Name: differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

Les auteurs remercient Teele Palumaa d&#39;assistance avec les chiffres. Financé par le projet Grant 1008046 du Conseil de recherches médicales, en Australie Santé nationale et du.

Une. Dissociée de l&#39;hippocampe Neuron Culture <ol><li> Préparer des lamelles de verre (borosilicate): <ol><li> Laver à l&#39;éthanol à 100%. </li><li> Sécher à l&#39;air sous irradiation UV. </li><li> Manteau de Poly-D-lysine (0,5 mg / ml dans un tampon de borate 0,15 M, pendant une nuit à 4 ° C). </li><li> Le jour suivant (le jour de la culture), laver 3 fois dans du PBS puis enduire de la laminine (2,5 pg / ml, de la laminine de souris normal) + 5% v / v de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur...

<ol>
	<li>Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins.">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li><li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression.">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li><li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons.">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li><li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines.">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li><li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures.">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li><li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture.">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li><li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+reversible,+activity-dependent+dendrite+formation.">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li><li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP.">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li><li>Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity.">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li><li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1/NgCAM+trafficking.">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

La technique décrite ici est complémentaire de celle de la biotinylation de la surface cellulaire (passé en revue par ARANCIBIA-carcamo et al.) 12 et elle est la méthode de choix pour la conservation de l&#39;information au sujet de la localisation subcellulaire de la protéine internalisé, pourvu d&#39;un anticorps primaire approprié pour une épitope extracellulaire est disponible. En outre, la quantification du trafic de protéines / internalisation au fil du temps peut être effectué (en f...

En instituant la fonction des protéines nouvellement identifiées, l&#39;enquête de la localisation subcellulaire et le trafic de la protéine en question peut fournir des indices importants sur le rôle probable / s de 1,2 de protéine. L&#39;analyse bioinformatique du transcriptome du néocortex développement 3 nous a fourni une liste de gènes présentant une expression altérée au cours de cerveaux de souris corticogenèse. Nous avons alors adopté une approche de coup de grâce de gène de s&#39;assurer que la protéine codée par l&#39;un de ces gènes, sez6, a un rôle clé dans le développement des neurones. Nous avons observé que le gène lié à la saisie-6, ou Sez6, la protéine se trouve dans les dendrites en développement et est également présent dans les épines dendritiques, des structures spécialisées sur les dendrites qui reçoivent et intègrent les signaux excitateurs. De plus, lorsque cette protéine est absente, les dendrites et les synapses excitateurs ne parviennent pas à former correctement 4. L&#39;isoforme dominante probable de la protéine présente des caractéristiques d&#39;un transmembranrécepteur de l&#39;e, bien que, lors de la distribution subcellulaire de la protéine immuno-a été examinée par microscopie confocale ou par microscopie immuno plupart, sinon la totalité, du signal apparu associé à de petites vésicules dans le compartiment somato-dendritique avec peu ou pas de protéine marquée sur la membrane plasmique à la surface de la cellule. Afin de montrer définitivement que ce récepteur putatif avec un grand domaine extracellulaire prédit est traite à la membrane plasmique, nous avons adopté une approche de cellules vivantes en utilisant l&#39;antisérum nous avions généré à une portion extracellulaire de la protéine à marquer la protéine à la surface cellulaire. En combinant cette approche &quot;alimentation anticorps&quot; avec deux applications d&#39;anticorps secondaire différentielle marqué séparées par une étape de blocage vaste et une étape de perméabilisation, nous avons pu identifier deux piscines différentes de protéines qui se distinguent par liaison à des anticorps secondaires marqués par fluorescence portant Déess différentetags Ent. Ainsi, nous avons pu distinguer protéine qui avait été intériorisé par endocytose lors de l&#39;étape d&#39;incubation anticorps de la protéine qui soit resté sur la surface de la cellule ou a été victimes de la traite à la surface au cours de cette période. En utilisant cette méthode, nous avons établi que la protéine d&#39;intérêt est un trafic à destination et à partir de la surface cellulaire dans les neurones. Par conséquent, cette technique relativement rapide et simple s&#39;est avéré plus instructif que les méthodes d&#39;immunocytochimie traditionnels ou pré-enrobage microscopie électronique immunologique, malgré le fait que nous avons utilisé le même antisérum polyclonal de lapin pour toutes ces techniques. Cette technique est généralement applicable à n&#39;importe quelle protéine transmembranaire a fourni une bonne anticorps reconnaissant des épitopes de domaines extracellulaires est disponible. La technique a déjà été utilisée pour étudier le trafic de récepteur du récepteur de glutamate GluR1 sous-unité 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

Afin de démontrer la localisation à la surface cellulaire d&#39;un récepteur transmembranaire putatif dans des neurones en culture, nous avons appelé la protéine sur la surface des neurones vivants avec un anticorps primaire spécifique dirigé contre une portion extracellulaire de la protéine. Étant donné que les récepteurs sont victimes de trafic vers et depuis la surface, si les cellules sont perméabilisées puis après fixation à la fois à la surface cellulaire et la protéine interne sera détecté par le même anticorps secondaire marqué. Ici, nous avons adapté une méthode utilisée pour étudier le trafic de la protéine («d&#39;alimentation d&#39;anticorps») de façon différentielle des protéines de l&#39;étiquette qui a été internalisée par endocytose au cours de l&#39;étape anticorps d&#39;incubation et de protéines qui soit resté sur la surface de la cellule ou est d&#39;un trafic à la surface au cours de cette période, . La capacité de distinguer ces deux groupes de protéines a été rendu possible grâce à l&#39;incorporation d&#39;une étape de blocage pendant la nuit avec l&#39;anticorps secondaire non marqué très concentré après une incubatio initialen des neurones unpermeabilized avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence. Après l&#39;étape de blocage, la perméabilisation des neurones admis détection de la piscine internalisée avec un anticorps secondaire fluorescent marqué avec un fluorophore différent. Grâce à cette technique, nous avons pu obtenir des informations importantes sur la localisation subcellulaire de ce récepteur putatif, révélant qu&#39;il était, en effet, de la traite à la surface cellulaire dans les neurones. Cette technique est largement applicable à toute une gamme de types de cellules et des protéines de surface cellulaire, en fournissant un anticorps approprié à un épitope extracellulaire est disponible.

La technique d&#39;immuno-coloration fluorescente bicolore présenté ici est utile pour le marquage des domaines extracellulaires des protéines transmembranaires dans des cellules vivantes (représenté schématiquement sur ​​la figure 1). Au cours de la période d&#39;incubation, les immunoglobulines se lient les épitopes accessibles et une proportion de la population de molécules de protéine, conjointement avec l&#39;anticorps lié, est endocytose. En outre, la protéine nouvellement synthét...

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Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l&#39;anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l&#39;incubation.

Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

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Neuroscience

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