Name: differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

Os autores agradecem Teele Palumaa para a assistência com os números. Financiado pelo Projeto Grant 1008046 do National Health and Medical Research Council, na Austrália.

1. Dissociated Hippocampal Neuron Cultura <ol><li> Prepare lamelas (vidro borosilicato): <ol><li> Lavar com 100% de etanol. </li><li> Ar seco sob irradiação UV. </li><li> Revestimento com poli-D-lisina (0,5 mg / ml em tampão de borato de 0,15 M, durante a noite a 4 ° C). </li><li> No dia seguinte (dia de cultura) lavar 3x em PBS, em seguida, o revestimento com laminina (2,5 ug / ml, rato natural, laminina) + 5% v / v de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (FCS) diluído em PBS durante 2 horas a 37 ° C. </l...

<ol>
	<li>Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins.">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li><li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression.">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li><li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons.">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li><li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines.">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li><li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures.">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li><li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture.">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li><li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+reversible,+activity-dependent+dendrite+formation.">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li><li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP.">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li><li>Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity.">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li><li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1/NgCAM+trafficking.">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

A técnica aqui descrita é complementar à da biotinilação da superfície celular (revisto por Arancibia-CARCAMO et al.) 12 e é o método de escolha para preservar a informação sobre a localização subcelular da proteína internalizado, proporcionado um anticorpo primário adequado para uma epitopo extracelular está disponível. Em adição, a quantificação de proteína tráfico / internalização ao longo do tempo pode ser realizada (por lamelas, que fixa em diferentes momentos ao longo da...

Ao estabelecer a função das proteínas recém-identificadas, a investigação da localização subcelular e do tráfico da proteína em questão pode fornecer pistas importantes sobre o provável papel / s de 1,2 proteína. Análise bioinformática do transcriptoma do neocórtex desenvolver 3 nos forneceu uma lista de genes que apresentam expressão alterada durante rato corticogenesis cérebro. Em seguida, adoptou uma abordagem gene knockout para determinar que a proteína codificada por um destes genes, sez6, tem um papel chave no desenvolvimento neuronal. Observou-se que o gene relacionado com Apreensão 6, ou Sez6, proteína está localizado em dendritos em desenvolvimento e também está presente nas espinhas dendriticas, as estruturas especializadas em dendritos que recebem e integram sinais excitatórios. Além disso, quando esta proteína está ausente, os dendritos e sinapses excitatórias falhar para formar correctamente 4. A isoforma dominante provável da proteína tem características de um transmembrane do receptor embora, quando a distribuição sub-celular da proteína immunolabeled foi examinada por microscopia confocal ou por microscopia imunoelectrónica a maioria, se não a totalidade, do sinal apareceram associadas a pequenas vesículas no compartimento somatodendrítico com pouco, ou nenhum, proteína marcada na membrana plasmática na superfície da célula. A fim de demonstrar definitivamente que este receptor putativo com um grande domínio extracelular predito é de tráfico para a membrana plasmática, que adoptou uma abordagem em células vivas, utilizando o anti-soro que havia gerado a uma porção extracelular da proteína para identificar a proteína na superfície da célula. Ao combinar esta abordagem &quot;alimentação anticorpo&quot;, com duas aplicações de anticorpo secundário marcado diferencialmente separados por um passo de bloqueio grande e um passo de permeabilização, fomos capazes de identificar dois conjuntos diferentes de proteínas que se distinguem por ligação a anticorpos secundários marcados fluorescentemente rolamento fluores diferenteetiquetas rentes. Assim, nós fomos capazes de distinguir a proteína que tinha sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpos a partir de proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período. Usando este método, foi estabelecido que a proteína de interesse é de tráfico de e para a superfície da célula em neurónios. Portanto, essa técnica relativamente rápido e simples mostrou-se mais informativo do que os métodos tradicionais ou imunocitoquímica microscopia eletrônica de imuno pré-incorporação, apesar do fato de que usamos o mesmo anti-soro policlonal de coelho para todas estas técnicas. Esta técnica é geralmente aplicável a qualquer proteína transmembranar prevista uma boa anticorpo que reconhece os epítopos de domínio extracelular é acessível. A técnica tem sido utilizada anteriormente para estudar o tráfico do receptor do receptor de glutamato GluR1 subunidade 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

A fim de demonstrar a localização da superfície da célula de um receptor transmembranar putativo em neurónios em cultura, que marcado a proteína na superfície dos neurónios vivos com um anticorpo primário específico criado contra uma porção extracelular da proteína. Dado que os receptores são de tráfico de e para a superfície, se as células são permeabilizadas após a fixação, em seguida, tanto na superfície celular e da proteína interna irá ser detectada pelo mesmo anticorpo secundário marcado. Aqui, nós adaptamos um método utilizado para estudar o tráfico de proteína (&quot;alimentação anticorpo&quot;) para a proteína diferencialmente etiqueta que tinham sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpo e proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período . A capacidade de distinguir estas duas piscinas de proteína tornou-se possível através da incorporação de um passo de bloqueio durante a noite com anticorpo secundário sem rótulo altamente concentrada após um incubatio inicialn de neurónios unpermeabilized com um anticorpo secundário marcado por fluorescência-. Após o bloqueio de fase, a permeabilização dos neurónios permitiram a detecção da piscina internalizado com um anticorpo secundário fluorescente marcada com um fluoróforo diferente. Usando esta técnica nós fomos capazes de obter informações importantes sobre a localização subcelular deste receptor putativo, revelando que ele era, de fato, traficadas para a superfície celular em neurônios a. Esta técnica é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células e proteínas da superfície celular, proporcionando um anticorpo adequado para um epitopo extracelular está disponível.

A dupla cor técnica imunocoloração fluorescente aqui apresentado é útil para a marcação de domínios extracelulares de proteínas transmembranares, em células vivas (mostrado esquematicamente na Figura 1). Durante o período de incubação, as imunoglobulinas ligam epítopos acessíveis e uma parte da população das moléculas de proteína, juntamente com o anticorpo ligado, é sujeita a endocitose. Além disso, a proteína sintetizada pode atingir a superfície da célula através de tráfico ...

Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.

Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Neurociência

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...