Name: dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation
Uploaded: 2014-03-04T17:00:00
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作者は有用な議論とキュリー研究所の動物施設のためのフィブロネクチン、エリックTheveneau上の外植片の映像のためアデリーヌドリーに感謝します。 CMは、地方イル=ド=フランス（ドメーヌD&#39;Interet Majeurポール幹細胞）、大学パリシュッド（アタッシェTemporaire D&#39;Enseignementら·デ·ルシェルシュ）、および通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュのポスドクである。この作品は、大学のパリシュッド（Attractivite 2011）、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（アクションThematiqueらIncitativeシュールプログラム）によって資金を供給された、協会はラ·ルシェルシュコントルルがんグラントSFI20101201882、リーグコントルルがん、およびアジャン国立デラを注ぐRECHERCHE（アジャン国立·デ·ラ·ルシェルシュ·プログラム·ブラン）。

実験は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する国家および欧州の規制で、交換、削減、洗練された、国際的に確立された原則に準拠しています。 1。フィブロネクチンコートディッシュ14の調製<ol><li>ピペット標準的なプラスチックシャーレ（φ40×11 mm）の中に1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈した10 mg / mlの培養グレードのフィブロネクチンを5...

<ol>
	<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+delamination+and+migration:+from+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration.">Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).</li><li>Stuhlmiller, T. J., Garc&#237;a-Castro, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homeobox-containing+marker+of+posterior+neural+differentiation+shows+the+importance+of+predetermination+in+neural+induction.">A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction.</a> Cell. 50 (5), 749-758 (1987).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Monsoro-Burq, A. -. H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+induction+by+paraxial+mesoderm+in+Xenopus+embryos+requires+FGF+signals.">Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals.</a> Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).</li><li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent,+migratory,+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos.">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).</li><li>Sadaghiani, B., Thi&#233;baud, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+in+the+Xenopus+laevis+embryo,+studied+by+interspecific+transplantation+and+scanning+electron+microscopy.">Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy.</a> Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).</li><li>Theveneau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+chemotaxis+requires+contact-dependent+cell+polarity.">Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity.</a> Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).</li><li>Slack, J. M., Forman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interaction+between+dorsal+and+ventral+regions+of+the+marginal+zone+in+early+amphibian+embryos.">An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nieuwkoop, P. 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Biol. 260 (2), 449-464 (2003).</li><li>Fort, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+RhoU/Wrch1+GTPase+is+critical+for+cranial+neural+crest+cell+migration.">Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration.</a> Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).</li><li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4/Rac1+and+non-canonical+Wnt+signaling/RhoA.">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li><li>Kashef, J., K&#246;hler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-11+regulates+protrusive+activity+in+Xenopus+cranial+neural+crest+cells+upstream+of+Trio+and+the+small+GTPases.">Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases.</a> Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).</li><li>Hwang, Y. -. S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-X+is+required+for+cranial+neural+crest+cell+migration+in+Xenopus+laevis.">Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Neural+Crest+Induction,+Melanocyte+Specification,+and+Disease-Related+Pigmentation+Defects+in+hESCs+and+Patient-Specific+iPSCs..">Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs..</a> Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li><li>Shnitsar, I., Borchers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTK7+recruits+dsh+to+regulate+neural+crest+migration.">PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration.</a> Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).</li><li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4/Rac1+and+non-canonical+Wnt+signaling/RhoA.">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li><li>Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt11r+is+required+for+cranial+neural+crest+migration.">Wnt11r is required for cranial neural crest migration.</a> Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).</li><li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+inhibition+of+locomotion+in+vivo+controls+neural+crest+directional+migration.">Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration.</a> Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).</li><li>Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+requires+the+activity+of+the+extracellular+sulphatases+XtSulf1+and+XtSulf2.">Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2.</a> Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).</li><li>Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+the+Cytoplasmic+Domain+of+ADAM13+to+the+Nucleus+Is+Essential+for+Calpain8-a+Expression+and+Cranial+Neural+Crest+Cell+Migration.">Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration.</a> Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).</li><li>Borchers, A., David, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cadherin-11+restrains+cranial+neural+crest+migration+and+influences+neural+crest+specification.">Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification.</a> Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).</li><li>Borchers, A., Epperlein, H. -. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus.">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx2+is+essential+for+larval+hyobranchial+cartilage+formation+in+Xenopus+laevis.">Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).</li><li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues.">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li><li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li></ol>

このプロトコルは、 アフリカツメガエル胚においてpremigratory頭蓋NCを植するための簡単な技術が記載されている。このような実験に使用した胚は、堅牢で、よく治癒する必要があります。不健康な胚のいずれかのバッチを廃棄します。また、後段ではなく、17で神経堤を切除するために、（12〜18〜20℃に）様々な温度で胚を成長する。ステージ17の後に、神経堤は頭部中胚葉と混合して...

神経冠（NC）は、脊椎動物胚における神経胚形成の終了時に神経管から出てくる一過性胚細胞集団である。 NCの仕様を制御するシグナル伝達および遺伝的事象は、早ければ原腸形成として開始します。ノースカロライナ州は、周囲の背側の組織からの信号によって、神経および非神経外胚葉の境界に指定されています。神経胚形成の終了時に、NC細胞が上皮から間葉転換（EMT）を受けると案内手がかりを囲むに応答することによってステレオタイプのルート以下の胚で広く移動する。彼らは彼らの最終的な宛先に到達した後、彼らは誘導体、 例えばニューロン 、グリア、骨、軟骨、および色素性細胞1-5の広大な配列に分化する。多くの細胞種および胚組織への貢献のために、NC細胞開発のどの段階での欠陥は、誘導から最終分化、neurocristopathies 6という先天性の症候群を引き起こす可能性があります。 E様々な段階での開発のNCの新実験操作 - 仕様、EMT、移行、および分化は - neurocristopathiesの我々の理解を向上させ、潜在的な治療戦略の設計ができるようになります。 アフリカツメガエル胚は、NC開発を研究するための最適なモデルです。胚の多数を得るのは容易であり、体外受精は、開発の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にXを操作するために利用可能である胚発生ツメガエル 。機能獲得型と遺伝子ノックダウンは、初期の胞胚の個々のセルをマイクロインジェクションにより実行するのは簡単です。胚組織は、in vitro再アソシエーション7-11またはバックグラフト12,13のアッセイのために切断することができる。 このプロトコルでは、Xにpremigratory頭蓋NCを分析する方法を説明します移行前に、後半neurulas ツメガエル 。これらの外植片はフィブロネクチンジンジャーブレッドで培養することができるに移行し、分化を研究するDプレートは、in vitroの実験条件で制御。 NC外植片もまた、インビボでそれらの移動および分化を研究するために、通常の操作または宿主胚に移植することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4759-1MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bovine Serum Albumine. Fraction V</td>
			<td style="width:71px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">04-100-811-C</td>
			<td>Lower quality grade may&#160; be suitable for this application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Stainless Steel Insect Pins. Size 000</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td align="right" style="width:119px;">26001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation

神経堤（NC）は、神経胚形成の最後に上皮への間充織転換（EMT）を受けて、過渡背側神経管の細胞集団である様々な臓器に向けて広範囲に移動し、誘導体（ニューロン、グリア、多くのタイプに分化する軟骨や骨、色素性および内分泌細胞）。このプロトコルでは、in vivoおよびin vitroでのNC開発を研究するために、 アフリカツメガエル胚からpremigratory頭蓋NCを分析する方法について説明します。カエルモデルは、初期の開発を研究する多くの利点を提供しています。豊富なバッチは、胚がin vivoでのゲインと機能戦略の損失は前供与体および/ ​​またはホスト胚におけるNC郭清に遺伝子発現の操作を可能にする、迅速な開発、提供しています。 NC植片は、フィブロネクチン上に播種し、インビトロ研究のために使用することができる。これらは、無血清培地中で定義された数日間培養することができる。また、背面のNC植片を移植する方法を説明します生体内でのNCの移行および分化を研究するためのホスト胚へ。

フィブロネクチン上にプレーすると、神経堤の外植片が急速に（15〜30分）を取り付けて、外植片は2時間（ 図1A）内でフラットに広がる。 3-6時間の細胞が飛散し始めた後。 15℃で24時間で、多くの細胞が離れて外植片（ 図1Bおよび1C）からの移行を開始しました。卵黄は、位相コントラスト（ 図1B）の下で、細胞が非常に明るくなる。細胞の?...

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Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

このプロトコルは、 アフリカツメガエルの neurulasからpremigratory頭蓋神経堤（NC）を分析する方法について説明します。これらの外植片をin vitroで培養フィブロネクチン上に播種、または宿主胚に戻って移植することができる。この技術は、NC上皮から間葉移行、遊走、および分化の機序を研究することができる。

の解剖<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経堤のため<em&gt; in vitroで</em&gt;外植片培養又は<em&gt; in vivoで</em&gt;移植

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

アフリカツメガエルの胚および細胞接着アッセイのアセンブリから主催し、動物極の外植片の解剖

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

プラスチック製の埋め込みとアフリカツメガエル胚のセクショニング

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

アフリカツメガエル女性から卵子を入手

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...