Name: differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

De auteurs danken Teele Palumaa voor hulp bij de cijfers. Gefinancierd door Project Grant 1008046 van de National Health and Medical Research Council, Australië.

1. Gedissocieerde Hippocampale Neuron Cultuur <ol><li> Bereid dekglaasjes (borosilicaatglas): <ol><li> Was in 100% ethanol. </li><li> Droging onder UV-bestraling. </li><li> Coat met Poly-D-lysine (0,5 mg / ml in 0,15 M boraatbuffer, overnacht bij 4 ° C). </li><li> Op de volgende dag (dag van cultuur) Was 3x in PBS smeer met laminine (2,5 ug / ml, natuurlijke muis laminine) + 5% v / v warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) verdund in PBS gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Ontleden embryonale dag ...

<ol>
	<li>Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins.">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li><li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression.">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li><li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons.">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li><li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines.">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li><li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures.">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li><li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture.">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li><li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+reversible,+activity-dependent+dendrite+formation.">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li><li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP.">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li><li>Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity.">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li><li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1/NgCAM+trafficking.">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

De hier beschreven techniek complementair is aan die van celoppervlak biotinylering (beoordeeld door Arancibia-Cárcamo et al..) 12 en is de voorkeursmethode voor het bewaren van gegevens over de subcellulaire lokalisatie van de geïnternaliseerde proteïne, mits een geschikt primair antilichaam aan een extracellulaire epitoop beschikbaar. Bovendien kan kwantificering van proteïne transport / internalisatie tijd worden uitgevoerd (door het vaststellen dekglaasjes gedurende verschillende levende cel ...

Bij het ​​vaststellen van de functie van nieuw geïdentificeerde eiwitten, kan onderzoek naar de subcellulaire lokalisatie van en handel van het eiwit in kwestie belangrijke aanwijzingen over de mogelijke rol / s van het eiwit 1,2 bieden. Bioinformatica analyse van de transcriptome van de zich ontwikkelende neocortex 3 gaf ons een lijst van genen veranderde expressie vertonen in de hersenen van muizen corticogenesis. Vervolgens heeft een knockout benadering vast te stellen dat het eiwit gecodeerd door een van deze genen, sez6, heeft een belangrijke rol in neuron ontwikkeling. We zagen dat de beslaglegging gerelateerde gen 6 of Sez6, eiwit in de ontwikkeling dendrieten en is ook aanwezig in dendritische gespecialiseerde structuren dendrieten ontvangt en integreert prikkelende signalen. Bovendien, wanneer dit eiwit ontbreekt, dendrieten en exciterende synapsen niet goed 4 vormen. De waarschijnlijke overheersende isovorm van het eiwit kenmerken van een transmembrane receptor hoewel, wanneer de subcellulaire verdeling van immunologisch eiwit werd onderzocht door confocale microscopie of immuno-elektronenmicroscopie meeste, zo niet alle, van het signaal bleek geassocieerd met kleine blaasjes in het somatodendritische compartiment met weinig of geen eiwit, dat op de plasmamembraan aan het celoppervlak. Om definitief te tonen dat dit vermeende receptor met een voorspeld extracellulair domein groot is verhandeld naar de plasmamembraan, we levende cellen benadering vastgesteld middels het antiserum we hadden gegenereerd aan een extracellulaire deel van het eiwit aan eiwit label op het celoppervlak. Door deze &quot;antilichaam feeding&quot; benadering twee toepassingen van differentieel-gelabelde secundaire antilichaam gescheiden door een uitgebreide blokkering stap en permeabilisatie stap konden we twee verschillende pools van eiwit onderscheidt identificeren door binding aan fluorescent gelabelde secundaire antilichamen onderdelen verschillende tlent tags. Zo konden wij eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in het antilichaam incubatiestap uit eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode onderscheiden. Met deze methode, hebben we vastgesteld dat het eiwit van belang wordt verhandeld en naar het celoppervlak in neuronen. Daarom deze relatief snelle en eenvoudige techniek bleek informatiever dan traditionele methoden immunocytochemie of pre-embedding immunogoud elektronenmicroscopie, hoewel we gebruikten dezelfde konijnen polyklonaal antiserum voor al deze technieken. Deze techniek is algemeen toepasbaar op elke transmembraan eiwit bood een goede antilichaam dat extracellulair domein epitopen beschikbaar. De techniek is al eerder gebruikt om receptor handel van de glutamaat receptor subeenheid GluR1 5 bestuderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

Om het celoppervlak lokalisatie van een vermoedelijke transmembraan receptor in gekweekte neuronen demonstreren we de gemerkte eiwit op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek primair antilichaam opgewekt tegen een extracellulair gedeelte van het eiwit. Aangezien receptoren worden verhandeld en naar de oppervlakte, wanneer cellen permeabel na fixatie dan zowel celoppervlak en interne eiwit wordt gedetecteerd door dezelfde gelabelde secundaire antilichaam. Hier passen wij een methode om eiwittransport (&quot;antilichaam feeding&quot;) bestuderen labelen eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in de antilichaam incubatiestap en eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode differentieel . De mogelijkheid om deze twee zwembaden van eiwit te onderscheiden werd mogelijk gemaakt door de integratie van een overnachting blokkering stap met sterk geconcentreerde ongelabelde secundair antilichaam na een eerste broen van unpermeabilized neuronen met een fluorescent gelabelde secundaire antilichaam. Na de blokkeringsstap, permeabilisatie van de neuronen toegestane detectie van de geïnternaliseerde zwembad met een fluorescent gelabeld secundair antilichaam met een andere fluorofoor. Met deze techniek konden we belangrijke informaties subcellulaire locatie van dit vermeende receptor verkrijgen, onthullen dat het inderdaad verhandeld het celoppervlak in neuronen. Deze techniek is breed toepasbaar op verschillende celtypes en cel-oppervlakte-eiwitten, die een passend antilichaam aan een extracellulair epitoop beschikbaar.

De dual-color fluorescent immunokleuring techniek hier gepresenteerde bruikbaar voor het labelen van extracellulaire domeinen van transmembraan eiwitten in levende cellen (schematisch getoond in Figuur 1). Gedurende de incubatieperiode, de immunoglobulinen binden toegankelijke epitopen en een deel van de populatie van eiwitmoleculen met gebonden antilichaam wordt endocytose. Bovendien kunnen nieuw gesynthetiseerde eiwit het celoppervlak bereiken via voren handel en gerecycleerd eiwitmoleculen kunnen wor...

Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Het induceren van dendritische groei in gekweekte sympathische neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Membraanpotentiaal Dye beeldvorming van ventromedial hypothalamus neuronen van volwassen muizen om te studeren Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...