Name: expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System at J

Biz monoklonal antikor CR9114 Patrick C. Wilson teşekkür etmek istiyorum. Biz de orijinal A/Anhui/1/13 plazmidlerinin Jennifer Debeauchamp ve Richard Webby teşekkür ederim. Bu iş için kısmi destek Alerji Ulusal Enstitüsü tarafından sağlanan ve Bulaşıcı Programı Proje Hibe AI097092-01A1 ve CEIRS (Grip Araştırma ve Gözetim için Mükemmeliyet Merkezleri, HHSN26620070010C) Hastalıkları-finanse edildi. FK Avusturya Bilim Fonu&#39;nun (FWF) bir Erwin Schrödinger&#39;in bursu (J 3232) tarafından desteklenmiştir.

1.. Rekombinant Bakulovirüsün Üretimi <ol><li> Bakulovirüs transfer-plasmidler içine klonlanması <ol><li> Klon H7 HA ve modifiye edilmiş plazmid aktarma pFastBac içine N9 NA ekto-saha (veya başka bir HA ya da NA geni) (giriş bölümüne bakınız). HA, bir N-terminal domain ve tetramerizasyon hekzahistidin etiketi ihtiva eden bir C-terminal domain ve bir trimerleştirme hekzahistidin etiketi ihtiva eden, hem de NA için vektörler, (Şekil 1) 1,10,11,22 tarif edilmiş ve talep edi...

<ol>
	<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates.">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603 (2012).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., C&#225;rdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock,+ecuador.">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li><li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice.">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans.">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li><li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses.">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li><li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination.">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li><li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase.">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li><li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus.">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus.">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoplusia+ni+cells+(High+Five)+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles:+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines.">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li><li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+for+antibody+production:+evaluation+of+an+efficient+alternative.">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li><li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A/Brisbane/59/07+and+B/Florida/04/06+when+produced+in+various+protein+expression+systems.">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li><li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection.">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li><li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+(FluBlok)+against+influenza+in+healthy+adults:+a+randomized,+placebo-controlled+trial.">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li><li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase.">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li><li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells.">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+(H7N9)+Virus.">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li><li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin.">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses.">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li><li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza.">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li><li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+A+virus+(H7N7)+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome.">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li><li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li></ol>

Bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak böcek hücrelerinde influenza virüsü HA ve NA proteinlerin ekspresyonu yalındır genel olarak da, dikkate birkaç önemli nokta vardır. Girişte işaret gibi HA ve NA ektodomenleridir sırasıyla trimerleştirme veya tetramerizasyon etki ile füzyon ifade edilir ki, önemlidir. Bu etki genellikle sadece ekto ifade edilir ise mevcut değildir transmembran alanı tarafından desteklenir moleküllerin doğru katlanmasını sağlar. Örneğin, bir trimerleştirme etki olmad...

Çin yeni H7N9 influenza virüsü suşunun yakın zamanda ortaya çıkmasına bir ilk tepki olarak, hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) ilk iki izolatın genlerinin genomik sekansları taşıyan plazmid aldı. Hızlı bir şekilde böcek hücrelerinde rekombinant HA ve NA üretimi için bakuloviral ifade vektörlerini oluşturmak için mümkün olan bu plazmidler kullanılarak. Bu ifade sistem iyi laboratuvarımızda kurulan ve devam eden araştırma projeleri 1-8 birçok önemli kanıtlanmıştır. Böcek hücreleri doğru katlayın ve çeviri sonrası kompleks proteinleri değiştirmek edebiliyoruz. Bu modifikasyonlar, pek çok viral glikoproteinler için önemli olan N-bağlı glikosilasyon içerir. Bu nedenle, bu bakulovirüs sistemi oldukça influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için kurulmuş olduğu şaşırtıcı değildir. Aslında, HA ve NA kristal yapılarının birçok böcek hücresi ifade edilen proteinler, 9-11 kullanılarak çözüldü. Diğer bir avantajıGüçlü polihedrin promoterinden virüs enfeksiyonu sürülen ifadesinin sonucu - sistemi (50&#39;den fazla farklı HA proteinleri ile deneyime dayalı) HA / L hücre kültürü kadar 30 mg onun güvenilir, yüksek protein verimi yatıyor. HA ve NA proteinlerin transmembran ve endodomain çıkarılması proteinlerin salgılanabilir, çözünür versiyonları ekspresyonu sağlar ve böylece büyük ölçüde saflaştırma işlemini kolaylaştırır. Ayrıca, bu ektodomenleridir hekzahistidin etiketlenir ve bu nedenle Ni 2 +-reçinesi kullanılarak afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. HA ve NA proteinlerin transmembran domainleri, ayrı ayrı, homotrimer ve homotetramer oluşumu katkıda bulunur. Bu oligomerizations korumak amacıyla, HA-ve NA için bir N-terminal tetramerizasyon alan (Şekil 1) oluşturur, bir C-terminal alanı trimerleştirme ekleyin. Biz böyle bir trimerleştirme alanı işlev, sırayla nu stabilize olduğunu kesin olarak göstermiştirHA 1 sap-etki şekilsel epitoplarını SVEd. NA doğru tetramerizasyon katlanma ve NA fonksiyonu 10 düzeltmek için katkıda bulunabilir. Trimerleştirme veya tetramerizasyon etki barındıran Diziler ve bakulo transfer vektörleri yazarların ya da alanında, 9,10,12 diğer laboratuarlardan talep edilebilir. Böcek hücrelerinde salgılanan proteinlerin ifadesi için diğer bir önemli konu, doğru hücre çizgisinin bir seçimdir. Spodoptera frugiperda Sf9 hücreleri, bakulovirüs çok iyi kopyalanmasını desteklemek ve genellikle virüs kurtarma ve yayılması için kullanılan türetilmiş olmakla birlikte, yüksek miktarda protein salgılaması için kısıtlı bir kapasiteye sahiptir. Trichoplusia ni (genellikle High Five olarak da bilinir) BTI-TN-5B1-4 hücrelerini türetilmiş Daha yüksek bir salgılama kapasitesine sahiptir ve bu protokol 13,14 ekspresyon için tercih edilen bir hücre çizgisidir. Bundan başka, cenin sığır serumu azaltmak ve hatta ortadan kaldırmak için yararlı olan (FBSentezleme kültürlerinden S). Bu nedenle çalışma stokları, virüs büyümesi için indirgenmiş (% 3) FBS içerikli ortamını kullanın, ve serum içermeyen medya içinde protein ekspresyonu gerçekleştirir. Yeniden birleştirici HA ve NA proteinleri birçok immünolojik teknikler kullanılmaktadır. Belki de en yaygın olanı, insanlarda veya hayvanlarda 4,6,7,15 aşılama üzerine serum dönüşüm ölçülmesi için ELISA deneyleri bulunmaktadır. Ve UA&#39;lar aynı zamanda, antikor salgılayan hücreler 16 için uyarıcı moleküllerin ve saptama reaktifleri olarak hem ELISPOT analizlerinde kullanılır. Moleküler yemler olarak kullanılması özellikle plazmablastlar ya da daha sonra (terapötik) monoklonal antikorların (mAb &#39;ler) izole etmek için kullanılabilir B-hücrelerinin diğer türleri için sıralamak sağlar. Yeniden birleştirici HA ve NA molekülleri ayrıca bu mAb&#39;lerin 8 karakterizasyonunda kullanılır. Diğer örnekler pH stabilitesini veya reseptör özelliklerini farklı virüs izolatları tarafından dile gelmiştir, ya da kantitatif değerlendirilmesi belirli NA enzimatik çalışma bulunmaktadırinhibitörleri ile faaliyet veya direnç. Bundan başka, rekombinant, arıtılmış, HA hareketsizleştirilmiş grip aşılarının HA içeriği standardize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, rHA (ve belli bir dereceye kadar NA) aşı adayları şu anda bir aşı adayı 2013 2,17-19 yılında FDA tarafından lisanslı olması ile hayvan modellerinde ve insan klinik deneylerle test ediliyor. Bu yeni aşıların avantajı, bu proteinlerin rekombinant doğası gereği, yüksek büyüme reassortant virüs üretme emek yoğun bir işlemi önlenebilir, yani. Belki daha uygun kendi HA verimi yüksek ve gerginlik gerginlik tekrarlanabilir olduğu gerçektir. Bu aşılar bir yumurta serbest sistemi üretilmektedir beri Ayrıca, onlar yumurta alerjisi olan bireyler için sorunlu olan protein kirletici içermez. Burada yeni Çin H7N9 influenza virüsü, A / Anh iki izolatlardan HA ve NA proteinleri ifade seçtiui/1/13 ve A/Shanghai/1/13 20,21. Bu zamanında örnekler, ancak tarif edilen protokol bir influenza A ve B HA veya NA proteinlerin ifadesi için kullanılabilir ve herhangi bir başka salgılanmış viral veya hücresel proteinleri ifade etmek için uyarlanabilir. Trimerik, tetramerik ya da zar proteinleri, sırasıyla HA ve NA için kullanılan ekspresyon kasetleri içerisine klonlanabilir. Ancak, çoğu çözünür salgılanmış hücresel proteinler, örneğin interferonlar gibi, stabilizasyon için ek bir etki gerek yoktur ve bir C-ucu heksahistidin etiketi ile sadece ifade edilebilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

Bakulovirüs sentezleme sistemi, rekombinant proteinlerin ifadesi için güçlü bir araçtır. Hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) - Burada grip doğru katlanmış ve glikosile edilmiş versiyonları A virüsü yüzey glikoproteinleri üretmek için kullanır. Örnek olarak, son zamanlarda Çin&#39;de ortaya çıkan yeni H7N9 virüsü tarafından ifade HA ve NA proteinleri seçti. Ancak Protokol kolayca başka bir influenza A ve B virüs türleri tarafından ifade edilen HA ve NA proteinler için uyarlanabilir. Yeniden birleştirici HA (rHA) ve NA (RNA) proteinleri, ELISPOT ve ELISA gibi immünolojik tahliller için önemli olan reaktif maddeler ve aşı standardizasyon, antikor keşfi, izolasyonu ve karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılan da vardır. Bundan başka, rekombinant NA moleküllerinin, küçük molekül inhibitörleri için taranması için kullanılabilir ve NA enzimatik fonksiyonunun karakterizasyonu yanı sıra antiviral için duyarlılığı için yararlıdır edilebilir. Yeniden birleştirici HA proteinleri de vardır being hayvan modellerinde deneysel aşı olarak test edilmiş ve yeniden birleştirici HA göre bir aşı son zamanlarda, insanlarda kullanım için FDA tarafından lisanslı oldu. Hızlı ve düşük maliyetle proteinleri büyük miktarlarda üretimi sağlar beri bu molekülleri üretmek için burada açıklamak yöntemi, yalındır ve grip laboratuarlarında araştırma kolaylaştırabilir. İnfluenza virüsü yüzey glikoproteinler odak burada da, bu yöntem, aynı zamanda, diğer viral ve hücre yüzeyi proteinleri üretmek için kullanılabilir.

A/Shanghai/1/13 ve A/Anhui/1/13 HA molekülleri, yaklaşık 20 mg / L kültür verimleri ile de ifade edilmiştir. Her iki soylarının NA molekülleri A/Shanghai/1/13 için 0.2 mg / L kültür A/Anhui/1/13 için 0.7 mg / L arasında değişen orta derecede ifade seviyeleri göstermiştir. Dört protein preparatları ekspresyon seviyesi ile açıklanabilir UA daha yüksek saflıkta olmak vardır ile (Şekil 8A ve B) herhangi bir yabancı madde için çok az vardı. A/Shanghai/1/13 HA da...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System at J

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...