen och andra (signalering) föreningar. Den första är den xylem, som normalt transporterar vatten och mineraler tas upp av rötterna hela anläggningen. Den andra är floemet. Vyn floemet har ändrats från en enkel assimilera transportsystem till en ledning för RNA, protein, virus, lipider och andra små molekyler. Den spelar en viktig roll i assimilera och näringstransporten, respons mot biotisk och abiotisk stress, liksom i växtens tillväxt och utveckling. Det som nu kallas &quot;digitala motorvägen&quot; av anläggningen 18. Den phloem består av flera celltyper: phloem levervävnad, samt specialiserade följeslagare ceLLS och sikt element. Sikten elementet är platsen för långväga rörelse. För att möjliggöra obehindrad längsgående flöde är såll element saknas flesta organeller samt kärnor och tros innehålla i bästa fall en begränsad translationell maskiner 21, 33. Man tror att följeslagare celler syntetisera proteiner och andra föreningar, som reser i floem strömmen. Dessa föreningar transporteras sedan in i sikten elementet via plasmodesmata och kan fungera som långväga signaler 4,16. Flera grupper av föreningar kan återfinnas i floem utsöndringar: <ul><li> Socker är ofta produkter av fotosyntes och transporteras som &quot;energi-bär&quot; molekyler till andra delar av anläggningen för lagring eller som byggstenar. De kan emellertid också fungera som frostskyddsmedel eller som signal-föreningar. </li><li> Proteiner kan också hittas i floem utsöndringar. De innefattar metaboliska enzymer, men också har signalfunktion. Ett exemle av ett protein som fungerar som en utvecklings-signal är Blommande locus T-protein, som signalerar induktion av blomning samt säsongsbetonad blad abscission i växter. sex </li><li> Nukleinsyror är närvarande i floem utsöndringar i form av mRNA, små och mycket små RNA, och virala RNA. De verkar vara i stort sett inblandad i signalering 27, 28, 39. Samtidigt, har rRNA och tRNA-sekvenser för nästan alla aminosyror observerats i floem sav gurkväxter 42. De verkar vara selektivt överförs till sikten rörsystemet. De tRNA visar ändringar som krävs för förmågan att överföra aminosyror till den translationella apparaturen. Men snarare än att delta i översättning, verkar de att hämma denna process. Alternativt kan de tjäna som en källa för cytokinin eller signalera metaboliska status av anläggningen 42. </li><li> Fettsyror, oxylipins och andra lipider har också påträffats i floem utsöndringar 3, 13, 14, 23. Jasmonic-syra, ett oxylipin rör sig genom floem som en del av svaret på patogeninfektion 22, 29, 31, 32. Medan den roll de flesta floem lipider är fortfarande oklart, en del av dem sannolikt har signalfunktion 4. </li></ul> Utmaningen i att arbeta med växter phloem ligger i dess förmåga att täta sig vid sårskada. Det finns fyra stora metoder som används för att samla in floem utsöndringar, men de fungerar bara i utvalda arter: 1) I gurkväxter är det möjligt att erhålla rimliga mängder phloem exsudat genom nedskärningar av bladskaft. När den första droppe med kontaminering av skadade celler har tagits bort är det möjligt att erhålla rimligt stora mängder ren floem sap 1, 15. Men med ökande samling tid, denna exsudat tjocknar, vilket gör det allt olämpligt för vätskekromatografi tillvägagångssätt (opublicerad). Nya publikationer antyder, att beroende på art, är detta phloem SAP härstammar från either fascicular (FP) eller extrafascicular floem (EP) och att, medan det innehåller &quot;mobil&quot; floem sav från sikten elementen (FP), är det också benägna att kontaminering från andra celltyper, inklusive xylem 40, 41 . 2) Det andra alternativet är att skaffa phloem sap genom grunda nedskärningar eller punktering i stammen eller bladskaft. Denna metod har använts framgångsrikt i lupin 17, 25, 36 gurkväxter, och Brassica napus 12. Här förorening från skadade celler är minimal och utsöndringar mycket ren. Men växter behöver för att vara friska och väl vattnade eftersom det är mycket svårt att selektivt punktera bara sikten element. Om xylem fartyg trasiga all sårsekret dras in i xylem strömmen. Detta gör metoden olämplig för anläggningar med mycket ömtåliga eller starkt förvedade bladskaft eller stjälkar. 3) Bladlöss stylectomy tillåter bladlöss att sätta sin stilett i sikten elementen in avlägsna aphid med en laser. Floem sav exuded genom den återstående mandrängen 2, 9, 10, 35, 38. I teorin kan vilken som helst växt som kan infekteras av bladlöss användas för detta tillvägagångssätt. Men de flesta växthus eller tillväxt chefer kammare stöder inte användning av en patogen. Dessutom bladlöss introducera flera proteiner i floem med deras saliv 19, 33. Detta leder till en begränsad transkriptionell omprogrammering 30 och har potential att förändra floemet sammansättning 26. 4) Den metod som beskrivs här är EDTA-underlättas utsöndring av phloem sav. Denna metod använder EDTA för att förhindra tätning av floem 20. EDTA kelaterar Ca 2 + joner som annars skulle delta i processer som tätar floem. Även EDTA kan leda till cellskador 30, har flera grupper använt denna metod och observerades ingen negativ effekt av EDTA koncentrationer från 10 till 20 mm på cellens ultrastrukturen eller på phloem lastning och transport 5, 24. För att minska eventuella skadliga effekter samt störning av EDTA med kromatografi och gelelektrofores, är växter flyttade in vatten efter 1 h och endast den senare delen av exsudat används 14. Således, snarare än utsvettning i EDTA, är floem exudated i vatten (EDTA-underlättas utsvettning). Det är en rättfram, låg kostnad och låg-tech metod för insamling av floem utsöndringar. Floem sap erhållits på detta sätt kan användas för att analysera proteiner, små molekyler, lipider, och RNA och har använts framgångsrikt i många växter. Medan ett begränsat antal experiment har utförts i monokotyledoner 11 verkar denna metod att vara mer lämpade för dikotyledoner (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Poppel 7). Insamling av utsöndringar måste ske i en fuktig miljö för att undvika förlust av utsöndringar genom transpiration. Beroende på växten, är inkubering i EDTA under en till två timmartillräcklig för att förhindra försegling av floem / sil element. Samlingen kan då uppstå i vatten. Detta har fördelen av att förhindra den negativa effekten EDTA har på cellstruktur och stabilitet. Det eliminerar också inblandning av EDTA med metoder som HPLC eller SDS-PAGE. Det visas eftersom det gäller Arabidopsis. För större anläggningar, har inkubation i EDTA och exsudat samlingar måste skalas upp och utförs i bägare istället i 1,7 ml provrör.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

Anläggningen phloem är viktigt för långväga transporter av (bild-) assimilerar samt av signaler förmedlar biotisk eller abiotisk stress. Den innehåller socker, aminosyror, proteiner, RNA, lipider och andra metaboliter. Medan det finns ett stort intresse för att förstå sammansättning och funktion av floem, den roll som många av dessa molekyler och därmed deras betydelse för växtens utveckling och stress har ännu inte fastställts. Ett hinder för floem analys ligger i det faktum att de floem förseglar sig själv vid såra. Som ett resultat, är det antal växter från vilka floem sav kan erhållas begränsad. En metod som möjliggör insamling av floem utsöndringar från flera växtarter utan tillsatt utrustningen är EDTA-underlättas phloem exsudat kollektion beskrivs här. Även om det är lätt att använda, leder det till såra av celler och försiktighet måste vidtas för att ta bort innehållet i skadade celler. Dessutom till flera kontroller bevisa renhet exsudatär nödvändiga. Eftersom det är en utsöndring snarare än en direkt samling av floem sav (inte möjligt i många arter) endast relativ kvantifiering av dess innehåll kan förekomma. Fördelen med denna metod framför andra är att det kan användas i många örtartade eller vedartade växtarter (Perilla, Arabidopsis, poppel, etc.) och kräver minimal utrustning och utbildning. Det leder till rimligt stora mängder utsöndringar som kan användas för efterföljande analys av proteiner, sockerarter, lipider, RNA, virus och metaboliter. Det är enkelt nog att den kan användas både i forskning och i en undervisning laboratorium.

Det har blivit uppenbart under de senaste åren att det komplicerade floem sav kan vara svaret på frågan om hur växter skickar varierande utvecklings och stress signaler för optimal respons. Använda EDTA-underlättat phloem exudation kan ge möjlighet att analysera floem utsöndringar från växter som inte är lämpliga för andra metoder, men kan vara av ekonomiskt eller fysiologisk intresse. Denna metod gör det möjligt för skörd av tillräcklig phloem utsöndringar att identifiera floemet-lokaliserade proteiner och upptäcka förändringar i deras svar på utveckling eller stress (Figur 3). Som framgår av figuren, proteiner i mycket begränsad omfattning, men ändå, är deras nivå är tillräckligt hög för senare proteomik experiment med LC-MS/MS eller för Western blot-analys. Fynd i gurkväxter antyder att avskärningen av skaftet leder till en störning av den vattenpotentialen balans och en efterföljande inflöde av vatten ocheventuella föroreningar från apoplasten 41. Ändå kollektion för tider från ett till åtta timmar påverkar inte floem proteinprofilen / komposition i Arabidopsis (. Endast det absoluta beloppet varierar Guelette et al), mängden protein samlas och mönstret hittade proteiner varierar mellan arter (Arabidopsis: Vid, Perilla, lane I och NI) och behandlingar (Perilla odlas vid olika dag längder, lane I och NI). Som ett resultat proteinaktiga signaler kan visualiseras, identifieras och följas. mRNA och mikro RNA kan också identifieras i floem utsöndringar genom denna metod. Emellertid är behandling med RNAse inhibitor nödvändig för att förhindra nedbrytning av mRNA under den förlängda utsvettning tid. Eftersom sikten element inte innehålla funktionella kloroplasterna, Rubisco liten eller stor subenhet (RBC eller RbCl, respektive) mRNA kan användas som negativa kontroller, medan känd floem-Lokaliserad mRNA som Ubiquitin-konjugerande enzym kan användas som en positiv kontroll (figur 4). På liknande sätt kan socker eller små metaboliter analyseras med användning av antingen GC-MS eller LC-MS. Här bör det nämnas att de floem utsöndringar innehåller ett stort antal funktionella enzymer, inklusive nästan hela glykolytiska vägen 12. Därför kan användning av flera tidpunkter avslöja metaboliska processer under exsudat samlingen. Ett exempel visas i Figur 5: I samtliga utsöndringar, är sackaros den mest förekommande metaboliten, Detta är mest uppenbart efter en insamling till en timme. Men efter fem timmar sackaros till fruktos är något reducerad. Om samma exsudat samlas i en timme och kvar på bänken under de kommande fyra timmar, är sackaros till fruktos reduceras till en mycket större utsträckning, vilket tyder på att aktiva enzymer i floem utsöndringar lett till en försämring av sackaros vid rumstemtemperatur (för mer topp tolkningar se 14). Detta stämmer överens med fynd som phloem lastning och transport av molekyler från följeslagare celler i sikten elementen kan fortsätta under utsöndring tills systemet förlorar sin vitalitet 34. Lipider i floem utsöndringar och, i förlängningen, långväga lipid-signalering är en relativt ny intresseområde inom växtforskningen. På grund av deras hydrofoba natur lipider är bara närvarande i låga koncentrationer och kan vara bunden till andra molekyler för solubilisering. Ändå tillåter EDTA-underlättas utsvettning för insamling av tillräckligt material för att visualisera (TLC, Figur 6) och identifiera (LC-MS, Figur 7) floem lipider från flera växtarter. Som figuren visar att det är möjligt att identifiera och separera flera lipid arter. LC-MS tillåter att identifiera olika lipid arter och följa förändringar inom lipid profiler different genotyper eller behandlingar. Detta gör det möjligt att studera rollen av lipider under anläggningens utveckling och stress. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figur 1. Flödesschema för insamling av floem utsöndringar av Arabidopsis eller Perilla. Olika vägar leder till olika slutprodukter, som anges i blått. För beredning av RNA, RNAs-inhibitor (100 E / ml, Roche) tillsätts till vattnet i vilket floem exsudatet uppsamlas. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figur 2. Inställning av material för phloem exsudat samlajon. Installationsprogrammet visar alla material som behövs för protokollsteg 3,1-3,4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figur 3 Proteiner som finns i floem utsöndringar av två olika växtarter, Arabidopsis (At) och Perilla (I och NI, olika dag längder), MW: molekylviktsmarkör (spår 2). Proteiner separerades med användning av en 10-20% gradient SDS-PAGE. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figur 4. Analysav närvaron av mRNA för Rubisco lilla och stora subenheten (RBCs och RbCl, respektive) och ubikitin-konjugerande enzym (UBC). mRNA uppsamlades från Arabidopsis blad (L), bladskaft (P), och floem exudat (Ph), transkriberades omvänt och specifika transkript visualiseras med användning av PCR. Siffran ändrades från Guelette et al. 14. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figur 5. GC-MS profil phloem utsöndringar samlas för olika mängd gånger. Notera hur den relativa mängden av sackaros förändringar från 1 timme samling (A) till 5 timmar efter provtagning tid (B). Sårsekret profil efter kollektion för 1 timme följt av &quot;inkubation&quot; på rummet<html> temperatur (RT) under fyra timmar (C). Leaf metabolit profil (D). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figur 6. Tunnskiktsplattor kromatogram jämföra lipider från Perilla (vänster) och Arabidopsis (höger) blad och utsöndringar floem. Asterisker indikerar lipider specifika för floem utsöndringar. DGDG: digalaktosyldiacylglycerol, PG: fosfatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; Den delen av figuren visar Arabidopsis lipider har ändrats från Guelette et al 14.. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-sida =&quot; alltid &quot;&gt; <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figur 7. Lipid profil floem utsöndringar av Arabidopsis (kloroformfas) med LC-MS / negativ jon-läge. Grafer i toppen (mutant, A) och botten (vildtyp, B) visar skillnaderna i lipidprofiler mellan två olika genotyper (anges med pilar). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method at JoVE.com

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Kunskap om sammansättningen av floem sav samt mekanismen för dess lastning och långväga transporter är avgörande för förståelsen av långväga signalering i växtens utveckling och stress / patogen respons och assimilera transporter. Detta manuskript beskriver insamling av floem utsöndringar använder EDTA-underlättas metoden.

Insamling och analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloem utsöndringar Använda EDTA-underlättas Metod

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

En enkel metod för Imaging Arabidopsis Blad Använda Perfluorodecalin som en infiltrativ Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell särskild analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blad Använda fluorescensaktiverad cellsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

En effektiv metod för kvantitativ, analys Encelliga av Chromatin Ändring och Nuclear Arkitektur i hela-fäste fröämnen i<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detektion och analys av DNA-skador i Mouse skelettmuskulatur<em&gt; In situ</em&gt; Använda TUNEL metoden

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardiserad metod för High-throughput sterilisering av Arabidopsis frön

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

En mångsidig metod för montering av Arabidopsis lämnar för Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Membransmörgåsmetod i två lager för Laodelphax striatellus salivsamling

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

En förbättrad Chemotaxis-analys för snabb identifiering av Rhizobacterial Chemoattractants i Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Spermieuppsamling och datorstödd spermieanalys i teleostmodellen japansk medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Levande avbildning av Arabidopsis pollenrörsmottagning och dubbelbefruktning med semi-in vitro cum septum-metoden

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...