Name: differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00
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저자는 그림에 대한 지원은 Teele Palumaa 감사합니다. 국립 보건 의학 연구위원회, 호주에서 프로젝트 그랜트 1,008,046 재정 지원.

1. 해리 해마 신경 세포 문화 <ol><li> 커버 슬립 (붕규산 유리)를 준비 : <ol><li> 100 % 에탄올로 세척 할 것. </li><li> UV 조사에 따라 공기 건조. </li><li> 폴리-D-라이신 (4 박 ° C에서 0.15 M 붕산 버퍼에 0.5 ㎎ / ㎖)와 코트. </li><li> 다음 날 (문화의 날) 라미닌으로 다음 코트 PBS에서 3 회 세척에 (2.5 ㎍ / ㎖, 자연 마우스 라미닌) + 5 % V / V를 열 - 불 활성화 된 태아 혈청 (FCS) 2 시간에 대한 PBS에 희석 37 ° C. </li></...

<ol>
	<li>Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins.">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li><li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression.">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li><li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons.">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li><li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines.">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li><li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures.">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li><li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture.">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li><li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+reversible,+activity-dependent+dendrite+formation.">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li><li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP.">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li><li>Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity.">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li><li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1/NgCAM+trafficking.">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

여기에 설명 된 기술은 (가 Arancibia-Càrcamo 등. 리뷰) 세포 표면의 바이오 티 닐화 (12)의 보완이며 그것은 내면화 단백질의 세포 내 현지화에 대한 정보를 보존하기위한 선택의 방법, 적절한 일차 항체에 제공 세포 에피토프를 사용할 수 있습니다. 또, 시간 경과에 단백질 매매 / 내재화의 정량 단백질 추출물을 준비 할 필요없이 (일차 항체와 생균 배양에 걸쳐 서로 다른 시간에 커버 ?...

새로 확인 된 단백질의 기능을 확립, 문제의 단백질의 세포 내 현지화 및 인신 매매의 조사는 단백질 1,2의 가능성이 역할 / S에 대한 중요한 단서를 제공 할 수 있습니다. 개발 신피질 3의 사체의 생물 정보학 분석은 마우스의 뇌 corticogenesis 동안 변경 발현을 보이는 유전자의 목록을 우리에게 제공했다. 우리는 이들 유전자 중 하나 sez6에 의해 코드되는 단백질이 신경 세포의 개발에 중요한 역할을하고 있음을 확인하기 위해 유전자 녹아웃 방식을 채택했다. 우리는 발작 관련 유전자 6, Sez6, 단백질이 개발 수상 돌기에 있으며 또한 돌기 쪽, 수신 및 흥분성 신호를 통합하는 수상 돌기에 전문 구조에 존재하는 것을 관찰했다. 이 단백질이 결여되는 경우 또한, 덴 드라이트 및 흥분성 시냅스 올바르게 (4)을 형성하지 못한다. 단백질의 가능성이 지배적 인 이소는 transmembran의 기능을 가지고 있습니다전자 수용체 immunolabeled 단백질의 세포 내 분포를 공 초점 현미경으로 또는 면역 전자 현미경으로 검사했을 때, 비록 전부는 아니더라도 대부분 신호의 세포막에 표시된 거의, 또는 전혀, 단백질 somatodendritic 구획에있는 작은 소포와 관련된 등장 세포 표면으로. 결정적 예측 대형 세포 외 도메인이 추정되는 수용체는 세포막에 매매되는 것을 보여주기 위하여, 우리는 세포 표면 단백질에 라벨 단백질의 세포 외 부분에 생성 한 항혈청을 사용하여 살아있는 세포 접근법을 채택 하였다. 광범위한 차단 단계와 permeabilization 단계로 구분하여 차별적으로 표지 된 이차 항체의 두 응용 프로그램이 &quot;항체 공급&quot;접근 방식을 결합함으로써, 우리는 형광 표지 된 이차 항체가 다른 fluoresc 베어링 바인딩에 의해 구별 단백질의 두 가지 풀을 식별 할 수 있었다천만에 태그. 따라서, 우리는 하나가 세포 표면에 남아 또는이 기간 동안 표면에 매매 된 단백질로부터의 항체 배양 단계 동안 엔도 사이토 시스에 의해 내부화 되었었다 단백질을 구별 할 수 있었다. 이 방법을 사용하여, 우리는 또한 단백질이 신경 세포에서 세포 표면에과에서 매매되도록 설치했다. 따라서이 비교적 빠르고 간단한 기술은 우리가 이러한 기술에 대해 동일한 토끼 폴리 클로 날 항혈청을 사용한다는 사실에도 불구하고, 기존의 면역 세포 화학 방법 또는 사전 내장 immunogold 전자 현미경보다 더 많은 정보를 증명했다. 이 기술은 세포 외 도메인의 항원을 인식하는 좋은 항체를 사용할 제공하는 횡단 단백질에 일반적으로 적용 할 수있다. 이 기술은 글루타민산 염 수용체에 대한 GluR1 서브 유닛 5 수용체 인신 매매를 연구하기 위해 이전에 사용되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

배양 된 신경에있는 추정상의 막 관통 수용체의 세포 표면 지역화을 입증하기 위해, 우리는 단백질의 세포 외 부분에 대해 발생하는 특정 일차 항체와 라이브 뉴런의 표면에 단백질을 표지. 세포를 고정 후 다음 세포 표면 및 내부 단백질이 동일한 레이블 차 항체에 의해 감지됩니다 permeabilized 경우 수용체가 표면과에서 인신 매매되는 것을 감안할 때. 여기서, 우리는 하나가 세포 표면에 남아 또는이 기간 동안 표면에 매매 된 항체 인큐베이션 단계와 단백질 중에 엔도 사이토 시스에 의해 내부화 되었었다 라벨 단백질을 차별적으로하는 단백질 매매 ( &quot;항체 수유&quot;)을 연구하기 위해 사용되는 방법을 채택 . 단백질의 두 가지 풀을 구별하는 기능은 초기 incubatio 후 고농도의 레이블이없는 차 항체와 하룻밤 차단 단계의 결합을 통해 가능하게되었다형광 표지 된 이차 항체와 unpermeabilized 뉴런의 명. 다른 형광으로 표지 된 형광 차 항체로 내면화 풀의 검출을 허용하는 신경의 차단 단계, permeabilization 후. 우리는 그것이라고 밝혀,이 추정되는 수용체의 세포 내 위치에 대한 중요한 정보를 얻을 수가이 기술을 사용하여, 참으로, 신경 세포의 세포 표면에 인신 매매. 이 기술은 세포 에피토프에 적합한 항체를 제공하고, 세포의 종류와 세포 표면 단백질의 범위에 광범위하게 적용 할 수있는 것은 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 가지 색의 형광 면역 염색 기법 (그림 1에 개략적으로 도시) 살아있는 세포의 막 횡단 단백질의 세포 외 도메인을 라벨에 유용합니다. 인큐베이션 기간 동안, 면역 글로불린은 액세스 에피토프에 결합하고 함께 결합 된 항체와 단백질 분자의 인구의 비율은, endocytosed된다. 또, 새로 합성 된 단백질은 순방향 매매를 통해 세포 표면에 도달 할 수 있고, 재활용 단백질 분자?...

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Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

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FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

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Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

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Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

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교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

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막 성인 쥐에서 Ventromedial 시상 하부 뉴런의 잠재적 인 염료 이미징은 포도당 감지를 연​​구하는

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

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In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...