Name: expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System at J

Wij willen Patrick C. Wilson bedanken voor monoklonaal antilichaam CR9114. We danken ook Jennifer Debeauchamp en Richard Webby voor de originele A/Anhui/1/13 plasmiden. Gedeeltelijke ondersteuning voor dit werk werd geleverd door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten gefinancierd programma Project Grant AI097092-01A1 en CEIRS (Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance, HHSN26620070010C). FK werd ondersteund door een Erwin Schrödinger fellowship (J 3232) van de Oostenrijkse Science Fonds (FWF).

1. Generatie van recombinant Baculovirus <ol><li> Klonering in baculovirus transfer-plasmiden <ol><li> Clone H7 HA en N9 NA ectodomain (of een andere HA of NA-gen) in aangepaste pFastBac overdracht plasmiden (zie inleiding). Vectoren voor HA bevattende een C-terminale domein trimerisatie en een hexahistidine tag, en voor NA die een N-terminale tetramerisatie domein en hexahistidine tag, beschreven 1,10,11,22 (figuur 1) en kan worden opgevraagd de auteurs. Toelichting:</strong...

<ol>
	<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates.">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603 (2012).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., C&#225;rdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock,+ecuador.">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li><li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice.">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans.">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li><li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses.">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li><li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination.">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li><li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase.">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li><li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus.">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus.">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoplusia+ni+cells+(High+Five)+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles:+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines.">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li><li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+for+antibody+production:+evaluation+of+an+efficient+alternative.">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li><li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A/Brisbane/59/07+and+B/Florida/04/06+when+produced+in+various+protein+expression+systems.">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li><li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection.">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li><li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+(FluBlok)+against+influenza+in+healthy+adults:+a+randomized,+placebo-controlled+trial.">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li><li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase.">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li><li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells.">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+(H7N9)+Virus.">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li><li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin.">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses.">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li><li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza.">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li><li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+A+virus+(H7N7)+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome.">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li><li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li></ol>

Hoewel expressie van influenzavirus HA en NA eiwitten in insectencellen met het baculovirus expressiesysteem het algemeen ongecompliceerd, er een aantal belangrijke punten om te overwegen. Het is belangrijk, zoals in de inleiding, dat de ectodomeinen van HA en NA worden uitgedrukt in fusie met trimerisatie of tetramerisatie domeinen, respectievelijk. Deze domeinen correcte vouwing van de moleculen begeleid vanuit het transmembraandomein, die niet voorkomen als alleen het ectodomein uitgedrukt. Bijvoorbeeld, de expressie...

Als eerste reactie op de recente opkomst van nieuwe H7N9 influenza-virusstam in China, verwierven wij plasmiden die de genomische sequenties voor de hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) genen van de eerste twee isolaten. Met deze plasmiden konden we snel bouwen baculovirus expressievectoren voor de productie van recombinant HA en NA in insectencellen. Deze uitdrukking systeem goed is ingeburgerd in ons laboratorium en is van cruciaal belang voor veel van onze lopende onderzoeksprojecten 1-8 bewezen. Insect cellen in staat zijn te kunnen vouwen en post-translationeel complexe eiwitten te wijzigen. Deze modificaties omvatten N-gebonden glycosylering, wat belangrijk is voor veel virale glycoproteïnen. Als zodanig is het niet verwonderlijk dat de baculovirussysteem vrij is opgericht voor het uiten van influenzavirus oppervlakte-antigenen. In feite zijn veel van de HA en NA kristalstructuren zijn opgelost middels insectencel tot expressie gebrachte eiwitten 9-11. Een ander voordeel van desysteem is de betrouwbare eiwitrijk opbrengsten van maximaal 30 mg HA / L cellen (gebaseerd op onze ervaring met meer dan 50 verschillende eiwitten HA) - gevolg van virus-infectie aangedreven expressie van de sterke polyhedrine promoter. Verwijdering van het transmembraan en endodomein van het HA en NA eiwitten maakt expressie van uit te scheiden, oplosbare versies van de eiwitten en daarmee aanzienlijk vergemakkelijkt het zuiveringsproces. Bovendien zijn deze ectodomeinen hexahistidine gelabeld en derhalve worden gezuiverd middels affiniteitschromatografie met Ni2 +-hars. De transmembraandomeinen van HA en NA eiwitten dragen respectievelijk homotrimeer en homotetrameer formatie. Om deze oligomerisaties behouden, voegen we een C-terminaal domein trimerisatie de HA-en een N-terminale tetramerisatie domein aan de NA constructen (figuur 1). We hebben onomstotelijk aangetoond dat een dergelijke trimerisatie domein stabiliseert functionele, gevolgenGraco behoudt conformationele epitopen op de stengel-domein van de HA 1. De juiste tetramerisatie van de NA kan ook bijdragen aan vouwen en NA functie 10 corrigeren. Sequenties en baculo-overdracht vectoren herbergen trimerisatie of tetramerisatie domeinen kunnen worden opgevraagd bij de auteurs of van andere laboratoria in het veld, 9,10,12. Een ander belangrijk punt voor expressie van uitgescheiden eiwitten in insectencellen is de keuze van de juiste cellijn. Terwijl Spodopterafrugiperda afgeleid Sf9 cellen ondersteunen baculovirus replicatie heel goed en worden meestal gebruikt voor virus rescue en vermeerdering, hebben zij beperkte capaciteit om grote hoeveelheden eiwit uitscheiden. Trichoplusia ni afgeleid BTI-TN-5B1-4 cellen (algemeen bekend als High Five) hebben een hogere uitscheiding capaciteit en zijn de cellijn van de keuze voor expressie in dit protocol 13,14. Voorts is het nuttig te verminderen of zelfs te verwijderen foetaal runderserum (FBS) van expressie culturen. We gebruiken ook media met verminderde (3%) FBS inhoud voor het kweken van het virus werkvoorraden en voeren we de eiwitexpressie in serumvrij medium. Recombinant HA en NA eiwitten worden gebruikt voor vele immunologische technieken. Misschien is de meest voorkomende is in ELISA-testen voor het meten van serum conversie na vaccinatie bij mensen of dieren 4,6,7,15. Heeft en NA worden ook gebruikt in ELISPOT testen zowel stimulerende moleculen en detectie reagentia voor antilichamen uitscheidende cellen 16. Het gebruik als moleculaire lokaas kan specifiek sorteren voor plasmablasten of andere soorten B-cellen die vervolgens kunnen worden gebruikt om (therapeutische) monoklonale antilichamen (mAbs) te isoleren. Recombinant HA en NA moleculen worden verder gebruikt voor de karakterisatie van deze mAbs 8. Andere voorbeelden zijn de studie van de pH-stabiliteit of receptor specificiteit van HAS door verschillende virus isolaten vertoonden, of kwantitatief beoordelen van specifieke NA enzymatischeactiviteit of resistentie tegen remmers. Verder recombinant gezuiverd HA kan worden om HA-gehalte van geïnactiveerd influenzavirus vaccin standaardiseren. Belangrijk, rHA (en tot op zekere hoogte NA) kandidaat-vaccins worden momenteel getest in diermodellen en klinische proeven op mensen met een kandidaat-vaccin wordt in licentie gegeven door de FDA in 2013 2,17-19. Het voordeel van deze nieuwe vaccins is dat door de recombinante aard van deze eiwitten, het arbeidsintensieve proces van produceren van hoge groei reassortante virussen kunnen worden vermeden. Misschien nog belangrijker is het feit dat de HA rendement is hoog en reproduceerbaar van stam tot stam. Ook, omdat deze vaccins worden geproduceerd in een ei-vrij systeem, ze niet eiwitverontreinigingen die problematisch zijn voor mensen met een ei-allergie bevatten. Hier kozen we voor de HA en NA eiwitten tot expressie van twee isolaten van de nieuwe Chinese H7N9 griepvirus, A / Anhui/1/13 en A/Shanghai/1/13 20,21. Dit zijn geschikte voorbeelden, maar de beschreven protocol kan worden toegepast voor expressie van een influenza A en B HA en NA eiwitten en kunnen worden aangepast aan andere uitgescheiden virale of cellulaire eiwitten tot expressie. Trimere of tetramere transmembraan eiwitten kunnen worden gekloneerd in de expressiecassettes voor HA en NA, respectievelijk. Echter, de meeste oplosbare uitgescheiden cellulaire eiwitten, zoals interferonen bijvoorbeeld geen extra domein voor stabilisatie nodig en kan alleen worden uitgedrukt met een C-terminale hexahistidine tag.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

Het baculovirus expressiesysteem is een krachtig hulpmiddel voor expressie van recombinante eiwitten. Hier gebruiken we het om correct gevouwen en geglycosyleerd versies van het influenza A-virus oppervlakte glycoproteïnen produceren - het hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA). Als voorbeeld, we kozen voor de HA en NA eiwitten door het nieuwe H7N9 virus dat onlangs naar voren gekomen in China uitgedrukt. Maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor HA en NA eiwitten op andere influenza A en B virusstammen uitgedrukt. Recombinant HA (rHA) en NA (RNA) eiwitten zijn belangrijke reagentia voor immunologische testen zoals ELISPOT en ELISA, en zijn ook veel gebruikt voor vaccin standaardisatie, antilichaam ontdekking, isolatie en karakterisering. Bovendien kunnen recombinante NA moleculen worden gebruikt om te screenen op kleine moleculen remmers en zijn nuttig voor het karakteriseren van de enzymatische functie van de NA, en de gevoeligheid voor antivirale middelen. Recombinante HA-eiwitten zijn ook being getest experimentele vaccins in diermodellen, en een vaccin op basis van recombinant HA werd onlangs erkend door de FDA voor gebruik bij mensen. Werkwijze beschrijven we hier om de moleculen is eenvoudig en kan onderzoek naar influenza-laboratoria, aangezien het voor de productie van grote hoeveelheden eiwitten snel en tegen lage kosten. Hoewel hier richten we ons op influenzavirus oppervlakte glycoproteïnen kan deze werkwijze ook worden gebruikt om andere virale en cellulaire oppervlakte-eiwitten.

HA moleculen uit A/Shanghai/1/13 en A/Anhui/1/13 goed uitgedrukt met opbrengsten van ongeveer 20 mg / L cultuur. NA moleculen van beide stammen vertoonden matige expressieniveaus van 0,2 mg / l cultuur A/Shanghai/1/13 tot 0,7 mg / L voor A/Anhui/1/13. Alle vier eiwitpreparaten had zeer weinig tot geen onzuiverheden (figuren 8A en B) met HEEFT zijnde van een hogere zuiverheid dan NA dat verklaard kan worden door de expressie niveau. A/Shanghai/1/13 HA werd verder geanalyseerd met behulp ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System at J

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.

Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Schaalbare High Throughput Selectie Van faagweergegeven Synthetische Antibody Bibliotheken

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescentie gebaseerde neuraminidase remmingstest om de gevoeligheid van de influenza virussen zijn voorgesteld om de neuraminidase remmer Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...