Name: rapid and efficient zebrafish genotyping using pcr with high-resolution melt analysis
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis at JoVE.com

Мы благодарим членов Бляшке, Grunwald, и Wittwer лаборатории для консультаций и технической помощи. Эта работа проводится при поддержке PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 и DP2 MH100008, и марте Dimes Foundation исследовательский грант № 1-FY13-425, к JLB.

1. Подготовка ДНК <ol><li> Подготовка ДНК лизирующего буфера: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Добавить свежий протеиназу К до конечной концентрации 1 мг / мл в день использования 12. </li><li> Коллекция тканей: <ol><li> Для взрослого клипа рыбы плавников: <ol><li> Обезболить рыбу: Поместите р...

<ol>
	<li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs.">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li><li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+(HRMA):+more+than+just+sequence+variant+screening.">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li><li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome.">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li><li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons.">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li><li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping:+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes.">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li><li>Carrillo, J., Mart&#237;nez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita.">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li><li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melt+analysis+(HRMA);+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping.">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li><li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method.">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li><li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding.">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li><li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns.">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li><li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping.">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li><li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen.">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li><li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+(MS-HRMA)+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples.">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li><li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles:+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry.">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li></ol>

ПЦР в сочетании с HRMA это мощная технология для рыбок данио генотипирования. Преимущества этого подхода заключаются в его скорость работы, надежность и чувствительность для обнаружения даже точечные мутации. Весь протокол, с трубчато-клипа анализа расплава кривой, может быть выполнена...

Данио рерио (Danio рерио) является позвоночным модель системы широко используются для изучения разработки и моделирования заболевания. В последнее время многие трансгенные и мутации технологии были разработаны для данио. Быстрые методы трансгенеза, как правило, на основе системы транспозонов Tol2 1, были объединены с улучшенными опциями клонирования для многократного монтажа фрагментов ДНК 2. Цинк-пальцевые нуклеазы (ZFNs) и активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) были использованы для локусы в обоих соматических и половых клетках в данио 3,4. Эти методы могут эффективно генерировать генетически модифицированных животных, с созданием мутаций высокочастотной и передачи зародышевой линии 3,4. Несмотря на эти успехи, традиционные методы генотипирования на рыбках данио ограничить всю мощь мутагенеза и трансгенеза инструментов. ПЦР с последующей гель-электрофореза, иногда в сочетании с ОГРАНИЧЕНИЯн фермент пищеварение, широко используется для обнаружения изменения генома, но требует много времени и менее чувствительны, чтобы определить небольшие вставки или делеции. TaqMan зондов анализы имеют высокие первоначальные затраты и требуют тщательной оптимизации. Секвенирование продуктов ПЦР может занять несколько дней и не практично для крупномасштабной проверки. Анализ длина Ограничение фрагмент полиморфизм (ПДРФ) может только различать ОНП, влияющие ограниченный диапазон сайтов рестрикции фермента распознавания. Анализ высокого разрешения плавления (HRMA), метод анализа пост-ПЦР закрытого трубка, является недавно разработанный метод, который является быстрым, чувствительным, недорогой и поддаются скрининга большого количества образцов. HRMA может быть использован для обнаружения полиморфизмов, мутации и трансгены 5-7. HRMA основана на тепловой денатурации двухцепочечных ДНК, и каждый ПЦР ампликона имеет уникальный диссоциации (расплава) характерный 5. Образцы могут подвергаться дискриминации из-за то их различный состав нуклеотидов, содержание GC, или длина, как правило, в сочетании с флуоресцентным красителем, который связывается только двухцепочечной ДНК 8. Таким образом, HRMA можно выделить различные генотипы на основе различных характеристик расплава кривой. Поскольку HRMA использует недорогие реагенты и состоит из одного этапа после ПЦР, она может быть использована для стратегий высокой пропускной. HRMA является неразрушающим, так что следующее анализа ампликонов ПЦР могут быть использованы для других приложений. HRMA была применена во многих организмов и систем, в том числе клеточных линий, мышей и человека 9-11. Его использование в последнее время были описаны у рыбок данио для обнаружения мутаций, вызванных цинкового пальца нуклеаз (ZFNs) и Talens 6,12,13. В этой статье мы расскажем, как выполнять на основе ПЦР HRMA в эмбриональном и взрослых данио (рис. 1). Этот протокол подходит для обнаружения ОНП, трансгены, и мутации, в том числе сиngle изменения базового пара, вставки или удаления.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">100 Reaction LightScanner Master Mix</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;">HRLS-ASY-0002</td>
			<td style="width:157px;">www.biofiredx.com</td>
			<td style="width:167px;">Store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:141px;">HSP9665</td>
			<td>www.bio-rad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Microseal &#39;B&#39; Adhesive Seals</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:141px;">MSB1001</td>
			<td>www.bio-rad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">96-Well LightScanner Instrument</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;">LSCN-ASY-0040</td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">LightScanner Software with Call-IT 2.0</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">High-Resolution Melting Analysis 2.0</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">LightScanner Primer Design Software</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Vector NTI Software</td>
			<td style="width:145px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.invitrogen.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tricaine</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient zebrafish genotyping using pcr with high-resolution melt analysis

Данио рерио является мощным позвоночных модельной системой для изучения развития, моделирования заболевания, а также выполнение скрининга препарата. Недавно целый ряд генетических инструментов были введены, в том числе несколько стратегий вызывая мутации и получения трансгенных линий. Однако масштабное обследование ограничивается традиционными методами генотипирования, которые много времени и трудоемким. Здесь мы опишем технику для анализа данио генотипов от ПЦР в сочетании с анализом высокого разрешения плавления (HRMA). Этот подход является быстрым, чувствительным и недорогой, с более низким риском артефактов загрязнения. Генотипирование с помощью ПЦР с HRMA могут быть использованы для эмбрионов или взрослых рыб, в том числе в скрининговых протоколах высокой пропускной.

Протокол может быть выполнена в течение одного дня или разделены с шагом в течение нескольких дней (блок-схема работы показан на рисунке 1). Выделение ДНК следуют расплава и анализа ПЦР ампликонов. Температуры для расплава ампликона зависеть от размера и GC-содержания, но обычно...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis at JoVE.com

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

ПЦР в сочетании с анализом расплава с высоким разрешением (HRMA) демонстрируется в качестве быстрого и эффективного метода для генотипа данио.

Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Быстрое Генотипирование Мышь ткани с помощью Сигмы Извлечение-N-Amp тканей PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Данио рерио Всего горе высокого разрешения двумя люминесцентными В Ситу Гибридизация

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Быстрые ПЦР термоциклирования использованием Микромасштабные тепловой конвекции

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

ПЦР-метод генотипирования различать дикого типа и декоративных многообразия Императы цилиндрической</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Эффективной и быстрой изоляции на ранней стадии эмбрионы из<em&gt; Arabidopsis THALIANA</em&gt; Семена

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Высокое разрешение Всего горе<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в Эмбрионы рыбок данио изучить экспрессию генов и функции

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Экспресс-анализ и разведка флуоресцентной микроскопии Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...