Name: humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00
Duration: 11 min 40 s
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Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Duménil, notamment Silke Silva pour la lecture critique du manuscrit. Le service de chirurgie à l&#39;Hôpital Européen Georges Pompidou (HEGP), le Dr David Maladry. Michael Hivelin et le Dr Patrick Bruneval, département de pathologie à l&#39;HEGP. L&#39;animalerie à PARCC, dirigé par Elizabeth Huc. Ce travail a été soutenu par les organismes de subvention suivants: Marie Curie IEF communion pas. 273223 (KM), ATIP-Avenir Grant de l&#39;INSERM, de l&#39;équipement CODDIM subvention (Région Ile de France), FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) subvention d&#39;équipement, le laboratoire IBEID d&#39;excellence consortium, l&#39;ANR (Agence Nationale pour Recherche la) subvention &quot; Bugs-à-flow &quot;. Les bailleurs de fonds n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

Une. Risques et autorisations <ol><li> Comités d&#39;éthique locaux doivent approuver tous les protocoles d&#39;animaux. Ce protocole a été effectuée conformément aux lignes directrices établies par les réglementations françaises et européennes pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 et 2001-131 et directive européenne 2010/63/UE) et approuvé par le comité d&#39;éthique local Comité d&#39;Ethique en Matière d&#39;Expérimentation Animale, Université Paris Descartes, Paris, France. Non: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Pour la peau humaine, le consentement éclairé du patient a été obtenu et toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives nationales françaises et approuvé par le comité d&#39;éthique local, Comité d&#39;évaluation Ethique de l&#39;INSERM CISR 00003888 00005881 FWA, Opinion Paris, France: 11-048 . </li><li> N. meningitidis est un agent pathogène humain potentiellement dangereux et toutes les précautions nécessaires doivent être prises lors de la manipulation de la organisme. Ces précautions vaccination et travaillant sous du niveau de biosécurité 2 conditions. </li></ol> 2. Greffe de peau <ol><li> Recueillir la peau humaine aussi près que possible du temps de greffage. La majorité de la peau dans ce travail proviennent d&#39;opérations de chirurgie plastique impliquant la région abdominale. D&#39;autres sources, comme le sein, les jambes et même le visage ont été utilisés avec succès. </li><li> Préparer l&#39;échantillon de peau humaine en nettoyant la surface de la peau avec de l&#39;EtOH à 70% et se trouvant à plat sur une surface bien nettoyé, de préférence sous une hotte à flux. </li><li> Trancher 200-400 um tranches du haut de la peau à l&#39;aide d&#39;un dermatome avec une épaisseur prédéfinie. </li><li> Vérifiez les tranches de la peau pour l&#39;intégrité et les couper en 2 cm x 2 cm carrés, puis placer dans du PBS (sans cations bivalents) si la greffe immédiatement ou à 4 ° C dans du DMEM avec 10% de sérum pour le stockage à court terme (3-12 h ). </li><li> Anesthésier 6-8 vieilles souris SCID.bg semaine (environ 20 g) avec la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) InjeDECT IP </li><li> Une fois que les souris sont anesthésiées, vérifiez réponse à la douleur en effectuant une pincée de pointe, une méthode standard pour établir réflexe de douleur. Appliquer le gel pour les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et de se raser le côté gauche de l&#39;animal derrière l&#39;épaule, où la greffe sera placé. Garder au chaud de la souris sur un tapis de chaleur tout au long de la procédure. </li><li> Après préparant la souris pour la chirurgie, nettoyer la zone rasée avec EtOH à 70%. </li><li> Appliquer un anesthésique local topique au site de la greffe (Tronothane) et préparer le site de la greffe en enlevant soigneusement la couche superficielle de la peau de souris avec une paire de ciseaux courbes. Veillez à ne pas perturber le système vasculaire sous-jacente. </li><li> Enlever la peau dans une zone un peu plus petite que la zone de la tranche de la peau humaine. </li><li> Retirer tranche de la peau à partir de PBS (ou DMEM) et placer sur un lit de greffe, d&#39;assurer le côté épidermique vers le haut. Étapes 2.8 à 2.10 doit être effectué aussi rapidement que possible, assurer le lit de la greffe ne se dessèche pas. </li><li> Alignez un coinou le bord et fixer avec de la colle tissulaire. Placez soigneusement le reste de la tranche de la peau sur le lit de greffe, en plaçant de petites quantités de colle sur les bords du tissu. Toujours couper la peau humaine à la taille plutôt que de faire le lit de la greffe plus grande. </li><li> Ne tirez pas la peau trop serré sur le lit de la greffe que la peau de la souris est très flexible. </li><li> Assurez-vous que le greffon est fixé avec de la colle tissulaire à chaque coin. </li><li> Nettoyer la zone avec une solution d&#39;iode. </li><li> Appliquer un pansement avec la zone de coussin sur le greffon. Assurez-vous que le Band-Aid est ferme mais pas serré et que la respiration de l&#39;animal n&#39;est pas affectée. </li><li> Fixer le pansement avec du ruban dressing. </li><li> Laisser l&#39;animal à récupérer sur une surface chaude. </li><li> Une fois réveillé, le retour de l&#39;animal dans sa cage. Les animaux sont logés 2-3 par cage. </li><li> Vérifier régulièrement la souris lors de la récupération des signes de douleur ou de détresse. 10-14 jours après la greffe, enlever le pansement, en faisant attention de ne pas perturber la greffe. Dans notre expérience, la douleur postopératoire est mini-mal. Néanmoins animaux doivent être surveillés tous les jours, en particulier dans les quelques jours qui suivent l&#39;opération. Critères de douleur ou de détresse sont les suivantes. <ul><li> Perte de poids de plus de 10% </li><li> L&#39;apparence physique, la fourrure, la position de bossu, yeux </li><li> Respiration ou le rythme cardiaque Augmentation </li><li> Mouvements diminué ou inhabituelles. </li><li> Augmentation de la température du corps </li><li> Paracetamole En cas de signes de douleur sont détectés est administré par voie orale (300 mg / kg, toutes les 4 heures). Les principaux critères sont strictement respectées si la douleur persiste. </li></ul></li><li> Si la greffe est sèche appliquer de l&#39;huile de bébé tous les 2-3 jours pour garder la peau souple. </li><li> Le greffon est prêt pour l&#39;expérimentation 21 jours après la greffe. </li></ol> 3. Infection <ol><li> Le jour avant l&#39;infection, préparer souche bactérienne par stries sur des plaques de gélose GCB avec des antibiotiques appropriés. Croître pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> préparation de bactéries <ol&gt; <li> renouveler l&#39;ensemencement de bactéries dans 5 ml de milieu de SFM de l&#39;endothélium humain avec 10% de sérum à une DO600 de 0,05. </li><li> Incuber sous agitation pendant 2 h dans un incubateur (37 ° C dans 5% de CO 2) munie d&#39;un couvercle, jusqu&#39;à une densité bactérienne d&#39;environ 600 OD 0,1. </li><li> Centrifuger les bactéries pendant 3 min 15,000 rpm. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension dans du PBS, puis centrifuger à nouveau. </li><li> Répéter deux fois l&#39;étape de lavage (2.2.4-2.2.5). </li><li> Reprendre culot bactérien dans du PBS. </li><li> Mesurer la DO 600. </li><li> Faire une culture de l&#39;une DO600 de 0,1 (10 8 CFU / ml), ou OD 600 1,0 (10 9 CFU / ml). A partir de cette concentration connue, diluer à 10 7 UFC / ml. Essayez de préparer des bactéries aussi près à l&#39;heure d&#39;injection que possible. </li></ol></li><li> Souris <ol><li> Peser souris. </li><li> Ip anesthésier la souris avec la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) injectée </li><li> Une fois endormi, cdiable que la réponse de la douleur est absente par un orteil-pincement, gardez la souris chaude avec un pad thermique et de mettre la pommade oculaire à prévenir le dessèchement. </li><li> Donnez à chaque souris 8 mg de transferrine humaine, remises en suspension dans une solution saline ou PBS, injecté ip </li><li> Prenez une petite goutte de sang de la queue et l&#39;étaler sur une plaque de gélose pour vérifier le sang est stérile avant l&#39;infection. </li><li> Injecter 100 pi 10 7 CFU / ml culture bactérienne (10 6 UFC total) par voie intraveineuse via la veine rétro-orbitaire ou la queue. Mesures de CFU prises 5 après l&#39;injection min sont conformes indépendamment du site d&#39;injection. </li><li> Après quelques minutes, couper la queue et se propager échantillon de sang sur des plaques de gélose avec des antibiotiques appropriés avec une dilution de 10 fois pour établir CFU de sang immédiatement après l&#39;infection. </li><li> Sceller la queue avec de la colle tissulaire. </li><li> Après l&#39;injection, diluer l&#39;inoculum bactérien et étalé sur des boîtes de gélose avec des antibiotiques appropriés pour établir UFC. </li><li> Autoriser la sourisde récupérer sur un tapis de chaleur jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient en place et le déplacement </li><li> À 6 h après l&#39;infection dessiner une petite quantité de sang de la queue, diluer et plaque d&#39;établir UFC à 6 h. </li><li> Incuber les plaques de gélose à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant une nuit. </li></ol></li></ol> 4. Sacrifice <ol><li> Au moment choisi de l&#39;infection, anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) injectée ip </li><li> Une fois endormi, le garder au chaud de la souris avec un pad thermique. </li><li> Lorsque le réflexe de douleur a disparu (orteil-pincement), couper fin de la queue et prélever du sang. </li><li> Étaler sang sur des plaques de gélose avec des antibiotiques appropriés; 5 pi directe et 10 pi dilution 1:10 pour établir UFC. </li><li> Sacrifier la souris par dislocation cervicale. </li><li> Après avoir sacrifié la souris selon les directives institutionnelles et éthiques pertinents, confirmer la mort par manque de rythme cardiaque. Faire une incision médiane, couper à travers la cage thoracique, et faire une incision dans l&#39;audiencet. </li><li> Recueillir autant de sang que possible de l&#39;/ cavité thoracique cardiaque et le placer dans un tube stérile. </li><li> Prélever des organes (foie, rate, cerveau) dans une plaque stérile. </li><li> Retirer la greffe de peau et d&#39;une section de la peau de la souris dans la plaque stérile. </li><li> Éliminer le corps de la souris. </li><li> Après que le sang recueilli a été mis à coaguler pendant 15 minutes, centrifuger 15 min à 3000 rpm. </li><li> Retirer le plasma du sang et stocker à -80 ° C pour analyse ultérieure, par exemple pour la détection des cytokines par ELISA ou des méthodes basées FACS. </li></ol> 5. Comtes organe UFC <ol><li> Peser homogénéisation des tubes contenant 500 pi de PBS chaque avant de prendre des échantillons de biopsie. </li><li> Prendre 4 échantillons de biopsie mm de chaque tissu à l&#39;aide d&#39;une biopsie poinçon stérile. </li><li> La place des biopsies dans des tubes d&#39;homogénéisation prépesé contenant 500 pi de PBS. Homogénéiser les échantillons de peau avec 2 perles mm, utiliser les petites perles pour d&#39;autres organes. </li><li> Placez le reste tquestions à 4% paraformaldéhyde (PFA) et conserver à 4 ° C pour la microscopie (voir ci-dessous). </li><li> Peser homogénéisation des tubes contenant les biopsies pour établir le poids biopsie (pour le calcul ultérieur de CFU / mg de tissu). </li><li> Homogénéiser les échantillons. <ol><li> Homogénéiser le foie, la rate et le cerveau, à 6000 rpm pendant 30 s. </li><li> Homogénéiser les échantillons de peau à 6000 rpm pendant 30 secondes et répétez si nécessaire. </li></ol></li><li> Etaler dilutions de chaque tube sur des plaques de gélose à homogénéiser et faire croître pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2 pour établir organes comptages de CFU. </li></ol> 6. Histologie / immunohistochimie <ol><li> Fixation <ol><li> Fixer les tissus dans 4% de PFA pendant une nuit à 4 ° C. L&#39;étape de fixation peut être plus long, si stocker pendant de longues périodes placer les tissus dans 0,25% de PFA. </li><li> Rincer les tissus dans de la PBS et puis mettre dans une solution de saccharose à 20% et de revenir à 4 ° C pendant une nuit ou jusqu&#39;à ce que les tissus ont coulé dans la solution. </li><li> Laver les tissus dans du PBS, coupé à la taille et le lieu en solution OCT (soit dans un moule de tissu ou adhéré à une plaque de base). </li><li> Congeler rapidement les tissus sur une boîte de Pétri flottant dans l&#39;azote liquide. </li><li> Après congélation, mettre les tissus sur de la glace sèche avant le transfert à -80 ° C pour le stockage. </li></ol></li><li> Tranchage <ol><li> Retirer les tissus à partir de -80 ° C et ramener la température à -20 ° C dans un cryostat. </li><li> Couper les tissus avec une épaisseur d&#39;environ 10 à 15 um et placer sur des lames de microscope revêtues. </li><li> Magasin glisse à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol></li><li> Coloration <ol><li> Permettre aux diapositives à venir à la température ambiante. </li><li> Dessiner autour de la tranche sur la diapositive avec un stylo hydrophobe. Attendre 5-10 min. </li><li> Réhydrater / lavage tranche dans du PBS pendant 5 min, répéter deux fois. </li><li> Perméabilisent tranche de 0,1% de Triton dans du PBS pendant 10 min. </li><li> Laver dans du PBS 2-3x pendant 5 min. </li><li> Bloquer dans PBS0,1% de Triton 1% de BSA pendant entre 10 à 60 min en fonction de l&#39;anticorps ou de la teinture pour être utilisé. </li><li> Retirez le tampon de blocage et ajouter anticorps primaire dilué au besoin dans un tampon de bloc. Incuber pendant le temps déterminé. (Souvent 1 heure à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C). </li><li> Laver dans du PBS 2-3x pendant 5 min. </li><li> Appliquer un anticorps secondaire dilué comme il convient dans un tampon de bock; DAPI est généralement inclus dans cette étape. Incuber pendant le temps déterminé, souvent 1-2 température ambiante h, dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver dans du PBS 2-3x pendant 5 min. </li><li> Mount fondu protection des supports de montage avec un couvercle en verre et sceller avec du vernis à ongles. </li><li> Image lames colorées immédiatement ou conserver à 4 ° C. </li><li> Effectuer une imagerie avec un microscopie confocale ou fluorescent mis en place avec des filtres / lasers appropriés à des fluorophores utilisés. </li></ol></li><li> Histologie <ol><li> Permettre aux lamelles d&#39;être utilisés pour l&#39;histologie de venir à la température ambiante. </li><li> diapositives de taches en utilisant commetandard hématoxyline / éosine protocole de coloration. <ol><li> Placer les lames dans la grille coulissante. </li><li> Transfert rack avec glissières entre les solutions dans l&#39;ordre suivant: </li><li> 2 secondes dans l&#39;eau du robinet. </li><li> 3 min dans une solution d&#39;hématoxyline filtré. </li><li> 10 secondes dans l&#39;eau courante. </li><li> 10 secondes dans de l&#39;eau distillée. </li><li> 10 sec dans de l&#39;éthanol à 100%. </li><li> 2 sec filtré dans de l&#39;éosine. </li><li> 10 secondes dans l&#39;eau courante. </li><li> 10 sec dans de l&#39;éthanol à 100% </li><li> 2 min x 3 dans le xylene (bain I, II, III). </li><li> Transférer et ajouter quelques gouttes de colle sur chaque fixation diapositives, lieu lamelle sur le dessus, éliminer les bulles d&#39;air, laisser sécher pendant quelques heures. </li><li> Image glisse sous un microscope à lumière blanche standard. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Les modèles animaux sont d&#39;une importance capitale à la recherche de la pathogenèse bactérienne. Il est impossible d&#39;imiter parfaitement l&#39;environnement in vivo dans une culture cellulaire et il devient évident que l&#39;interaction hôte-pathogène est influencée par de nombreux facteurs dynamiques. La spécificité humaine de certains agents pathogènes cliniquement importants, tels que N. meningitidis, le VIH, le VHC, le Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi et a limité l&#39;utilisation de modèles in vivo de ces infections. Cependant, comme nous commençons à comprendre les étapes qui infectieuses sont impliqués dans la spécificité, les modèles humanisés sont en cours d&#39;élaboration. Le protocole décrit ici est une démonstration de la présente avec l&#39;introduction de microvaisseaux humains dans des souris, ce qui permet très étendue dans l&#39;infection in vivo avec N. meningitidis, entraînant des dommages vasculaires et parfois le développement d&#39;éruptions purpuriques. En utilisant ce modèle,Nous avons pu définir que les propriétés adhésives de la PGF sont impliqués dans la colonisation vasculaire in vivo en utilisant des mutants de bactéries et que le dommage vasculaire est réduite en l&#39;absence d&#39;adhérence 18. Auparavant, circulant produits bactériens ont été impliqués dans ces dommages, mais nos résultats suggèrent un rôle décisif pour l&#39;adhésion locale et de la colonisation vasculaire. Cela ouvre de nouvelles possibilités pour le développement de cibles roman de traitement. Si l&#39;adhérence des bactéries pathogènes pourrait être bloqué pharmaceutique il pourrait prévenir le développement de lésions cutanées et conduire à de meilleurs résultats pour les survivants à méningocoques en termes de nécrose tissulaire, le débridement et l&#39;amputation. Ces travaux ont également montré la complexité de l&#39;infection et de l&#39;implication de la réponse immunitaire et de la cascade de coagulation. Nous avons identifié la signalisation des cytokines humaine dans le sérum de souris infectées en dépit de la quantité relativement faible de 18 l&#39;endothélium humain présent.Ceci indique une réponse de cytokine importante, avec l&#39;infiltration des populations de cellules immunitaires de souris dans la zone. Les modèles animaux peuvent bien sûr jamais reproduire exactement la maladie humaine et tous les résultats valu d&#39;eux doit être considéré dans cette perspective. Par exemple, dans ce modèle, le sang et les cellules circulantes sont d&#39;origine de la souris et on ne peut pas escompter qu&#39;ils peuvent se comporter différemment pour les cellules humaines. Un avantage de la présente cependant, comme démontré dans notre publication récente 18, est la capacité à se différencier de signalisation originaires de l&#39;endothélium humain de celui des cellules de souris en circulation. Le fond immunodéprimés des souris utilisées dans ce modèle permettrait également le transfert des populations allogènes immunitaires cellulaires humaines, en ajoutant un autre aspect «d&#39;humanisation». Le fond immunodéprimés des souris peut cependant masquer un rôle pour NK, T ou cellules B, qui sont tous absents ou défectueux dans ce modèle. Relativement short délai (24 heures) utilisée dans ce modèle concerne principalement la réponse innée, mais pour les infections à long terme et le développement de l&#39;immunité d&#39;autres options peut-être besoin d&#39;être explorées. La peau est un site important pour l&#39;infection par N. meningitidis, mais ayant une quantité relativement faible de navires droits signifie aussi que l&#39;extrapolation des données à une infection systémique impliquant de nombreux organes est difficile. Bien que ce modèle permet l&#39;étude des cutanée développement des lésions, des étapes importantes de l&#39;infection à méningocoque tels que l&#39;épithélium et de sang-cerveau passage ne sont pas inclus. Le développement de ces modèles humanisés est nécessaire pour répondre à ces autres aspects de l&#39;infection. Néanmoins, ce modèle offre un grand potentiel pour de nombreux agents pathogènes spécifiques sur les droits, en particulier ceux qui ciblent les vaisseaux sanguins.

Septicémie à méningocoque est une infection du sang né souvent mortelle causée par la bactérie pathogène Neisseria meningitidis. Patients atteints de sepsie méningocoque présentent souvent des pétéchies ou purpura sur la peau qui a déjà été associé à la destruction vasculaire causée par des bactéries circulantes et des produits bactériens 1. Les biopsies cutanées de patients cliniques montrent bactéries associées aux microvaisseaux, remplissant souvent les navires 2. En dehors de la bactérie, la thrombose extensive, la coagulation, la congestion vasculaire et la fuite est vu dans les régions purpuriques 3-5. Cette lésion vasculaire peut conduire à une nécrose de la peau et des tissus environnants, ce qui entraîne un débridement et même l&#39;amputation chez les survivants à méningocoque. Comprendre comment l&#39;infection provoque cette atteinte vasculaire est important d&#39;optimiser les stratégies de prévention et de traitement. La majorité des recherches sur la septicémie à méningocoque a été réalisée in vitro surdes lignées cellulaires humaines en raison de la spécificité humaine de N. meningitidis. De nombreux aspects de l&#39;infection ont été étudiés in vitro, y compris l&#39;adhésion bactérienne, la réponse de la cellule hôte ainsi que la réponse de cytokine 6-9. Pili de type IV (PTF) ont été impliqués en tant que principal organite d&#39;adhésion pour N. meningitidis sur les deux cellules epitheliales et endotheliales 10 Il a également été montré que l&#39;adhérence de N.. meningitidis à des cellules hôtes est contrainte de cisaillement dépend et est donc pensé pour être liés à des débits de sang dans la microcirculation 11. Ceci suggère les contraintes dynamiques les bactéries font face in vivo sont essentiels à la pathogenèse. Il est cependant très difficile à modéliser le microenvironnement de petits vaisseaux in vitro. Le récepteur d&#39;adhésion pour Neisseria Tfp est encore inconnue et donc des stratégies knock-in pour atteindre l&#39;adhésion bactérienne dans un modèle animal ne peut être envisagée en ce moment. CD46 a été suggéré d&#39;être le récepteur Tfp et des animaux transgéniques ont été produites à agir comme des modèles de souris. Cependant, l&#39;infection chez ces animaux ne conduit pas à une infection ou à une éruption cutanée étendue développement 12,13. D&#39;autres modèles animaux qui ont été décrits pour l&#39;aspect de l&#39;infection à Neisseria bactériémie tiennent compte de la préférence des bactéries pour la transferrine humaine en tant que source de fer 14,15. Soit complétant la transferrine humaine ou l&#39;exprimant à partir d&#39;un résultat de transgène dans une augmentation de la charge bactérienne dans le sang sur une période de temps prolongée, mais ce modèle ne présente aucune adhérence bactérienne ou développement éruption 16,17. Dans ce protocole, nous décrivons un modèle de souris humanisée dans laquelle la peau humaine, y compris la microvascularisation cutanée, est transplanté sur des souris immunodéprimées 18,19. Il en résulte dans les vaisseaux humains fonctionnels, perfusés avec la circulation de la souris. Combinée à la transferrine humaine supplémentation, ce mreprésente odèle pour au moins deux des aspects spécifiques des droits de N. meningitidis, à savoir l&#39;endothélium humaine et la transferrine humaine, dans un environnement in vivo. N. meningitidis introduit par voie intraveineuse dans ce modèle spécifiquement adhérer à l&#39;endothélium humain, la production d&#39;une pathologie qui est similaire à ce qui est rapporté chez des patients cliniques, y compris des dommages vasculaires et le développement de purpura 18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31885-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:161px;">Virbac France&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">LOT N&#176;VAL4243</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylazine</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Bayer Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">AMM N&#176; FR/8146715 2/1980</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">LOT N&#176; KPO809S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">(Rompun 2%)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:247px;">Optigel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Europhta</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Medicament autoris&#233; N&#176;3400933521134</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lacrigel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tronothane</td>
			<td style="width:161px;">Lisa Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:247px;">GC agar Base</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Conda</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">1106</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human endothelium SFM media</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:161px;">P A A</td>
			<td style="width:119px;">A15-101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human transferrin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">UEA lectin - rhodamine</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">RL-1062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Eosin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4009&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylene</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">534056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Equiptment Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sober Hand Dermatome</td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Animal housing</td>
			<td style="width:161px;">Innovive</td>
			<td style="width:119px;">M-BTM-C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Biopsy punch (4 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Dominic Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">30737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fast-Prep lysing matrix M tubes</td>
			<td style="width:161px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">116923050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer Green Beads</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358941001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond</td>
			<td style="width:161px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">OCT tissue tek</td>
			<td style="width:161px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

Neisseria meningitidis provoque un sepsis sévère, souvent fatale quand il pénètre dans la circulation sanguine humaine. L&#39;infection conduit à d&#39;importants dégâts des vaisseaux sanguins résultant de la fuite vasculaire, le développement d&#39;éruptions purpuriques et une nécrose tissulaire éventuelle. L&#39;étude de la pathogenèse de l&#39;infection a été préalablement limitée par la spécificité humaine de la bactérie, ce qui en fait des modèles in vivo difficile. Dans ce protocole, nous décrivons un modèle humanisé de cette infection dans laquelle la peau humaine, contenant des microvaisseaux du derme, est greffé sur des souris immunodéprimées. Ces vaisseaux s&#39;anastomosent avec la circulation de la souris tout en maintenant leurs caractéristiques humaines. Une fois introduit dans ce modèle, N. meningitidis adhèrent exclusivement aux navires humains, entraînant des dommages vasculaires, l&#39;inflammation et, dans certains cas, le développement de purpura. Ce protocole décrit les greffes, les maladies infectieuses et des mesures d&#39;évaluation de ce modèle dans le context de N. infection meningitidis. La technique peut être appliquée à de nombreux agents pathogènes humains spécifiques qui infectent le courant sanguin.

Le nombre de CFU Le N. souche meningitidis utilisé dans ces résultats représentatifs est N. meningitidis 8013 clone 12, un isolat clinique de sérogroupe C, l&#39;expression d&#39;une classe I SB piline, Opa -, Opc -, pilC1 + / PilC2 + 20. La souche a été modifiée pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) d&#39;une insertion chromosomique 18. Formant des colonies bactériennes chiffres unitaires sont établies en comptant le nombre de colonies sur les plaques d&#39;agar-agar et le calcul soit CFU / ml de sang ou de CFU / mg de tissu à partir des volumes connus plaquées. numérations globulaires ont montré que les 5 min après l&#39;injection iv de 10 6 UFC de bactéries y avait une moyenne de 1,5 x 10 5 CFU / ml dans le sang circulant (Figure 1A). Après 6 h les chiffres en moyenne de 4,8 x 10 4 CFU / ml. En 24 heures les comptes moyens étaient de 2,4 x 10 4 CFU / ml mais dans ce groupe de 10 souris, 5 eupas détectable bactéries circulation tandis que les 5 autres avaient chiffres relativement élevés (figure 1A). Le nombre de CFU prises à partir des échantillons de peau montrent que la majorité des souris ayant des chiffres considérables dans la peau humaine, avec une moyenne de 2,1 x 10 4 CFU / mg de tissu à 6 h et 4,4 x 10 2 CFU / mg de tissu à 24 h (Figure 1B) . Les échantillons de peau de souris controlatérale montré aucun nombre de bactéries à 24 h et seul un nombre très faible à 6 h, ce qui démontre la forte préférence pour N. meningitidis aux navires de l&#39;homme dans la peau greffée (figure 1B). En général le nombre de bactéries ont été très faibles à non détectable dans les autres organes de l&#39;échantillon, bien que deux animaux ont montrent les chiffres qui peuvent être attribuées à la contamination par le sang, comme ils corrélés avec une forte circulation le nombre de bactéries (figure 1C). Le modèle peut également être utilisé pour déterminer le rôle des facteurs de virulence in vivo, par exemple du type IV pili. Les souches bactériennes avec des mutations définies dans le gène pilD 21, résultant en une souche dépourvue Tfp, ainsi que le gène de la pilC1 8, manquant de la TFP «adhésine» proposée ont été introduites dans le modèle. Ces mutations ont entraîné aucune adhérence bactérienne dans la greffe de peau humaine, ce qui confirme le rôle crucial Tfp joue dans l&#39;adhérence in vivo (figure 1D). Immunohistochimie / histologie Dans ces expériences, nous avons utilisé N. meningitidis souches qui expriment la protéine de fluorescence verte (GFP) pour permettre la détection par fluorescence, sans la nécessité d&#39;une coloration secondaire. Vaisseaux humains ont été colorées en utilisant un marqueur de l&#39;endothélium humain, soit CD31 (PECAM-1) ou la lectine Ulex europaeus agglutinine (UEA) 18,22. L&#39;UEA a été conjugué à la rhodamine permettant une étape de coloration (figures 2A-C). Les noyaux cellulaires peuvent être colorented avec DAPI pour aider à identifier les structures tissulaires (Figures 2A-B). L&#39;histologie a été réalisée en utilisant une coloration hématoxyline / éosine standard. La frontière épidermique / cutanée de la peau était clairement identifiable. Inflammation, la thrombose vasculaire et fuite ont été concentrées aux navires à proximité de cette frontière de 24 heures après l&#39;infection (figure 2D). Thrombose était visible dans plusieurs vaisseaux dermiques petits, souvent accompagnés par la congestion et l&#39;inflammation. La fuite de globules rouges dans les tissus rupture pourrait être vu, ce qui indique un niveau très étendue de lésions des vaisseaux. L&#39;examen histopathologique de la peau greffée sur des souris non infectées semblait normal sans inflammation distingue 18. Dans environ 30% des infections adhésion bactérienne sur la peau conduit à l&#39;élaboration d&#39;un purpura macroscopiquement détectable (figures 2E et 2F). <img alt="Figure 1" fo:content-width=<html> &quot;5po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1. Le nombre de CFU. (A) le nombre de bactéries UFC par ml de sang à 5 min, 6 h et 24 h post infection. (B) bactérienne UFC compte à partir d&#39;échantillons de peau comparant la peau humaine (SH) et la peau de la souris (MS) à la fois 6 h et 24 h post infection. (C) bactérienne UFC compte d&#39;autres organes prélevés 24 h post infection. (D) sont comparés les chiffres de CFU de bactéries à partir d&#39;échantillons de peau humaine et de la souris prises lors de l&#39;infection de 24 heures de poste de souris infectées par la souche sauvage N. meningitidis 2C43 tache (WT), une souche présentant une mutation dans le gène de pilD (pilD) ou d&#39;une souche présentant une mutation dans le gène pilC1 (pilC1). Tous les graphiques sont présentés sous forme de données brutes avec médiane. Figure est modifié à partir Melican et al. 18&quot;_blank&quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> Figure 2. Microscopie. (A) Projection d&#39;une pile confocale montrant une microvaisseaux humain colorées avec UEA lectine (rouge) à proximité de la voie cutanée (d) épidermique (e) frontière. Le navire est infecté par N. meningitidis (vert) 2 h post infection. (B) Une tranche optique et une projection de tranche (C) montrant N. microcolonies meningitidis (vert) l&#39;infection d&#39;un navire humain (UEA - rouge) à l&#39;intérieur d&#39;une infection greffe de peau 2 h de poste. (D) à l&#39;hématoxyline / éosine de greffe de peau humaine infectée pendant 24 heures avec N. meningitidis. Le épidermique (e), cutanée (d) la frontière est clairement la thrombose et la congestion de microvess visible et vasteels (flèches) est considérée dans le derme. L&#39;inflammation et une partie de fuite vasculaire (tête de flèche) peuvent également être identifiés. (E) La peau humaine greffe avant l&#39;infection. (F) Le même de greffe de peau comme l&#39;infection h de poste (E) de 24 avec N. meningitidis montrant des régions purpuriques (flèches). figures 2B, 2D, 2E, 2F et sont modifiées de Melican et al. 18 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

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Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis est un agent pathogène humain spécifique qui infecte les vaisseaux sanguins. Dans ce protocole, les microvaisseaux humains sont introduites dans une souris par greffage de peau humaine sur les souris immunodéprimées. Les bactéries adhèrent largement aux navires humains, entraînant des dommages et le développement vasculaire du purpura généralement observée dans des cas humains.

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