Name: expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System at J

Vi vil gjerne takke Patrick C. Wilson for monoklonalt antistoff CR9114. Vi takker også Jennifer Debeauchamp og Richard Webby for de opprinnelige A/Anhui/1/13 plasmider. Delvis støtte for dette arbeidet ble gitt av National Institute for Allergy og smittsomme sykdommer-finansiert program Prosjekt Grant AI097092-01A1 og CEIRS (Centers of Excellence for Influensa Forskning og overvåkning, HHSN26620070010C). FK ble støttet av en Erwin Schrödinger fellesskap (J 3232) fra den østerrikske Science Fund (FWF).

En. Generering av rekombinant Baculovirus <ol><li> Kloning inn baculovirus transfer-plasmider <ol><li> Clone H7 HA og N9 NA ektodomenet (eller hvilken som helst annen HA eller NA-genet) i modifiserte pFastBac overføre plasmider (se innledningen). Vektorer for HA inneholdende en C-terminal trimeriseringsdomenet og en hexahistidine tag, samt for NA inneholdende et N-terminalt domene tetramerization og hexahistidine tag, er blitt beskrevet 1,10,11,22 (fig. 1) og kan forespørres fra forfatter...

<ol>
	<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates.">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603 (2012).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., C&#225;rdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock,+ecuador.">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li><li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice.">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans.">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li><li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses.">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li><li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination.">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li><li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase.">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li><li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus.">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus.">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoplusia+ni+cells+(High+Five)+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles:+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines.">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li><li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+for+antibody+production:+evaluation+of+an+efficient+alternative.">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li><li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A/Brisbane/59/07+and+B/Florida/04/06+when+produced+in+various+protein+expression+systems.">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li><li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection.">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li><li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+(FluBlok)+against+influenza+in+healthy+adults:+a+randomized,+placebo-controlled+trial.">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li><li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase.">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li><li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells.">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+(H7N9)+Virus.">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li><li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin.">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses.">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li><li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza.">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li><li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+A+virus+(H7N7)+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome.">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li><li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li></ol>

Selv om ekspresjonen av influensavirus-HA-og NA-proteiner i insektceller ved hjelp av baculovirus ekspresjonssystem er generelt rett frem, er det flere viktige punkter for å vurdere. Det er viktig, som påpekt i innledningen, at ectodomains av HA-og NA er uttrykt i fusjon med trimeriserings eller tetramerization domener, respektivt. Disse domenene sikre korrekt folding av molekylene vanligvis assistert av den transmembrane domene, som ikke er tilstede hvis bare ektodomenet uttrykkes. For eksempel er ekspresjon av HA ek...

Som en første reaksjon på den siste fremveksten av det nye H7N9 influensavirus stamme i Kina, vi ervervet plasmider som bærer de genomiske sekvenser for hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) gener i de to første isolater. Ved hjelp av disse plasmider var vi i stand til raskt å konstruere baculoviral ekspresjonsvektorer for produksjon av rekombinante HA-og NA i insektceller. Dette uttrykket systemet er godt etablert i vårt laboratorium og har vist seg avgjørende for mange av våre pågående forskningsprosjekter 1-8. Insektceller er i stand til å fullstendig brette-og post-translasjonelt modifisere komplekse proteiner. Disse modifikasjoner inkluderer N-bundet glykosylering, noe som er viktig for mange virus-glykoproteiner. Som sådan, er det ikke overraskende at baculovirus-systemet er helt etablert for å uttrykke influensavirus overflateantigener. Faktisk har mange av HA-og NA-krystallstrukturer blitt løst ved hjelp av insektceller uttrykte proteiner 9-11. En annen fordel med densystemet ligger i sin pålitelige høy proteinutbytter på opp til 30 mg av HA / L cellekultur (basert på vår erfaring med mer enn 50 forskjellige HA proteiner) - en konsekvens av virus-infeksjon drevet uttrykk fra den sterke polyhedrinpromotor. Fjerning av det transmembrane og endodomain av HA-og NA-proteiner tillater ekspresjon av utskillbare, oppløselige versjoner av proteinene og dermed i stor grad letter renseprosessen. I tillegg er disse ectodomains hexahistidine merket og kan derfor bli renset ved anvendelse av affinitetskromatografi ved hjelp av Ni 2 +-harpiks. De transmembrane domener av HA og NA proteiner bidra til homotrimer og homotetramer formasjon, henholdsvis. For å bevare disse oligomerizations, legger vi en C-terminal domene til trimeriserings HA-og en N-terminal tetramerization domenet til NA konstruerer (figur 1). Vi har bevist at en slik Trimeriserdomene stabiliserer funksjonell, konserved conformational epitoper på stilken-domenet til HA en. Den korrekte tetramerization av NA kan også bidra til å korrigere folding og NA-funksjon 10. Følger og baculo-overføring vektorer trimeri eller tetramerization domener kan bli bedt om fra forfatterne eller fra andre laboratorier i feltet, 9,10,12. En annen viktig sak for ekspresjon av utskilte proteiner i insektceller er valget av den riktige cellelinje. Mens Spodoptera frugiperda avledet Sf9 celler støtte baculovirus replikering veldig godt og er vanligvis brukt for virus redning og forplantning, har de begrenset kapasitet til å skille store mengder protein. Trichoplusia ni avledet BTI-TN-5B1-4 celler (kjent som High Five) ha en høyere kapasitet og sekresjon er cellelinjen grepet av ekspresjon i denne protokollen 13,14. Videre er det nyttig til å redusere eller til og med fjerne føtalt bovint serum (FBS) fra uttrykket kulturer. Vi bruker derfor media med redusert (3%) FBS innhold for voksende virusarbeids aksjer, og vi utfører protein uttrykk i serum frie medier. Rekombinante HA-og NA-proteiner blir brukt i mange immunologiske teknikker. Kanskje den mest vanlige er i ELISA-analyser for å måle serum konvertering ved vaksinering hos mennesker eller dyr 4,6,7,15. Har og NAs brukes også i ELISPOT analyser som både stimulerende molekyler og påvisningsreagenser for antistoff sekresjonsceller 16. Deres anvendelse som molekylære agn gjør det mulig å spesifikt sortere for plasmablasts eller andre typer av B-celler som deretter kan brukes for å isolere (terapeutiske) monoklonale antistoffer (mAbs). Rekombinante HA-og NA-molekyler blir videre brukt til karakteriseringen av disse mAbs 8. Andre eksempler inkluderer studere pH stabilitet eller reseptor spesifisitet har uttrykt ved ulike virusisolatene, eller kvantitativt vurdere konkrete NA enzymatiskaktivitet eller motstand mot hemmere. Videre rekombinant, renset HA kan anvendes for å standardisere innholdet av HA inaktiv influensavirus-vaksiner. Viktigere, rHA (og til en viss grad NA) vaksinekandidater er under utprøving i dyremodeller og kliniske studier med en vaksine kandidat blir lisensiert av FDA i 2013 2,17-19. Fordelen med disse nye vaksiner er at, på grunn av det rekombinante natur av disse proteinene, kan en arbeidskrevende prosess med generering av høye vekst reassorterte virus unngås. Kanskje enda mer relevant er det faktum at deres HA avkastning er høy og reproduserbar fra belastning til belastning. Også, siden disse vaksiner er produsert i en egg-fritt system, at de ikke inneholder protein-forurensninger som er problematiske for personer med allergier egg. Her valgte vi å uttrykke HA og NA proteiner fra to isolater av romanen kinesisk H7N9 influensavirus, A / Anhui/1/13 og A/Shanghai/1/13 20,21. Disse er rettidig eksempler, men den beskrevne protokoll kan anvendes for ekspresjon av hvilken som helst av influensa A og B HA eller NA-proteiner, og kan være tilpasset til å uttrykke andre utskilling av virale eller cellulære proteiner. Trimere eller tetramer transmembrane proteiner kan bli klonet inn i ekspresjonskassetter som brukes for HA-og NA, respektivt. Men de fleste løselige utskilling av cellulære proteiner, som interferoner for eksempel, trenger ikke en ekstra domene for stabilisering og kan uttrykkes utelukkende med en C-terminal hexahistidine tag.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

The baculovirus expression system er et kraftig verktøy for ekspresjon av rekombinante proteiner. Her bruker vi den til å produsere riktig foldet og glykosylert versjoner av influensa A virus overflate glykoproteiner - hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA). Som et eksempel, vi valgte HA og NA proteiner uttrykt av romanen H7N9-viruset som nylig dukket opp i Kina. Men protokollen kan enkelt tilpasses for HA og NA proteiner uttrykt av noen annen influensa A og B virusstammer. Rekombinant HA (rHA) og NA-(RNA) proteiner er viktige reagenser for immunologiske analyser som ELISPOT-og ELISA, og er også i utstrakt bruk for vaksine standardisering, antistoff oppdagelse, isolering og karakterisering. Videre kan rekombinante NA-molekyler anvendes for screening av små molekyl-inhibitorer og er nyttige for karakterisering av den enzymatiske funksjon av NA, så vel som dens følsomhet overfor antivirale midler. Rekombinante HA proteiner er også being testet som vaksiner i dyremodeller, og en vaksine basert på rekombinant HA ble nylig godkjent av FDA for bruk i mennesker. Metoden som beskrives her for å produsere disse molekylene er rett frem og kan lette forskning i influensa laboratorier, siden den gjør det mulig for produksjon av store mengder av proteiner raskt og til en lav kostnad. Selv om vi her fokuserer på influensavirus overflate glykoproteiner, kan denne metoden også brukes til å produsere andre viral og cellulære overflateproteiner.

HA molekyler fra A/Shanghai/1/13 og A/Anhui/1/13 uttrykt godt med avkastning på ca 20 mg / L kultur. NA molekyler av begge stammer viste moderate uttrykk nivåer som spenner fra 0,2 mg / L kultur for A/Shanghai/1/13 til 0,7 mg / L for A/Anhui/1/13. Alle fire proteinpreparater hadde svært liten eller ingen urenheter (Tall 8A og B) med har blir av høyere renhet enn NAs som kan forklares av uttrykket nivå. A/Shanghai/1/13 HA ble analysert videre med ELISA med bredt nøytraliserende ste...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System at J

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Her beskriver vi en måte å uttrykke korrekt foldet og funksjonelle influensavirus overflateantigener avledet fra romanen kinesiske H7N9-viruset i insektceller. Teknikken kan tilpasses til å uttrykke ectodomains av noen virale eller cellulære overflateproteiner.

Expression of Functional rekombinant hemagglutinin og neuraminidase Proteiner fra Novel H7N9 Influensa virus Bruke Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Emballasje HIV-eller FIV-baserte Lentivector Expression konstruerer og transduksjon av VSV-G Pseudotyped viruspartikler

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity Rensing av influensavirus ribonucleoprotein Komplekser fra Chromatin av infiserte celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redning av rekombinant Newcastle Disease Virus fra cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalerbar høy gjennomstrømning Utvalg fra fag-vises Syntetiske antistoffbiblioteker

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av musen Mx1 Protein med influensa A virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influensa A virus Detection og isolering mot svine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescens-baserte Neuraminidase inhiberingsanalyse for å vurdere i hvilken grad influensavirus til neuraminidase Inhibitor Class of Antivirale

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...