Name: humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00
Duration: 11 min 40 s
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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Dumenil, particularmente Silke Silva para a leitura crítica do manuscrito. O departamento de cirurgia no Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin e Dr. Patrick Bruneval, Patologia Departamento de HEGP. O biotério em PARCC, liderada por Elizabeth Huc. Este trabalho foi financiado pelas seguintes agências de subsídios: Marie Curie IEF comunhão não. 273.223 (KM), ATIP-Avenir Grant do INSERM, equipamentos CODDIM concessão (Ile de France Região), FRM (Fondation pour la recherche médicale) concessão de equipamentos, o Laboratório IBEID de excelência consórcio, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) concessão &quot; Erros-em-fluxo &quot;. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

1. Riscos e Permissões <ol><li> Comitês de ética locais devem aprovar todos os protocolos de animais. Este protocolo foi conduzido de acordo com as diretrizes estabelecidas pela legislação francesa e europeia para o cuidado e uso de animais de laboratório (Decrets 87-848, 2001-464, 2001-486 e 2001-131 e Directiva Europeia 2010/63/UE) e aprovado pelo comitê de ética local Comité d&#39;Ethique em Matéria de Experimentação Animale, Universite Paris Descartes, Paris, França. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Para a pele humana, consentimento informado do doente escrito foi obtido e todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais franceses e aprovado pelo comitê de ética local, Comité d&#39;Evaluation de l&#39;INSERM Ethique IRB 00003888 00005881 FWA, Paris, França Opinião: 11-048 . </li><li> N. meningitidis é um patógeno humano potencialmente prejudiciais e todas as precauções necessárias devem ser tomadas ao manusear a organismo. Essas precauções incluem vacinação e trabalhando sob nível de Biossegurança 2 condições. </li></ol> 2. Enxerto de pele <ol><li> Colete de pele humana como perto de enxertia tempo possível. A maioria de pele neste trabalho vem de operações de cirurgia plástica, envolvendo a área abdominal. Outras fontes, como peito, perna e até mesmo o rosto têm sido utilizados com sucesso. </li><li> Preparar a amostra de pele humana com a limpeza da superfície da pele com etanol 70% e deitado-o deitado sobre uma superfície bem limpa, de preferência em uma capela de fluxo. </li><li> Fatia 200-400 mM fatias a partir do topo da pele utilizando uma dermatoma com espessura predefinida. </li><li> Verificar as fatias de pele para a integridade e cortou-las em 2 cm x 2 cm quadrados, em seguida, colocar em PBS (sem catiões divalentes), se enxertando imediatamente ou a 4 ° C em DMEM com 10% de soro durante o armazenamento a curto prazo (3-12 hr ). </li><li> Anestesiar 6-8 semanas de idade, ratinhos SCID.bg (aproximadamente 20 g) com cetamina (100 mg / kg) e Xilazina (10 mg / kg) injeCTED ip </li><li> Uma vez que os ratos são anestesiados, para verificar a resposta à dor através da realização de uma pitada do dedo do pé, um método padrão para estabelecer reflexo dor. Aplique gel para os olhos para evitar a secagem da córnea e raspar o lado esquerdo do animal por trás do ombro, em que o enxerto vai ser posicionado. Manter o aquecimento do mouse sobre uma almofada de calor durante todo o procedimento. </li><li> Depois de preparar o mouse para a cirurgia, limpe a área depilada com etanol 70%. </li><li> Aplicar anestésico local topicamente para o local do enxerto (Tronothane) e preparar o local do enxerto, retirando cuidadosamente a camada superficial da pele do rato com um par de tesouras curvas. Tenha cuidado para não interromper a vascularização subjacente. </li><li> Remover a pele numa zona um pouco menor do que a área da fatia de pele humana. </li><li> Retire pele fatia de PBS (ou DMEM) e coloque sobre a cama de enxerto, garantindo lado epidérmico é voltado para cima. Passos 2,8-2,10 deve ser realizado tão rapidamente quanto possível, garantindo o leito de enxerto não seca. </li><li> Alinhe um cantoou borda e correção com cola de tecido. Ajustar cuidadosamente o resto da fatia de pele para a cama de enxerto, a colocação de pequenas quantidades de cola para tecido em torno das bordas. Sempre cortar a pele humana para o tamanho, em vez de fazer a cama enxerto maior. </li><li> Não puxe a pele muito apertado sobre o leito do enxerto, pois a pele do rato é muito flexível. </li><li> Certifique-se que o enxerto é fixado com cola de tecido em cada canto. </li><li> Limpar a área com uma solução de iodo. </li><li> Aplique um Band-Aid com a área da almofada sobre o enxerto. Certifique-se que o Band-Aid é firme, mas não apertado e que a respiração do animal não é afetado. </li><li> Fixe o Band-Aid com fita de vestir. </li><li> Permitir que o animal se recuperar em uma superfície quente. </li><li> Uma vez acordado, devolver o animal para sua gaiola. Os animais são alojados 2-3 por gaiola. </li><li> Verifique regularmente os ratos durante a recuperação para sinais de dor ou sofrimento. 10-14 dias após a enxertia, remova o Band-Aid, tomando cuidado para não perturbar o enxerto. Em nossa experiência de dor pós-operatória é mini-mal. No entanto os animais devem ser monitorados a cada dia, em especial, nos poucos dias seguintes operação. Critérios para a dor ou aflição são os seguintes. <ul><li> Perda de peso mais de 10% </li><li> A aparência física, pele, posição corcunda, olhos </li><li> Taxas de respiração ou cardíacos aumentados </li><li> Movimentos diminuídos ou incomuns. </li><li> Aumento da temperatura corporal </li><li> Paracetamole No caso de serem detectados sinais de dor é administrado por via oral (300 mg / kg, a cada 4 horas). Endpoints Humane são rigorosamente respeitados se a dor persistir. </li></ul></li><li> Se o enxerto parece seca aplicar óleo de bebê a cada 2-3 dias para manter a pele macia. </li><li> O enxerto está pronto para a experimentação 21 dias após enxerto. </li></ol> 3. Infecção <ol><li> O dia antes da infecção, preparar estirpe bacteriana por estrias em ágar GCB com antibióticos apropriados. Crescer durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Preparação Bactérias <ol&gt; <li> Reinoculate bactérias em 5 ml de meio SFM endotélio humano com 10% de soro a uma OD 600 de 0,05. </li><li> Incubar, agitando durante 2 horas na incubadora (37 ° C em 5% de CO 2) com a tampa solta, até que uma densidade bacteriana de cerca de DO600 de 0,1. </li><li> Centrifugar as bactérias por 3 min 15.000 rpm. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender em PBS, depois centrifugar novamente. </li><li> Repita o passo de lavagem (2.2.4-2.2.5) duas vezes. </li><li> Ressuspender sedimento de bactérias em PBS. </li><li> Medida OD600. </li><li> Fazer a cultura de qualquer uma das DO600 de 0,1 (10 8 UFC / ml), ou 1,0 OD 600 (10 9 CFU / ml). Deste concentração conhecida, diluir a 10 7 CFU / mL. Tente preparar bactérias tão perto quanto possível do tempo de injecção. </li></ol></li><li> Ratos <ol><li> Pesar ratinhos. </li><li> Anestesiar os ratos com cetamina (100 mg / kg) e Xilazina (10 mg / kg) injectada ip </li><li> Uma vez adormecido, cParreira que a resposta a dor está ausente por um toe-pitada, manter os ratos quente com uma almofada de calor e colocar pomada para evitar a secagem. </li><li> Dar a cada rato 8 mg de transferrina humana, suspensas em solução salina ou PBS, injectado ip </li><li> Tomar uma pequena gota de sangue a partir da cauda e espalhada sobre uma placa de ágar de sangue para verificar é esterilizada antes da infecção. </li><li> Injetar 100 l 10 7 UFC / ml de cultura bacteriana (10 6 UFC total) por via intravenosa através da veia retro-orbital ou cauda. Medidas de CFU tomadas 5 min pós-injeção são consistentes independentemente do local da injeção. </li><li> Depois de alguns minutos, cortar a extremidade da cauda e espalhar amostra de sangue em placas de agar com antibióticos apropriados, com uma diluição de 10 vezes para estabelecer CFU no sangue imediatamente após a infecção. </li><li> Selar a cauda com cola de tecido. </li><li> Após a injeção, diluir o inóculo bacteriano e espalhada em placas de ágar com os antibióticos apropriados para estabelecer UFC. </li><li> Permitir que os camundongospara se recuperar em uma almofada de calor até que eles estão em alta e em movimento </li><li> Às 6 horas após a infecção consumir uma pequena quantidade de sangue a partir da cauda, ​​diluir e placa para estabelecer CFU em 6 horas. </li><li> Incubar todas as placas de agar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante a noite. </li></ol></li></ol> 4. Sacrifício <ol><li> No momento escolhido de infecção, anestesiar os ratos com cetamina (100 mg / kg) e Xilazina (10 mg / kg) injectada ip </li><li> Uma vez dormindo, manter o aquecimento do mouse com uma almofada de calor. </li><li> Quando o reflexo de dor passou (toe-pitada), corte final de cauda e tirar sangue. </li><li> Espalhe sangue em ágar com antibióticos adequados; diluição 5 mL e 10 mL direta 1:10 a estabelecer UFC. </li><li> Sacrifique o mouse por deslocamento cervical. </li><li> Depois de sacrificar o mouse de acordo com todas as diretrizes institucionais e éticos relevantes, confirmar a morte por falta de batimentos cardíacos. Faça uma incisão na linha média, cortar costelas, e fazer uma incisão no ouvirt. </li><li> Colete o máximo de sangue possível do coração cavidade / caixa e coloque em um tubo estéril. </li><li> Retirar os órgãos (por exemplo, fígado, baço, cérebro) em uma placa estéril. </li><li> Retire o enxerto de pele e uma seção de pele do rato na placa estéril. </li><li> Eliminar o corpo do rato. </li><li> Depois que o sangue coletado foi autorizado a coagular por 15 minutos, centrifugar ele 15 min a 3.000 rpm. </li><li> Remover o plasma do sangue, e armazenar a -80 ° C para análise posterior, por exemplo para a detecção de citocinas por métodos de ELISA ou FACS com base. </li></ol> 5. Counts Órgão UFC <ol><li> Pesar homogeneização tubos contendo 500 mL de PBS antes de cada colheita de amostras de biópsia. </li><li> Tome 4 amostras de biópsia mm de cada tecido, utilizando um soco biópsia estéril. </li><li> Colocar em tubos de homogeneização biópsias pré-pesado, contendo 500 ul de PBS. Homogeneizar amostras de pele com 2 contas mm, use contas menores para outros órgãos. </li><li> Coloque o restante tquestões em 4% de paraformaldeído (PFA) e armazenar a 4 ° C durante a microscopia (ver abaixo). </li><li> Pesar homogeneização tubos contendo as biópsias para estabelecer peso biópsia (para posterior cálculo de UFC / mg de tecido). </li><li> Homogeneizar amostras. <ol><li> Homogeneizar fígado, baço e cérebro, a 6.000 rpm durante 30 segundos. </li><li> Homogeneizar amostras de pele a 6.000 rpm por 30 segundos e repita se necessário. </li></ol></li><li> Espalhe diluições de cada tubo de homogeneização em placas de agar e crescer durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2 para estabelecer contagens de UFC de órgãos. </li></ol> 6. Histologia / imuno-histoquímica <ol><li> Fixação <ol><li> Fixar os tecidos em PFA a 4% durante a noite a 4 ° C. O passo de fixação pode ser mais longo, se o armazenamento por períodos mais longos colocar os tecidos em 0,25% de PFA. </li><li> Lavar os tecidos em PBS e, em seguida, colocar em solução de sacarose a 20% e regresso a 4 ° C durante a noite ou até que os tecidos se afundaram na solução. </li><li> Lave os tecidos em PBS, cortados e coloque em solução outubro (seja em um molde de tecido ou adere a uma placa de base). </li><li> Congelar rapidamente os tecidos em uma placa de Petri flutuante em nitrogênio líquido. </li><li> Após o congelamento, coloque os tecidos em gelo seco antes da transferência para -80 ° C para armazenamento. </li></ol></li><li> Fatiar <ol><li> Retirar tecidos de -80 ° C e deixar equilibrar a -20 ° C num criostato. </li><li> Tecidos da fatia com uma espessura de cerca de 10-15 mM e colocar em lâminas de microscopia revestidos. </li><li> Loja desliza a -20 ° C até ser necessário. </li></ol></li><li> Coloração <ol><li> Deixar as lâminas voltar à temperatura ambiente. </li><li> Desenhe em torno da fatia no slide com uma caneta hidrofóbica. Espere 5-10 min. </li><li> Rehidratar fatia / lavagem em PBS por 5 min, repetir duas vezes. </li><li> Permeabilizar fatia em 0,1% de Triton em PBS durante 10 min. </li><li> Lavar com PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Bloco em PBS0,1% de Triton a 1% de BSA durante entre 10-60 minutos, dependendo do anticorpo ou mancha a ser utilizado. </li><li> Remover o tampão de bloqueio e adicionar anticorpo primário diluído, conforme necessário, em tampão de bloqueio. Incubar por determinado tempo. (Muitas vezes 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C). </li><li> Lavar com PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Aplicar anticorpo secundário diluído conforme apropriado em tampão Bock; DAPI é normalmente incluído nesta etapa. Incubar por tempo determinado, geralmente 1-2 horas à temperatura ambiente, no escuro. </li><li> Lavar com PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Monte em desaparecer proteger mídia montagem com uma tampa de vidro e selar com verniz de unhas. </li><li> Imagem lâminas coradas imediatamente ou armazenar a 4 ° C. </li><li> Realize imagem com um microscópio confocal ou fluorescente configurado com filtros / lasers apropriados para fluoróforos usados. </li></ol></li><li> Histologia <ol><li> Deixar as lâminas a serem utilizados para a histologia para voltar à temperatura ambiente. </li><li> Lâminas Mancha usando comotandard protocolo de coloração com hematoxilina / eosina. <ol><li> Colocar as lâminas em porta-lâminas. </li><li> Rack de Transferência com slides entre as soluções na seguinte ordem: </li><li> 2 segundos em água corrente. </li><li> 3 min em solução de hematoxilina filtrada. </li><li> 10 seg em água corrente. </li><li> 10 seg em água destilada. </li><li> 10 seg em etanol a 100%. </li><li> 2 s em eosina filtrada. </li><li> 10 seg em água corrente. </li><li> 10 seg em etanol a 100% </li><li> 2 min em xileno x 3 (banho de I, II, III). </li><li> Transfira imediatamente e adicione algumas gotas de cola de fixação para cada slides, lugar tampa de deslizamento em cima, remova as bolhas de ar, deixe secar por algumas horas. </li><li> Imagem desliza sob um padrão de microscópio de luz branca. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Os modelos animais são extremamente importantes para a pesquisa patogênese bacteriana. É impossível imitar totalmente o ambiente in vivo em cultura de células e está se tornando evidente que a interação patógeno-hospedeiro é influenciado por muitos fatores dinâmicos. A especificidade humana de alguns agentes patogénicos clinicamente importantes, tais como N. meningitidis, HIV, HCV, o Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi e tem limitado a utilização de modelos in vivo para estas infecções. No entanto, quando começamos a compreender que medidas infecciosos estão envolvidos na especificidade, modelos humanizados estão sendo desenvolvidos. O protocolo aqui descrito é uma demonstração deste com a introdução de microvasos humanos em ratos, permitindo extensa infecção in vivo com N. meningitidis, resultando em dano vascular e, ocasionalmente, o desenvolvimento de erupções purpúricas. Usando esse modelo,temos sido capazes de definir que as propriedades adesivas da Tfp estão envolvidos na colonização vascular in vivo usando mutantes bacterianos e que a lesão vascular é reduzido na ausência de aderência 18. Anteriormente, circulam produtos bacterianos foram implicados neste danos, mas os nossos resultados sugerem um papel decisivo para a aderência vascular local e colonização. Isso abre novas possibilidades para o desenvolvimento de metas romance de tratamento. Se a adesão de bactérias patogênicas pode ser bloqueada farmacêutico que poderia prevenir o desenvolvimento de lesões dérmicas e levar a melhores resultados para os sobreviventes meningocócica em termos de necrose tecidual, debridamento e amputações. O trabalho demonstrou também a complexidade da infecção e com o envolvimento da resposta imune e da cascata de coagulação. Identificamos sinalização de citocina humana no soro dos camundongos infectados apesar da quantidade relativamente pequena de endotélio humano presente 18.Isto indicou uma resposta significativa de citocinas, juntamente com a infiltração de populações de células imunes de ratinho na área. Os modelos animais pode, naturalmente, nunca replicar totalmente a doença humana e todos os resultados obtida a partir deles deve ser considerada com isso em mente. Por exemplo, neste modelo, o sangue e as células circulantes são de origem em ratinho e não podemos excluir que podem comportar-se de maneira diferente para as células humanas. Uma vantagem desta entanto, como demonstrado na nossa recente publicação 18, é a capacidade de diferenciar de sinalização provenientes do endotélio humano a partir de que as células circulantes rato. O fundo imunocomprometidos dos ratos utilizados neste modelo também permite a transferência alogênico de populações de células do sistema imunológico humano, acrescentando mais um &#39;humanização&#39; aspecto. O fundo dos ratinhos imunocomprometidos podem no entanto mascarar um papel para as células NK, T e B, os quais são todos falta ou defeito neste modelo. O relativamente short prazo (24 horas) utilizado neste modelo refere-se, principalmente, a resposta inata, mas para infecções de longo prazo eo desenvolvimento de imunidade outras opções podem precisar de ser explorado. A pele é um site de infecção importante para N. meningitidis, mas ter uma quantidade relativamente pequena de vasos humanos significa também que extrapolar os dados para uma infecção sistêmica, envolvendo vários órgãos é difícil. Embora este modelo permite o estudo de desenvolvimento da lesão cutânea, passos importantes de infecção meningocócica, tais como epiteliais e sangue-cérebro atravessamento não estão incluídos. O desenvolvimento destes modelos humanizados é necessário endereçar esses outros aspectos da infecção. No entanto, este modelo oferece um grande potencial para vários patógenos específicos humanos, particularmente aquelas voltadas para os vasos sanguíneos.

Sepsis meningocócica é uma infecção do sangue nascido frequentemente fatal, causada pelo patógeno bacteriano Neisseria meningitidis. Pacientes com sepse meningocócica freqüentemente presente com uma erupção petequial ou purpúrica em sua pele que tenha sido previamente associado com a destruição vascular causada por bactérias que circulam e produtos bacterianos 1. Biópsias de pele de pacientes clínicos mostram bactérias associadas com microvasos, muitas vezes preenchendo os vasos 2. Para além da bactéria, trombose extensa, coagulação, e congestão vascular vazamento é visto nas regiões purpúricos 3-5. Este dano vascular pode conduzir a uma extensa necrose da pele e dos tecidos envolventes, resultando em desbridamento e até amputação em sobreviventes de meningococos. Entender como infecção provoca este dano vascular é importante para otimizar as estratégias de prevenção e tratamento. A maioria das pesquisas sobre sepsis meningocócica foi realizada in vitro emlinhas de células humanas devido à especificidade humana de N. meningitidis. Muitos aspectos da infecção foram estudadas in vitro, incluindo a adesão bacteriana, a resposta da célula hospedeira, assim como a resposta citocina 6-9. Pili de tipo IV (PTF) têm sido implicadas como a principal organelo aderência for N. meningitidis em ambas as células epiteliais e endoteliais 10. Tem também sido demonstrado que a adesão de N. meningitidis às células hospedeiras é tensão de cisalhamento dependente e, portanto, é pensado para ser relacionado com as taxas de fluxo de sangue na microcirculação 11. Isso sugere que as tensões dinâmicas as bactérias enfrentam in vivo são essenciais para a patogênese. No entanto, é muito difícil de modelar o microambiente de pequenos vasos in vitro. O receptor de adesão para Neisseria Tfp é ainda desconhecido e, por conseguinte, as estratégias knock-in para conseguir a aderência bacteriana em um modelo animal não pode ser previsto neste momento. CD46 foi sugerida para ser o receptor Tfp e animais transgénicos foram produzidas para agir como modelos de ratos. No entanto, a infecção nestes animais não leva à infecção extensa ou a erupção desenvolvimento 12,13. Outros modelos animais, que foram descritas para o aspecto de bacteremia de infecção por Neisseria ter em conta a preferência de bactérias para a transferrina humana como fonte de ferro 14,15. Quer completando a transferrina humana ou expressá-lo a partir de um transgene que resulta num aumento da carga bacteriana no fluxo de sangue ao longo de um período de tempo prolongado, mas este modelo não mostra nenhuma aderência bacteriana ou desenvolvimento erupção 16,17. Neste protocolo, descrevemos um modelo humanizado rato em que a pele humana, incluindo a microcirculação cutânea, é transplantado em ratos imunocomprometidos 18,19. Isto resulta em vasos humanos funcionais, perfundidos com a circulação do rato. Combinado com a suplementação da transferrina humana, este modelo responsável por, pelo menos, dois dos aspectos específicos humanos de N. meningitidis, ie endotélio humano e transferrina humana, em um ambiente in vivo. N. meningitidis introduzido por via intravenosa neste modelo aderem especificamente ao endotélio humano, a produção de uma patologia que é semelhante ao que é relatado em pacientes clínicos, incluindo os danos vasculares e desenvolvimento erupção purpúrica 18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31885-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:161px;">Virbac France&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">LOT N&#176;VAL4243</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylazine</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Bayer Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">AMM N&#176; FR/8146715 2/1980</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">LOT N&#176; KPO809S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">(Rompun 2%)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:247px;">Optigel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Europhta</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Medicament autoris&#233; N&#176;3400933521134</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lacrigel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tronothane</td>
			<td style="width:161px;">Lisa Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:247px;">GC agar Base</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Conda</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">1106</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human endothelium SFM media</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:161px;">P A A</td>
			<td style="width:119px;">A15-101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human transferrin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">UEA lectin - rhodamine</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">RL-1062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Eosin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4009&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylene</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">534056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Equiptment Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sober Hand Dermatome</td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Animal housing</td>
			<td style="width:161px;">Innovive</td>
			<td style="width:119px;">M-BTM-C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Biopsy punch (4 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Dominic Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">30737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fast-Prep lysing matrix M tubes</td>
			<td style="width:161px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">116923050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer Green Beads</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358941001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond</td>
			<td style="width:161px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">OCT tissue tek</td>
			<td style="width:161px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

Neisseria meningitidis provoca uma sepse grave, freqüentemente fatal quando ele entra na corrente sanguínea humana. A infecção leva a danos dos vasos sanguíneos, resultando em vazamento vascular, o desenvolvimento de erupções purpúricas e eventual necrose tecidual. Estudando a patogénese da infecção foi previamente limitada pela especificidade humana das bactérias, o que torna difícil em modelos in vivo. Neste protocolo, descrevemos um modelo humanizado para esta infecção em que a pele humana, contendo microvasos dérmicas, é enxertado em ratos imunocomprometidos. Estes vasos anastomosam com a circulação do mouse, mantendo suas características humanas. Uma vez introduzida neste modelo, N. meningitidis aderir exclusivamente para os vasos humanos, resultando em grande dano vascular, inflamação e, em alguns casos, o desenvolvimento de erupção purpúrica. Este protocolo descreve os passos do miocárdio, infecção e avaliação deste modelo no context de N. infecção meningitidis. A técnica pode ser aplicada a vários patógenos específicos humanos que infectam a corrente sanguínea.

Contagem de CFU O N. meningitidis tensão usada nesses resultados representativos é N. meningitidis 8013 clone 12, um isolado clínico sorogrupo C, expressando uma classe I SB pilin, Opa -, Opc -, PilC1 + / PilC2 + 20. A cepa foi projetado para expressar a proteína fluorescente verde (GFP) de uma inserção cromossômica 18. Formadoras de colónias contagem de unidades bacterianas são estabelecidas por contagem do número de colónias nas placas de agar e o cálculo ou UFC / ml de sangue ou de CFU / mg de tecido a partir de volumes conhecidos plaqueadas. Contagens de sangue mostraram que 5 minutos após a injecção intravenosa de 10 6 CFU de bactérias, houve uma média de 1,5 x 10 5 CFU / ml em circulação no sangue (Figura 1A). Após 6 horas a contagem média de 4,8 x 10 4 CFU / mL. Por 24 horas as contagens médias foram de 2,4 x 10 4 CFU / ml, mas neste grupo de 10 ratinhos, 5 tinhamnão detectável bactérias circulantes, enquanto os restantes 5 tinham contagens relativamente elevadas (Figura 1A). Contagens de UFC tomadas a partir das amostras de pele demonstram que a maioria dos ratinhos possuindo contagens consideráveis ​​na pele humana, em média 2,1 x 10 4 CFU / mg de tecido em 6 horas e 4,4 x 10 2 CFU / mg de tecido em 24 horas (Figura 1B) . As amostras de pele de rato contralateral não mostrou contagens bacterianas às 24 horas e apenas um número muito baixo de 6 horas, o que demonstra a forte preferência por N. meningitidis aos vasos humanos na pele enxertada (Figura 1B). Em geral, as contagens bacterianas foram muito baixas para não detectáveis ​​em outros órgãos amostrados embora dois animais mostrou que as contagens podem ser atribuídas a contaminação a partir do sangue, como se correlacionam com elevado número de bactérias em circulação (Figura 1C). O modelo pode também ser utilizado para determinar o papel dos factores de virulência in vivo, por exemplo, o tipo IV pili. As estirpes bacterianas com mutações definidas no gene pilD 21, resultando numa estirpe sem Tfp, bem como o gene pilC1 8, em que o proposto Tfp &#39;adesina&#39; foram introduzidas no modelo. Estas mutações resultou em nenhuma adesão bacteriana no enxerto de pele humana, o que confirma o papel crucial Tfp está a desempenhar na adesão in vivo (Figura 1D). Imunohistoquímica / Histologia Nestas experiências utilizou-se N. cepas meningitidis que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) para permitir a detecção de fluorescência, sem a necessidade de coloração secundário. Vasos humanos foram coradas utilizando um marcador de endotélio humano, ou CD31 (PECAM-1) ou a lectina Ulex europaeus aglutinina (UEA) 18,22. A UEA foi conjugado com rodamina permitindo a coloração de uma etapa (Figuras 2A-C). Núcleos celulares podem ser manchared com DAPI para ajudar a identificar as estruturas de tecidos (Figuras 2A-B). Histologia foi realizada utilizando uma coloração hematoxilina / eosina padrão. A fronteira epiderme / dérmica da pele é claramente identificável. A inflamação, trombose vascular e vazamento foram concentradas para vasos perto deste rebordo 24 horas após a infecção (Figura 2D). Trombose era visível em vários pequenos vasos da derme, muitas vezes acompanhados por congestão e inflamação. O vazamento de células vermelhas do sangue para os tecidos pode ser vista, indicando um extenso grau de dano do vaso. A histopatologia da pele enxertada em camundongos não infectados parecia normal, sem inflamação distinguíveis 18. Em cerca de 30% das infecções aderência bacteriana na pele conduz ao desenvolvimento de púrpura macroscopicamente detectável (figuras 2E e 2F). <img alt="Figura 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Contagens de UFC. (A) a contagem bacteriana UFC por ml de sangue em 5 min, 6 horas e 24 horas após a infecção. (B) em bactérias CFU conta a partir de amostras de pele comparando a pele humana (HS) e da pele do rato (MS) em ambas as 6 horas e 24 horas após a infecção. (C) bacteriana UFC conta de outros órgãos tomada 24 horas após a infecção. (D) Comparando contagens de UFC de bactérias a partir de amostras de pele humana e de rato tomadas na infecção pós 24 horas a partir de camundongos infectados com o tipo selvagem N. meningitidis 2C43 mancha (WT), uma estirpe com uma mutação no gene pilD (pilD) ou uma estirpe com uma mutação no gene pilC1 (pilC1). Todos os gráficos são apresentados como dados brutos, com mediana. A figura é uma modificação de Melican et al. 18&quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> Figura 2. Microscopia. (A) Projeção de uma pilha confocal mostrando uma microvasos humano corado com lectina UEA (vermelho) perto do dérmica (d) epidérmico (e) fronteira. O vaso está infectado com N. meningitidis (verde) 2 horas após a infecção. (B) Uma fatia óptica e uma projeção fatia (C) mostrando N. infecção microcolônias meningitidis (verde) um vaso humano (UEA - vermelho) dentro de uma infecção da pele enxerto 2 horas post. (D) Hematoxilina / eosina de enxerto de pele humano infectado por 24 horas com N. meningitidis. A epiderme (e), dérmico (d) fronteira é claramente trombose e congestionamento de microvess visível e extensaels (setas) é visto na derme. Inflamação e algum vazamento vascular (ponta de seta) pode também ser identificado. (E) enxerto de pele humana antes da infecção. (F) O mesmo enxerto de pele como (E) 24 horas após a infecção com N. meningitidis mostrando regiões purpúricas (setas). Figuras 2B, 2D, 2E, 2F e são modificadas a partir de Melican et al. 18 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis é um patógeno específico humano que infecta os vasos sanguíneos. Neste protocolo microvasos humanos são introduzidos em um rato por enxertia de pele humana em ratos imunocomprometidos. As bactérias aderem extensivamente para os vasos humanos, levando a danos vasculares e desenvolvimento da erupção purpúrica normalmente observada em casos em humanos.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Research

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