Name: multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish at JoVE.com

Vi takker Max Planck Society, Human Frontier Science Program (HFSP) og Boehringer Ingelheim Fonds for finansiering og støtte.

En. Materiale Forberedelse <ol><li> Utarbeidelse av FEP-rør <ol><li> Rengjør FEP tube (Figur 2A) ved å skylle væsker (i fremgangsmåten beskrevet nedenfor) gjennom røret og ved hjelp av en sprøyte festet med en butt ende kanyle (figur 2B) Note 1:.. Bruk hansker hele prosedyren Note 2: Vi anbefaler kutte røret i stykker av ca. 1 m i lengde og rensing de i parallell. <ol><li> Spyle det første røret med 1 M NaOH gjentatte ganger. Deretter overføres røret til et 50 ml sentrifugerør fylt med 0,5 M NaOH og ultrasonicate det i 10 min. </li><li> Overfør polymer røret til en liten kum med DDH 2 O. Skyll røret først med DDH 2 O og deretter med 70% EtOH. </li><li> Deretter overføre FEP tube til en frisk sentrifugerør med 70% EtOH. Igjen ultrasonicate denne sentrifugerør i 10 min. </li></ol></li><li> Skjær den rensede FEP tube i biterpå ca 3 cm (en typisk lengde til bruk i sebrafisk montering og bildebehandling) og rette dem om nødvendig. Oppbevar de rengjorte FEP rør i en frisk 50 ml sentrifugerør fylt med DDH 2 O (figur 2C). </li></ol></li><li> Utarbeidelse av Tricaine stamløsning <ol><li> Forbered 0,4% Tricaine stamløsning ved oppløsning av 400 mg Tricaine (MS-222) i 97,9 ml DDH 2 O. Etter at pulveret er fullstendig oppløst, juster pH til 7,0 med 2,1 ml 1M Tris (pH 9,0). Beskytt løsning mot lys. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C. </li></ol></li><li> Fremstilling av 3% metylcellulose <ol><li> Forbered 3% methylcellulose-løsning for den indre belegg av FEP-rør som er beskrevet nedenfor. Varm opp E3 11 i en glassflaske til ca 60-70 ° C og legge til riktig mengde methylcellulose pulver. Legg til en rørestav og omrør ved 4 ° C. Så snart løsningen er avkjølt til under 30 ° C, tilsett Tricaine løsningen til en slutt-concentration av 100 mg / L. Hold omrøring ved 4 ° C over natten. </li></ol></li><li> Fremstilling av 1,5% og 0,1% agarose i E3 <ol><li> Oppløs den riktige mengde av lavt smeltepunkt agarose pulver i et definert volum av E3 i en glasskolbe. Varm opp blandingen i en mikrobølgeovn og rist den gang på en stund, inntil agarose løsning vises homogen, uten eventuelle gjenværende krystaller. </li><li> Tilbered en ml alikvoter av 0,1% agarose-løsning i 1,5 ml reaksjonsrørene. De alikvoter kan lagres ved 4 ° C. </li><li> Bruk 1,5% oppløsning for å belegge en plastpetriskål. Tykkelsen av agarose lag bør være ca. 2 mm. Etter agarose er størknet, tilsett E3 medium på toppen av laget for å hindre at den tørker. Den belagte fatet kan lagres ved 4 ° C. </li></ol></li><li> Utarbeidelse av sebrafisk <ol><li> Hold Sebrafisk (Danio rerio) voksne og embryoer ved 28,5 ° C og håndtere dem i henhold til de etablerte protokoller 11,12. </li><li> Sett opp mannlige og kvinnelige fisk i ettermiddag og skille dem ved hjelp av en skillevegg. Fjern skillet følgende morgen for å ta tiden på parring av fisken. </li><li> Samle embryoene i en skål fylt med E3 og undersøke dem ved hjelp av en stereomikroskop. </li><li> På 24 HPF (eller utviklingsstadiet av interesse), velg sebrafisk embryo for fluorescens uttrykk og overføre de positive til en ny rett med fersk E3. </li><li> Nøye dechorionate embryoene ved hjelp av to skarpe tang (Tall 2D og 2E). Bruk første pinsett til å fange og holde chorion og de ​​andre pinsett til å rive det åpne og trekke den av Note 1:. Utfør dette trinnet ved hjelp av en stereomikroskop. </li></ol></li></ol> 2. Multilayer Montering <ol><li> Belegg FEP tube <ol><li> Fest en butt ende kanyle til en sprøyte. Sett kanylen omhyggelig i omtrent 3 mm i en ende av et renset og skåret stykke. FEP tube (Tall 2F og 2G) Note 1: Bruk hansker og unngå å bøye eller klemme på røret. </li><li> Dypp den frie ende av FEP røret i 3% metylcellulose og fylle røret med løsningen. </li><li> Langsomt frigjøre methylcellulose ved å skyve på sprøyten. Oppløsningen kasseres. </li><li> Gjenta trinn 2.1.2 og 2.1.3 hjelp E3 Note 1:. De belagte rør må brukes for montering umiddelbart. </li></ol></li><li> Overføre sebrafisk til agarose <ol><li> Varm opp en aliquot på 0,1% agarose i 70 ° C i en varmeblokk. Vortex kort reaksjonsrøret og overføre den til en varmeblokk er satt til 38 ° C (figur 2H). </li><li> Ta reaksjonsrøret ut fra varmeblokk og la den kjøle seg ned en kort stund. Legg Tricaine til en endelig konsentrasjon på 133-200 mg / l og vortex igjen (fig. 2i). </li><li> Velg ett av de dechorionated sebrafisk embryo og overfør. r det til reaksjonsrøret med forvarmet 0,1% agarose ved hjelp av en glass Pasteur-pipette (figurene 2J og 2K) Note 1: Forsøk for å overføre så lite ekstra E3 som mulig. </li></ol></li><li> Montering av sebrafisk <ol><li> Ta opp embryoet med sprøyte-festet FEP tube (Figur 2L). . Røret fylles helt med 0,1% agarose med embryoet plassert nær hver ende av røret, og med hodet pekende mot åpningen av røret Note 1: Kontroller for å ta opp noen agarose lot seg fisken. Merknad 2: Trekk svært forsiktig på sprøyten for å unngå bobler Note 3:. Hold røret i en horisontal orientering for å unngå lekkasje av sitt innhold (Tall 2M og 2N). </li></ol></li><li> Plugging røret <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. Multilayer montering for sebrafisk embryo. A) Fluor Ethylene Propylene (FEP) rør på en kabeltrommel før tilberedning. B) en sprøyte med en butt ende kanyle festet. C) En renset og kuttet FEP tube. D, E) Dechorionation av 24 HPF sebrafisk embryoer. F) Festing av røret til den butte ende kanyle. G) Den sprøyte med kanyle og røret er festet. H) En alikvot på 0,1% agarose i et reaksjonsrør ved overføring av den i en varmeblokk. I) virvling av smeltet agarose. J) Opptak av en dechorionated embryo ved hjelp av et glass pipette. K) Overføring av embryoet inn i smeltet agarose. L) Inntak av embryoet med omkring agarose inn i FEP tube. M, N) Den sebrafisk embryo inne i FEP tube . <strong&gt; O) Skjære røret mellom prøven og kanyle. P) Plugging røret ved anvendelse av en agarose-overtrukket fatet. Q) Et ​​embryo på innsiden av røret plugges. R) Den endelige prøvepreparering i en metallholder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">klikk her se større bilde.</a> <ol><li> Bruk et barberblad for å kutte røret av kanylen (Figur 2o). </li><li> Sakte feste enden av røret som inneholder fisken gjennom hele lag med 1,5% agarose i plast fatet for å plugge røret (figur 2P) Note 1:. Unngå dannelsen av bobler og prøve å oppnå en rett pluggflate ved å holde . tube nøyaktig vinkelrett på agarose overflaten Merknad 2: Roter røret litt for å få en fin plugg. </li><li> Hold montert prøven i et 1,5 ml reaksjonsrøret med E3 for å unngå tørking. Prøven er now klar til å bli avbildet. Før bildebehandling, sjekk om fisken sitter rett på toppen av pluggen (Tall 2Q og 2R). Sørge for å også legge Tricaine til mediet inne i avbildningskammeret ved samme konsentrasjon som i monteringsmedium. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy.">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li><li>Swoger, J., Muzzopappa, M., L&#243;pez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies.">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology.">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy.">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb. Prot. 2010 (5), (2010).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy.">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Jin, S. -. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -. N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li><li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+histone+variant+H2A.F/Z+and+a+transgenic+H2A.F/Z:GFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development.">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Avanserte mikroskopi teknikker som lys ark mikros gjør oss i stand til å ta opp bildedata med høy tidsmessig og romlig oppløsning i løpet av flere dager, men krever også prøvemonterings teknikker for å forbedre. Vi presenterer en detaljert protokoll for flerlags montering for lys ark mikroskopi av sebrafisk utvikling. Metoden er enkel å implementere og vi bruker den i vår lab på en daglig basis. FEP-rør Viktige deler av vår monterings strategi er rør laget av polymer Fluor Ethylene Propylene (FEP). Vi besluttet å bruke FEP hovedsakelig på grunn av dets brytningsindeks på 1,338, som er lik for vann og derfor velegnede for lys mikros arket med vann for-å dyppe mål og prøven som krever vandige medier. De rør med 0,8 mm indre diameter og 0,4 mm veggtykkelse at den passer til å utvikle sebrafisk meget godt, kan brukes sammen med typiske eksempler på holdere som passer for 1,6 mmkapillærer og er vårt førstevalg for den presenterte monteringsmetode. Vi testet dem grundig i våre hjemmebygde oppsett så vel som i det kommersielle systemet &quot;Lightsheet Z.1&quot; av Carl Zeiss Mikros og fant at FEP rør tilby langsiktig stabilitet, har bare minimal innvirkning på optisk ytelse og er nonfluorescent 10. De er imidlertid ikke egnet for anvendelser med prøver som krever en annen brytningsindeks, f. eks erte prøven. Rør samt folier laget av FEP er tilgjengelige i et utvalg av diametre og tykkelser. I tillegg kan FEP bli smeltet ved 260 ° C og gir dermed nesten uendelige muligheter for skreddersydde sample monterings støtter. De polymer rør tendens til å bli levert steril, noe som er grunnen til rengjøring protokollen inneholder flere tiltak for å sikre beste optiske kvaliteten. Belegget med methylcellulose sikrer at ingen del av den voksende sebrafisk embryo fester seg til polymeren. Avgjørelsen for 0,1% agarose er basert på omfattende tester av vekst og immobilitet i ulike konsentrasjoner av agarose og metylcellulose 10. Agarose konsentrasjoner over 0,1% allerede viste en alvorlig innvirkning på vekst på 24 HPF sebrafisk. I tillegg bruker vi lave doser av bedøvelse narkotika Tricaine. Tricaine blokker aksjonspotensialer, hemmer dermed signaloverføringen mellom hjernen og musklene og undertrykker muskelsammentrekninger 16. En konsentrasjon av 133-200 mg / L sikrer tilstrekkelig immobilisering av sebrafisk mellom 24-72 HPF. Men Tricaine og andre bedøvelse narkotika vi testet showet doseavhengig bivirkninger som hjerteødem. I tillegg har den nødvendige dose av Tricaine varierer med utviklingsstadiet av embryoet. Vi anbefaler derfor å redusere Tricaine konsentrasjon til det beløpet som trengs for utviklingsstadier som er fotografert. For å sikre best mulig performance og hindre dannelsen av giftige biprodukter, bør nylaget eller tinet Tricaine stamløsning anvendes, beskyttet mot lys, og ikke oppvarmet over 30 ° C. Den innebygging i FEP-rør gir også mulighet for enkel modifisering av monteringsmedium å ta hensyn til spesielle behov. For time-lapse avbildning av hjertet, anbefaler vi å bruke 3% methylcellulose og 100 mg / L Tricaine i stedet for 0,1% agarose og 200 mg / L for montering. Metylcellulose er mer viskøs enn 0,1% agarose og dermed gi høyere ubevegelighet av seg selv og mindre Tricaine må brukes for å sikre innesperring av embryoet. Tricaine er følsomt for temperaturer over 30 ° C, og kan også være fortynnet med mediet i avbildningskammeret, noe som fører til redusert ytelse og mulig rykning av embryoet. Derfor, sørg for å bruke Tricaine også i bilde medium der den montert prøven er nedsenket. Hvis eksperimentene krever bruk av høyeretemperaturer, anbefales det å bytte ut medium i avbildningskammeret enten kontinuerlig ved hjelp av en perfusjon system eller manuelt med et rør, og en sprøyte mellom to tids-punkter. Kritiske trinn De kritiske trinn under prosessen med prøven festet er inntaket av prøven inn i røret, og innsetting av den agarose pluggen. Inntaket definerer utgangsstilling av embryo, noe som er tungvint å bytte etterpå. Flere prøver skal være tilgjengelig for å montere og bør overvåkes monterings kvalitet med en stereomikroskop. Hvis prøven orientering er ikke tilfredsstillende, kan endre hastigheten på å utarbeide prøven og unngå senere bevegelser av stempelet hjelpe da dette ofte vrir embryoet. Den 1,5% agarose pluggen er nødvendig for å unngå lekkasje av 0,1% agarose. Overflaten av pluggen inne i røret må være flat for å ikke påvirke prøven orientering under utvikling. For å oppnå en god surfess, forskjellige tykkelser av de agarose lag må bli testet, og røret må bli satt inn i agarose normal til overflaten. Roterende røret litt og trekke ut røret utgivelser nøye pluggen fra fatet. Kvaliteten på montering bør kontrolleres med et stereomikroskop før avbildning. Multiview bildebehandling En stor fordel med lys ark mikroskopi er Multi bildebehandling, evnen til å rotere prøven, erverve z-stabler fra flere vinkler, og deretter registrere seg og smelte dem. En etablert metode for å registrere z-stabler i 3D-rom er perle-basert registrering ved hjelp av fluoriserende perler rundt prøven som tillits markører 17. Denne metoden er avhengig men på en solid monteringsmedium for eksempel 1,5% agarose og dermed synes å være uforenlig med flerlags montering presenteres her. Men flere alternative løsninger fungerer, avhengig av programmet. Først, de fluoriserende perler kanskal innlemmes i agarose plugg, som må være i synsfeltet under overtakelsen. For det andre kan de sceneplassering kalibreres før den faktiske eksperimenter ved hjelp av en 1,5% agarose kolonne med fluoriserende perler. For det tredje, kan alternative markører slik som fluorescerende kjerner brukes til å identifisere posisjonen til z-stablene i forhold til hverandre. Fordampning Typiske lett ark mikros oppsett bruke en åpen prøvekammeret, som uunngåelig fører til fordampning av mediet. Siden mediet er viktig for overlevelsen av prøven, for å begrense fordamping av monteringsmedium og for den korrekte brytningsindeks mellom optikk og prøven, anbefales det å utføre et eller flere av de følgende tiltak for å hindre fordampning. For det første kan mediet i kammeret bli kontinuerlig utvekslet med en perfusjons-system. For det andre, kan mediet være manuelt etterfylt. For det tredje, kan kammeret være dekket med et lokk eller en fleksibel folie. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; oksygentilførsel Polymeren FEP ble utviklet for å tåle et stort utvalg av kjemikalier og er derfor robust, er kjemisk inert og nonpermeable til gass. I tilfelle av flerlagsmonterings oksygen kan bare trenge gjennom agarose pluggen og agarose-luft-grenseflaten, men det gjenstår å bli vist hvis oksygentilførselen i flerlags montering er sterkt lavere i forhold til montering i 1,5% agarose, uten støtte polymerrøret. Men som montering i 1,5% agarose kan bare brukes i omtrent to timer før sebrafisk morfologi påvirkes flerlags montering synes å være den samlede overlegen løsning for langvarig avbildning. Imaging tidligere utviklingsstadier Multilayer montering har nå blitt vår standard embedding teknikk for time-lapse lys ark mikroskopi av sebrafisk eldre enn 24 HPF. Bortsett fra det, vi også bruke polymer rør for avbildning av tidligere stadium embryoer. Det embryos forbli i sine chorions og er montert i en FEP-rør med en indre diameter på 1 mm og fylt med E3. Sebrafisk kan fritt utvikle inne i chorion og kan fortsatt bli fotografert godt med lys ark mikroskopi. Outlook Den presenterte flerlags prøvemontering slipper løs det fulle potensialet av lys ark mikroskopi for sanntidsutviklingsbiologi med sebrafisk. Det kan lett bli vedtatt for andre mikroskopi teknikker som optisk projeksjon tomografi (OPT) og andre organismer. Vi tror at standard-sized FEP-rør er bare de første skritt mot prøvemonterings teknikker skreddersydd for spesifikke behov.

For å forstå de komplekse hendelser og interaksjoner under embryogenese, er forskning i utviklingsbiologi mer og mer å flytte fra mikroskopi av enkeltceller og organer til in vivo avbildning av hele organismer. Tradisjonelle mikroskopi teknikker vanligvis ikke klarer å tilby den romlig og tidsmessig oppløsning til å følge raske hendelser over en lengre periode, og ofte føre til bleking eller fototoksiske effekter i utvalget en. Vi og andre funnet lette ark mikroskopi (figur 1) til å være en ideell teknikk for in vivo avbildning av sebrafisk 2-4. Belysningen av prøven med et tynt ark av laserlys, ortogonalt i forhold til deteksjonsaksen, og har fast optisk snitting med høy romlig oppløsning og minimale bilde-5 toksisitet. På samme tid, på grunn av denne unike optiske arrangement, tradisjonelle eksempelmonteringsteknikker ved hjelp av petriskåler eller kulturkamre er ikke egnet. I en typisk lettark mikroskop tre translasjonelle motorer og en rotasjonsmotor holde prøven, slik at det kan bli nøyaktig plassert, vendte og betraktes fra alle retninger. I de siste prøvene for lys ark mikroskopi har ofte vært forankret i 1-2% agarose inne i et glass kapillær 6,7. I dette tilfelle ble den størknede agarose sylinder med de innleirede prøven ekstruderes ut av glasskapillært inn i prøvekammeret fylt med vannlignende medium for avbildning. Agarose har en brytningsindeks i nærheten av vann, og er derfor godt egnet for in vivo lett ark mikroskopi som muliggjør vann korrigert belysning-og deteksjonsoptikken. Prøven innesperret i den stive agarose og kan avbildes godt for en kort periode, men morfogenetiske forandringer og vekst av embryoet blir sterkt svekket når avbildning i flere timer 7,8. Selv om løsninger for andre applikasjoner har blitt utviklet ni, den ikke-invasiv langsiktig time-lapse sebrafisk<html> avbildning potensial av lys mikros arket kan ikke utnyttes ved hjelp av den konvensjonelle 1,5% agarose innebygging. Vi har derfor utviklet en ny montering strategi for in vivo lys ark mikroskopi av sebrafisk embryo 10. Prøven er montert i 0,1% agarose med 200 mg / L Tricaine inne i et rør laget av optisk klar polymer fluorert etylenpropylen (FEP). Den innebygde embryoet utvikles normalt på grunn av lav viskositet av mediet. På samme tid, begrenser den FEP røret mediet og prøven for varigheten av eksperimentet. Her gir vi en detaljert protokoll av den nye monteringsteknikk og presentere data som gjenspeiler dens fordeler fremfor den konvensjonelle protokollen. Vi viser at med vår metode sebrafisk utvikling kan være kontinuerlig avbildes med høy romlig og tidsmessig oppløsning over en periode på mer enn to dager. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Prinsippet for lys ark mikroskopi. A sebrafisk montert i et rør laget av Fluor etylenpropylen (FEP) kan oversettes og roteres gjennom midtplanet av målet deteksjon. Et tynt ark av laserlys (lys sheet) anslås ved belysning av målet til fokalplanet for det formål deteksjon og lyser bare en tynn optisk seksjon av prøven. Den emitterte fluorescens-signalet blir oppsamlet ved målet deteksjon og tatt opp på en kamerabrikke.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

Lett ark mikroskopi er det ideelle avbildningsteknikk å studere sebrafisk embryoutvikling. På grunn av minimal fototoksisitet og bleking, er det spesielt egnet for langsiktig time-lapse bildebehandling over mange timer opp til flere dager. Imidlertid er en egnet prøvemontering strategi trengs som tilbyr både innesperring og normal utvikling av prøven. Multilayer montering, en ny embedding teknikk med lav konsentrasjon agarose i optisk klare rør, overvinner nå denne begrensningen, og slipper løs det fulle potensialet av lys ark mikroskopi for sanntids utviklingsbiologi.

Multiday Imaging av sebrafisk vasculature Development Vi bruker en dpf Tg (kdrl: GFP) 13 sebrafisk for å demonstrere fordelene med flerlags monterings strategi for langsiktig lys sheet mikroskopi. Det tas sikte på å avbilde utviklingen av blodkar i hele sebrafisk over en periode på 2 dager. Den sebrafisk embryo ble montert i 0,1% agarose i en metylcellulose belagte polymerrøret. Her er sebrafisk ikke er begrenset av monteringsmedium og kan utvikle seg normalt. Dens hode hever, halen strekker og vaskulær spirende vises uhindret (figur 3). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figur 3. Multiday avbildning av sebrafisk blodkar utvikling. Blodkar i en mulyer montert en dpf Tg (kdrl: GFP) 13 sebrafisk utvikler uhindret i en lys ark mikroskop i løpet av to dager. En 488 nm laserlys ark begeistret fluorescens og signalet ble oppdaget ved hjelp av 10X/0.3 W objektiv og en EMCCD kamera. Z-stabler ble kjøpt på fire tilstøtende posisjoner hvert 10 min og deretter sydd med Fiji 15. Maksimal intensitet projeksjoner av en undergruppe av tidspunkter vises. Målestokk:. 500 mikrometer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> Imaging av Early sebrafisk embryogenese Her viser vi evnen til FEP rør som monteringsstøtte for lys ark mikroskopi av tidlig sebrafisk embryogenese under den første dagen etter befruktning. Den 8 HPF Tg (H2A: GFP) 14 sebrafisk embryo ble montert med sin intakt chorion inne en E3-fylt røret med en inner diameter på 1 mm. Dette resulterer i en svak klemming av chorion. Alle utviklingsprosesser under embryogenesis er upåvirket av montering, og kan være optimalt visualisert ved hjelp av lys ark mikroskopi. I dette eksempelet har vi fotografert prøven over en periode på 12 timer (figur 4). Typiske formendringer i tidlig embryogenese, slik som økende forlengelse av eggeplomme og fortykkelse av vev langs midtlinjen, vil bli undertrykt ved bruk av tradisjonell montering uten chorion i 1,5% agarose. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figur 4 Imaging av tidlig sebrafisk embryogenese En Tg (H2A: GFP). 14 sebrafisk passerer gjennom tidlig embryogenesis. En 488 nm laserlys ark spent GFP og fluorescens signalet ble oppdagetmed en 10X/0.3 W objektiv og en EMCCD kamera. Z-stabler fra to vinkler ble kjøpt hver 3 min over en periode på 12 timer. Normalisert maksimal intensitet projeksjoner av en undergruppe av time-lapse vises. Synlig motion blur på 19 HPF resultater fra embryo rykninger under oppkjøpet, som ingen bedøvelse ble brukt. Målestokk:. 150 mikrometer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish at JoVE.com

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Utviklingen av sebrafisk kan følges over dager med lys ark mikros når embryo er innebygd i optisk klare polymer rør med lav konsentrasjon agarose.

Multilayer Montering for Long-term Lett Sheet Mikroskopi av Sebrafisk

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsiktig Dødelig toksisitet Test med krepsdyret Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Sette opp et enkelt Lett Sheet mikroskop for<em&gt; I Toto</em&gt; Imaging av<em&gt; C. elegans</em&gt; Utvikling

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonal Sporing av Hematopoetiske Stem og stamceller Preget av fem Fluorescent Proteiner bruker Confocal og multiphoton Mikros

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Lys Sheet Fluorescensmikroskopi av planterøttene vokser på overflaten av en Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

LarvaSPA, en metode for montering drosophila larve for langsiktig time-lapse imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...