Name: multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish at JoVE.com

Мы благодарим Общества Макса Планка, программы по населенным Frontier Science (HFSP) и Boehringer Ingelheim Fonds для финансирования и поддержки.

1. Подготовка материала <ol><li> Подготовка FEP труб <ol><li> Очистите FEP трубки (рис. 2а) с помощью промывки жидкостями (в шагах, оговоренных ниже) через трубку и с помощью шприца, прикрепленный с тупым концом канюли (рис. 2В) Примечание 1:.. Используйте перчатки на протяжении всей процедуры Примечание 2: Мы рекомендуем резки трубки на куски ок. 1 м в длину и очистки тех, параллельно. <ol><li> Впервые промойте трубку с 1М NaOH неоднократно. Затем передать трубку к 50 мл центрифужную пробирку, заполненную 0,5 М NaOH и ultrasonicate его в течение 10 мин. </li><li> Перенести полимерную трубку, чтобы малого таза с DDH 2 O. Промойте трубку сначала с DDH 2 O, а затем с 70% этанола. </li><li> Впоследствии передачи FEP трубки в свежую пробирку центрифуги с 70% этанола. Снова ultrasonicate этот центрифужную пробирку в течение 10 мин. </li></ol></li><li> Разрежьте очищенный FEP трубки на кускииз около 3 см (типичная длина для использования в данио монтажа и обработки изображений) и выпрямить их, если это необходимо. Хранить очищенные FEP трубки в свежем 50 мл центрифужную пробирку, наполненную DDH 2 O (рис. 2в). </li></ol></li><li> Подготовка Tricaine исходного раствора <ol><li> Подготовьте 0,4% Tricaine маточного раствора путем растворения 400 мг Tricaine (MS-222) в 97,9 мл DDH 2 O. После того как порошок полностью не растворится, доведения рН до 7,0 с помощью 2,1 мл 1 М Трис (рН 9,0). Защитите решение от света. Храните аликвоты при -20 ° С. </li></ol></li><li> Получение 3% метилцеллюлозы <ol><li> Подготовка 3% растворе метилцеллюлозы для внутреннего покрытия труб FEP, как описано ниже. Нагреть E3 11 в стеклянной бутылке до примерно 60-70 ° С и добавляют соответствующее количество метилцеллюлозы порошка. Добавить мешалки и перемешивали при 4 ° С. Как только раствор охлаждают до температуры ниже 30 ° С, добавляют раствор Tricaine до конечного Concentration 100 мг / л Хранить перемешивании при 4 ° С в течение ночи. </li></ol></li><li> Приготовление 1,5% и 0,1% агарозы в Е3 <ol><li> Растворить соответствующее количество низкой температурой плавления агарозы порошка в определенном объеме E3 в стеклянную колбу. Нагрейте смесь в микроволновой печи и встряхните его раз в то время, пока раствор агарозы не выглядит гомогенной, без каких-либо оставшихся кристаллов. </li><li> Подготовка 1 мл аликвоты 0,1%-ного раствора агарозы в 1,5 мл реакционных труб. Аликвоты можно хранить при температуре 4 ° С. </li><li> Используйте 1,5% раствор, чтобы покрыть пластик чашку Петри. Толщина агарозном слоя должна быть прим. 2 мм. После агарозном затвердевает, добавьте E3 среды в верхней части слоя, чтобы предотвратить его сушки. Блюдо покрытием можно хранить при температуре 4 ° C. </li></ol></li><li> Подготовка рыбок данио <ol><li> Держите рыбок данио (Danio рерио) взрослых и эмбрионов на 28,5 ° С и обрабатывать их в соответствии с установленными протоколами 11,12. </li><li> Настройка мужского и женского рыбу во второй половине дня и отделить их помощью делителя. Снимите делитель на следующее утро ко времени спаривания рыбы. </li><li> Сбор эмбрионов в блюдо, заполнены с E3 и изучить их с помощью стереомикроскопа. </li><li> В 24 часов после оплодотворения (или стадии развития Вашей заинтересованности), выбрать данио эмбриона для выражения флуоресценции и передавать позитивные для нового блюда со свежими E3. </li><li> Тщательно dechorionate эмбрионов с помощью двух острых щипцов (рис. 2D и 2E). Используйте первые щипцы, чтобы захватить и удерживать хориона, а второй пинцет, чтобы разорвать его открытым и снять ее Примечание 1:. Выполните этот шаг с помощью стереомикроскопа. </li></ol></li></ol> 2. Многослойные монтажа <ol><li> Покрытие FEP трубки <ol><li> Присоединить тупым концом канюли шприца. Вставьте канюлю тщательно в течение приблизительно 3 мм в один конец очищены и сократить кусок. FEP трубки (рис. 2F и 2G) Примечание 1: Используйте перчатки и избегать любого изгиба или сдавливание трубы. </li><li> Опустите свободный конец FEP трубки в 3% метилцеллюлозы и заполнить трубу с решением. </li><li> Медленно освободить метилцеллюлозу, нажав на шприц. Отменить решение. </li><li> Повторите шаги 2.1.2 и 2.1.3 с помощью E3 Примечание 1:. Трубы с покрытием должны быть использованы для монтажа сразу. </li></ol></li><li> Перенос данио, чтобы агарозы <ol><li> Нагреть одну аликвоту 0,1% агарозы до 70 ° С в нагревательный блок. Vortex кратко реакционную трубку и перенести его на нагревательный блок установлен в 38 ° C (Рисунок 2H). </li><li> Возьмите реакционную трубку из теплового блока и дайте ему остыть кратко. Добавить Tricaine в конечной концентрации 133-200 мг / л и снова вихря (рис. 2i). </li><li> Выберите один из dechorionated эмбрионов данио рерио и transfe. т его в реакционную трубу с предварительно нагретым 0,1% агарозы с использованием стекло пипетки Пастера (цифры 2J и 2К) Примечание 1: Попытка передать как можно меньше дополнительного E3, насколько это возможно. </li></ol></li><li> Монтаж данио <ol><li> Возьмите эмбрион с шприца подключением FEP трубки (рис. 2 л). . Труба должна быть заполнена полностью с 0,1% агарозы, с эмбриона, расположенной рядом с обоих концов трубы и с головой, указывая в направлении отверстия трубки Примечание 1: Убедитесь, что взяли некоторую агарозы до вступления в рыбу. Примечание 2: Потяните очень мягко по шприцу, чтобы избежать пузырей Примечание 3:. Держите трубку в горизонтальной ориентации, чтобы избежать утечки ее содержимого (рис. 2М и 2N). </li></ol></li><li> Подключение трубки <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"Первоначально &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Рисунок 2. Многослойные крепление для эмбрионов рыбок данио.) Фторированная этилен-пропилен (FEP) труб на кабельным барабаном перед приготовлением. B) шприц с тупым концом канюли прилагается. C) очистить и нарезать FEP трубки. D, Е) Dechorionation 24 часов после оплодотворения данио эмбрионов. F) Присоединение трубки к тупым концом канюли. G) шприц с канюлей и трубкой, прикрепленной. H) Аликвоту 0,1% агарозном внутри реакционной трубки в то время как передача его тепловой блока. I) вортексе из расплавленного агарозы. J) Поглощение в dechorionated эмбриона с помощью стеклянной пипетки. K) Передача эмбриона в расплавленный агарозы. л) потребление эмбриона с прилегающими агарозы в FEP трубки. M, N) Данио эмбрион внутри FEP трубки . <stroнг&gt; O) Cutting трубку между образца и канюли. Р) Подключение трубки с использованием агарозном покрытием блюдо. Q) Эмбрион внутри подключен трубки. R) Окончательный пробоподготовки в металлическом держателе. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a> <ol><li> Используйте лезвие, чтобы разрезать трубу от канюли (рис. 2O). </li><li> Медленно придерживаться конец трубки, содержащей рыбу через весь слой 1,5% агарозы в пластиковую чашку, чтобы включить трубку (рис. 2P) Примечание 1:. Избегайте образования пузырьков и попытаться получить прямой поверхности разъем, удерживая . трубки точно перпендикулярно агарозном поверхности Примечание 2: Поверните трубку слегка, чтобы получить хороший вилку. </li><li> Хранить смонтированные образец в 1,5 мл реакционной трубки с E3, чтобы избежать высыхания. Выборка нOW готов для включения в образ. Перед изображений, проверить, является ли рыба сидит прямо на верхней части плунжера (Цифры 2Q и 2R). Убедитесь, что также добавить Tricaine к среде внутри камеры формирования изображения в той же концентрации, что и в монтажной среды. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy.">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li><li>Swoger, J., Muzzopappa, M., L&#243;pez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies.">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology.">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy.">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb. Prot. 2010 (5), (2010).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy.">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Jin, S. -. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -. N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li><li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+histone+variant+H2A.F/Z+and+a+transgenic+H2A.F/Z:GFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development.">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Расширенный методы микроскопии, такие как легкие листовые микроскопии позволяют записывать данные изображения с высоким временным и пространственным разрешением в течение нескольких дней, но и требуют образцы монтажных методами повышения. Мы представляем подробный протокол многослойных монтажа для легкой листовой микроскопии данио развития. Метод прост в реализации, и мы используем его в нашей лаборатории на ежедневной основе. Трубки FEP Ключевые компоненты нашей стратегии по монтажу является трубки из полимерного Фторсодержащая этилен-пропилен (FEP). Мы решили использовать FEP первую очередь из-за его преломления 1,338, который похож на воду и, следовательно, идеально подходит для легкой листовой микроскопии с водой для окунания целей и образца, требующих водной среде. Пробирки с 0,8 мм и внутренним диаметром 0,4 мм толщиной стенки соответствовать развивающийся данио очень хорошо, может быть использован с типичными держателей образцов, пригодных для 1,6 ммкапилляры и являются нашим первым выбором для представленной способ монтажа. Мы протестировали их полностью в наших самодельных установок, а также в коммерческой системы &quot;Lightsheet Z.1&quot; Карл Цейсс микроскопии и обнаружили, что FEP трубки предложить долгосрочную стабильность, есть только минимальное влияние на оптические характеристики и нефлуоресцентный 10. Они, однако, не подходит для приложений с образцами, которые требуют другой показатель преломления, например очищенную образца. Трубы, а также пленки из FEP доступны в различных диаметров и толщин. Кроме того, ФЭП можно расплавить при 260 ° С и таким образом предлагает практически безграничные возможности для заказных образцов монтажных опорах. Полимерные трубы, как правило, поставляется нестерильного, поэтому протокол очистки включает в себя несколько шагов, чтобы обеспечить наилучшую оптическое качество. Покрытие с метилцеллюлозы гарантирует, что ни одна часть растущей эмбрионов рыбок данио не прилипает к полимеру. Решение для 0,1% агарозы основана на обширных испытаний скорости роста и неподвижности в различных концентрациях агарозы и метилцеллюлоза 10. Агарозные концентрации выше 0,1% уже показали серьезное влияние на темпы роста 24 HPF рыбок данио. Кроме того мы используем низкие дозы обезболивающего препарата Tricaine. Потенциалы Tricaine блоки действий, тем самым тормозит передачу сигнала между мозгом и мышцами и подавляет мышечных сокращений 16. Концентрация 133-200 мг / л обеспечивает достаточную иммобилизацию рыбок данио между 24-72 часов после оплодотворения. Тем не менее, Tricaine и другие обезболивающие препараты мы тестировали шоу дозы зависит побочные эффекты, такие как отек сердечной. Кроме того требуется доза Tricaine меняется в зависимости от стадии развития эмбриона. Поэтому мы рекомендуем снижения концентрации Tricaine в количестве, необходимом для стадии развития, которые изображаются. Для обеспечения наилучшего езультатысе и предотвратить образование токсичных побочных продуктов, свежеприготовленный или размораживать раствор Tricaine следует использовать, защищенном от света месте, а не нагревается выше 30 ° С. Вложение в FEP труб также позволяет легко модификации монтажную среду для учета конкретных потребностей. Для покадровой визуализации сердца, мы рекомендуем использовать 3% метилцеллюлозы и 100 мг / л Tricaine вместо 0,1% агарозы и 200 мг / л для монтажа. Метилцеллюлозы является более вязкой, чем 0,1% агарозном обеспечивая тем самым более высокую неподвижность по себе и менее Tricaine необходимо использовать для обеспечения удержание эмбриона. Tricaine чувствительна к температуре выше 30 ° С, а также может быть разбавлен среды в камере формирования изображения, что приводит к снижению производительности и, возможно, подергивание эмбриона. Поэтому убедитесь, что используете Tricaine также в среде визуализации, в котором установлен образец погружен. Если ваши эксперименты требуют использования болееТемпературы, мы рекомендуем обмена среды в камере изображений или постоянно с помощью системы перфузии или вручную с помощью трубки и шприца между двумя временных точках. Критические шаги Критические шаги в процессе монтажа образца являются потребление образца в пробирку и вставка из агарозного вилки. Потребление определяет начальное положение эмбриона, который является громоздким, чтобы изменить впоследствии. Несколько образцов должны быть доступны для установки и монтажа качества должны быть проверены с помощью стереомикроскопа. Если ориентация образец не является удовлетворительным, изменяя скорость составления образца и избежать последующих движений поршня может помочь, так как это часто крутит эмбрион. 1,5% агарозном плагин необходимо, чтобы избежать утечки 0,1% агарозы. Поверхность плунжера внутри трубки должна быть плоской, чтобы не влиять на ориентацию образца в процессе разработки. Для достижения хорошего серфингатуз, разные толщины геле слоев должны быть проверены и трубка должна быть введена в агарозы нормали к поверхности. Поворот трубы немного и вытаскивая трубку тщательно релизы вилку из тарелки. Качество монтажа должны быть проверены с помощью стереомикроскопа до визуализации. Томография Multiview Одно из главных преимуществ легкой листовой микроскопии является MultiView изображений, возможность поворота образца, приобрести Z-стеки с разных углов, а затем зарегистрироваться и слить их. Создан метод для регистрации Z-стеки в 3D-пространстве является шарик на основе регистрации с помощью флуоресцентных бусы окружающие образец в тайне маркеров 17. Этот метод, однако, опирается на твердой монтажной среде, такой как 1,5% агарозы и, таким образом, кажется, несовместимые с многослойной монтажа представлены здесь. Но несколько альтернативных решения работают в зависимости от приложения. Во-первых, люминесцентные бусины можнобыть включены в агарозном штекера, который должен быть в поле зрения во время сбора. Во-вторых, этап позиции может быть откалиброван до фактических экспериментов с использованием 1,5% колонку агарозы с люминесцентными бисером. В-третьих, альтернативные маркеры, такие как люминесцентные ядер может быть использован для идентификации положение Z-стеки относительно друг друга. Испарение Типичные установок свет лист микроскопия использовать открытое образец камеры, что неизбежные приводит к испарению среды. Поскольку среда имеет важное значение для выживания образца, чтобы ограничить испарение монтажную среду и для правильного преломления между оптикой и образца, мы рекомендуем принимать одно или несколько из следующих мер по предотвращению испарения. Во-первых, среда в камере может быть постоянно обмениваются с помощью системы перфузии. Во-вторых, среда может быть пополнен вручную. В-третьих, камера может быть покрыта крышкой или гибкой фольги. <pкласс = &quot;jove_step&quot;&gt; Подача кислорода Полимер ФЭП был разработан, чтобы выдерживать большое разнообразие химических веществ и, следовательно, надежные, химически инертны и nonpermeable на газ. В случае многослойной монтажа кислорода могут проникать только через агарозном вилки и интерфейсом агарозы небом, но это еще предстоит в меню, если подача кислорода в многослойных монтажа является строго ниже по сравнению с установки в 1,5% агарозном без поддержки полимерную трубку. Однако, как установки в 1,5% агарозы можно использовать только в течение примерно двух часов, прежде чем данио морфология влияют многослойную монтаж, кажется, в целом превосходное решение для долгосрочного изображений. Визуализация ранних стадиях развития Многослойные монтажа стала наша стандартная техника вложение для покадровой свет листовой микроскопии данио старше 24 оплодотворения. Кроме того, мы также используем полимерные трубы для визуализации ранних эмбрионов на стадии. Еmbryos остаются на своих хорионов и установлены в FEP трубки с внутренним диаметром 1 мм и заполненный E3. Данио могут свободно развиваться внутри хориона и все еще может быть отображены также с помощью светового листа микроскопии. Прогноз Представленный образец многослойного монтажа раскрывает весь потенциал света листового микроскопии в режиме реального времени биологии развития с данио. Она может быть легко приняты для других методов микроскопии, такие как оптической проекционной томографии (OPT) и других организмов. Мы считаем, что стандартные размера FEP трубки лишь первые шаги на пути к выборочных монтажных методов с учетом конкретных потребностей.

Чтобы понять сложные события и взаимодействия во время эмбриогенеза, исследования в биологии развития все больше и больше переходят от микроскопии отдельных клеток и органов, чтобы в естественных изображений целых организмов. Традиционные методы микроскопии, как правило, не могут предложить пространственное и временное разрешение, чтобы следовать быстрые события в течение длительного периода времени, и часто вызывают обесцвечивание или фототоксические эффекты в образце 1. Мы и другие обнаружили, свет лист микроскопии (рис. 1), чтобы быть идеальным методом для в естественных изображений рыбок данио 2-4. Облучение образца с тонким листом лазерного света, ортогональную к оси обнаружения, обеспечивает быструю оптического секционирования с высоким пространственным разрешением, а также свести к минимуму фото-5 токсичности. В то же время, в связи с этой уникальной оптической схеме, традиционные методы монтажа примера с использованием чашки Петри или культуры камеры не подходят. В типичной светалист микроскопа три поступательные двигатели и вращения двигателя держать образец, таким образом, что он может быть точно позиционирован, повернулся и смотреть с любого направления. В последние образцов для легкой листовой микроскопии часто вкладывается в 1-2% агарозном внутри стеклянного капилляра 6,7. В этом случае затвердевший агарозном цилиндр с встроенными образца экструдируют из стеклянного капилляра в отборную камеру, заполненную водой как средство для визуализации. Агарозном имеет показатель преломления, близкий к воде и, следовательно, идеально подходит для света в естественных листа микроскопии, что облегчает воды с коррекцией подсветки и обнаружения оптики. Образец заключен в жесткую агарозы и могут быть отображены также в течение короткого периода времени, но морфогенетические изменения и рост эмбриона сильно ухудшается при визуализации в течение нескольких часов 7,8. Хотя решения для других приложений были разработаны 9, неинвазивного долгосрочных покадровой рыбок данио<html> изображений потенциал света листового микроскопии не может быть использована с использованием обычного 1,5% агарозном вложение. Поэтому мы разработали новую стратегию по монтажу в естественных света листового микроскопии эмбрионов рыбок данио 10. Образец устанавливают в 0,1% агарозном с 200 мг / л Tricaine внутри трубы, изготовленной из оптически прозрачного полимерного фторированный сополимер этилена пропилена (FEP). Встроенный эмбрион развивается нормально из-за низкой вязкости среды. В то же время, FEP трубка ограничивает среду и образец в течение всего срока эксперимента. Здесь мы предоставляем подробный протокол новой техники монтажа и настоящих данных, отражающих его преимущества по сравнению с обычным протоколом. Показано, что с помощью нашего метода развития данио можно непрерывно полученную с высоким пространственным и временным разрешением в течение более двух дней. 5 дюймов &quot;FO: Пребывание&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;Первоначально&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Рисунок 1. Принцип света листового микроскопии. Данио установленный в трубе, изготовленной из фторированного этилен-пропилен (ФЭП) могут быть переведены и вращается с помощью фокальной плоскости объектива обнаружения. Тонкий лист лазерного света (свет лист) проецируется освещения цели в фокальной плоскости объектива обнаружения и освещает только тонкий оптический участок образца. Излучаемый сигнал флуоресценции собирают целью обнаружения и записаны на чипе камеры.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

Свет лист микроскопия является идеальным методом визуализации для изучения данио эмбрионального развития. Благодаря минимальной фото-токсичности и отбеливания, это особенно подходит для долгосрочного покадровой обработки изображений в течение многих часов до нескольких дней. Тем не менее, соответствующая стратегия монтаж образец необходим, который предлагает как удержание и нормальное развитие образца. Многослойные монтажа, новая техника вложение с помощью низкой концентрацией агарозы в оптически прозрачных трубок, теперь преодолевает это ограничение и раскрывает весь потенциал света листового микроскопии в режиме реального времени биологии развития.

Многодневных Визуализация данио рерио сосудистой развития Мы используем 1 DPF Tg (kdrl: GFP) 13 данио, чтобы продемонстрировать преимущества монтажной стратегии многослойной для долгосрочного света листового микроскопии. Целью является изображением развитие сосудистой сети во всей данио за ходом 2 дней. Данио эмбрион был установлен в 0,1%-ном агарозном внутри метилцеллюлозы покрытием полимерной трубы. Здесь, данио не ограничивается монтажной среды и может нормально развиваться. Ее руководитель поднимает хвост простирается и сосудистая прорастания появляется беспрепятственно (рис. 3). <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Рисунок 3. Многодневных визуализация развития данио сосудистой. Сосудистую из многоствольныеЕр установлена ​​1 DPF Tg (kdrl: GFP) 13 данио развивается беспрепятственно в светло-листа микроскопом в течение двух дней. 488 нм лазерный свет лист возбуждении флуоресценции и сигнал был обнаружен с помощью 10X/0.3 Вт цель и EMCCD камеру. Z-стеки были приобретены на четырех соседних положениях каждые 10 минут, а затем скреплены Фиджи 15. Максимальные прогнозы интенсивности подмножества временных точках показаны. Шкала бар:. 500 мкм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a> Визуализация раннего данио рерио эмбриогенеза Здесь мы демонстрируем способность FEP труб в качестве монтажной поддержкой света листового микроскопии начале данио эмбриогенеза в течение первых суток после оплодотворения. 8 оплодотворения Tg (H2A: GFP) 14 данио эмбриона был установлен с неповрежденной хориона внутри E3-заполненной трубе с IДиаметр nner 1 мм. Это приводит к небольшому зажима хориона. Все процессы развития во время эмбриогенеза не вышли из монтажа и может быть оптимально визуализированы с помощью света листового микроскопии. В этом примере мы отображаемого образца в течение курса 12 часов (рис. 4). Типичные изменения формы во время раннего эмбриогенеза, такие как увеличением удлинения желтка и утолщение ткани вдоль средней линии, будут угнетены в режиме обычного монтажа без хориона в 1,5% агарозе. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Рисунок 4 Визуализация начале данио эмбриогенеза Tg (H2A: GFP). 14 данио проходит через раннего эмбриогенеза. Был обнаружен 488 нм лазерный свет лист рады GFP и сигнал флуоресценциис 10X/0.3 W цели и EMCCD камеры. Z-стеки из двух углов были приобретены все 3 мин за ходом 12 часов. Нормированные проекции максимальной интенсивности подмножества покадровой показаны. Видимый размытость изображения на 19 результатов ФВЧ из эмбриона подергивание во время приобретения, а не использовались никакие анестетики. Шкала бар:. 150 мкм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish at JoVE.com

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Развитие рыбок данио может следовать в течение нескольких дней с легкой листовой микроскопии, когда эмбрионы встроенных в оптически прозрачных полимерных труб с низкой концентрации агарозы.

Многослойные Монтаж для долгосрочного Light Sheet микроскопии данио рерио

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Долгосрочные изображений клетках млекопитающих использованием широкого поля микроскопии

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

Применение Светоотверждаемый Стоматологическая смолы Клей для монтажа электродов или Микродиализ зонды в хронических опытах

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Подготовка Drosophila S2 клеток для световой микроскопии

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Настройка простого Light Лист микроскоп для<em&gt; В Тото</em&gt; Визуализация<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Разработка

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Свет лист флуоресцентной микроскопией корней растений, растущих на поверхности геля

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

LarvaSPA, метод для монтажа Drosophila Larva для долгосрочного времени-Lapse изображений

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...