Name: differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

Författarna tackar Teele Palumaa för hjälp med figurerna. Finansierat av projektbidrag 1008046 från det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet, Australien.

1. Dissocierade hippocampus Neuron Kultur <ol><li> Förbered täckglas (borosilikatglas): <ol><li> Skölj i 100% etanol. </li><li> Lufttorka under UV-bestrålning. </li><li> Coat med poly-D-lysin (0,5 mg / ml i 0,15 M boratbuffert, över natten vid 4 ° C). </li><li> På nästa dag (dagen för odling) tvätta 3x i PBS sedan belägga med laminin (2,5 | ig / ml, naturlig muslaminin) + 5% volym / volym värmeinaktiverat fetalt kalvserum (FCS), spädd i PBS under 2 h vid 37 ° C. </li></ol></li><li> Dissekera embryonala d...

<ol>
	<li>Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins.">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li><li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression.">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li><li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons.">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li><li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines.">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li><li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures.">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li><li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture.">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li><li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+reversible,+activity-dependent+dendrite+formation.">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li><li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP.">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li><li>Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity.">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li><li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1/NgCAM+trafficking.">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

Den teknik som beskrivs här är komplementär till den hos cellyte-biotinylering (översikt av Arancibia-Carcamo et al.) 12 och det är den metod som föredras för bevarande av information om den subcellulära lokaliseringen av det internaliserade proteinet, förutsatt att en lämplig primär antikropp till en extracellulär epitop är tillgänglig. Dessutom kan utföras kvantifiering av protein trafficking / interna med tiden (genom att fixera täckglas vid olika tidpunkter under hela levande cell...

Vid upprättande av funktionen av nyligen identifierade proteiner, kan utredning av subcellulära lokalisering och handel av proteinet i fråga ge viktiga ledtrådar om den troliga roll / s av proteinet 1,2. Bioinformatisk analys av transcriptome av utvecklings neocortex 3 försett oss med en lista av gener som uppvisar förändrat uttryck under mushjärna corticogenesis. Vi antog då en gen knockout tillvägagångssätt för att fastställa att det protein som kodas av en av dessa gener, sez6, spelar en viktig roll i neuronutveckling. Vi observerade att beslag relaterad gen 6, eller Sez6, protein ligger i utvecklings dendriter och är också närvarande i Dendritutskotten, specialiserade strukturer på dendriter som tar emot och integrera excitatoriska signaler. Dessutom, när detta protein saknas, dendriter och retande synapser misslyckas med att bilda korrekt 4. Den troliga dominerande isoformen av proteinet har funktioner i en transmembrane-receptorn även när subcellulära fördelningen av immunolabeled proteinet undersöktes genom konfokalmikroskopi eller immunelektronmikroskopi mikroskopi de flesta, om inte alla, av signalen visades i samband med små blåsor i somatodendritisk fack med liten, eller ingen, protein märkt på plasmamembranet vid cellytan. För att slutgiltigt visa att detta förmodade receptorn med en förutsedd stor extracellulär domän trafikeras till plasmamembranet, antog vi en live-cell tillvägagångssätt med användning av antiserum som vi hade genererat till en extracellulär del av proteinet för att märka proteinet på cellytan. Genom att kombinera detta &quot;antikropp matning&quot; strategi med två tillämpningar av differentiellt märkt sekundär antikropp åtskilda av en omfattande blockeringssteg och en permeabilization steg, kunde vi identifiera två olika pooler av protein utmärker sig genom att binda till fluorescerande-märkta sekundära antikroppar som bär olika fluorescerent-taggar. Därmed kunde vi urskilja protein som hade internaliseras av endocytos under antikropps inkuberingssteget från protein som antingen varit på cellytan eller blivit offer för människohandel till ytan under denna period. Med användning av denna metod har vi konstaterat att det intressanta proteinet utsätts för handel till och från cellytan i neuroner. Därför denna relativt snabb och enkel teknik visat sig vara mer informativ än traditionella immunocytokemi metoder eller pre-inbäddning immunoguld elektronmikroskopi, trots det faktum att vi använde samma polyklonalt kaninantiserum för alla dessa tekniker. Denna teknik är allmänt tillämpbar på alla transmembranprotein som en bra antikropp som igenkänner den extracellulära domänen epitoper är tillgänglig. Tekniken har tidigare använts för att studera receptor trafficking av glutamatreceptorn GluR1 subenhet 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

För att demonstrera den cellyte-lokalisering av en förmodad transmembranreceptor i odlade neuroner, vi märkt protein på ytan av levande neuroner med en specifik primär antikropp som tagits fram mot en extracellulär del av proteinet. Med tanke på att receptorerna är trafikerade till och från ytan, om cellerna permeabiliserades efter fixering då både cellytan och den inre protein kommer att detekteras av samma märkt sekundär antikropp. Här anpassade vi en metod som används för att studera protein trafficking (&quot;antikropp matning&quot;) för att differentiellt etikett proteinet som hade blivit internaliseras av endocytos under antikropp inkubationssteg och protein som antingen varit på cellytan eller trafikerades med ytan under denna period . Förmågan att skilja dessa två pooler av protein blev möjligt genom att införliva en övernattning blockeringssteg med hög-koncentrerad omärkt sekundär antikropp efter en initial incubation av unpermeabilized nervceller med en fluorescensmärkt sekundär antikropp. Efter blockeringssteget, permeabilisering av neuronerna som tillåts detektion av det internaliserade poolen med en fluorescerande sekundär antikropp märkt med en annan fluorofor. Med denna teknik kunde vi få viktig information om subcellulära placeringen av denna förmodade receptor, och avslöjar att det var, ja, smugglas till cellytan i nervceller. Denna teknik är allmänt tillämpbar på en rad olika celltyper och cellyteproteiner, som ger en lämplig antikropp mot en extracellulär epitop är tillgänglig.

Den tvåfärgad fluorescerande immunfärgning teknik som presenteras här är användbar för märkning av extracellulära domäner av transmembranproteiner i levande celler (som visas schematiskt i figur 1). Under inkubationstiden är immunoglobuliner binder tillgängliga epitoper och en del av befolkningen av proteinmolekyler, tillsammans med bunden antikropp, är endocyteras. Dessutom kan nysyntetiserad protein når cellytan via framåt människohandel och återvunna proteinmolekyler kan återföras ...

Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Vi beskriver en metod för att märka proteiner på ytan av levande neuroner med användning av en specifik polyklonal antikropp mot extracellulära epitoper. Protein bundet av antikroppen på cellytan och därefter intern via endocytos kan särskiljas från protein som återstår på eller trafikerade till, ytan under inkuberingen.

Differential Märkning för cell-ytan och internalis Proteiner efter Antibody Utfodring av Live odlade nervceller

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Märkning av nervceller från gnagare och icke-mänskliga primater Slices Brain

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) av fluorescens märkta proteiner i Dendritutskotten hos odlade hippocampus nervceller

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Analys av Dendritiska Spine Morfologi i odlade CNS Neuroner

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Live avbildning av dorsala Axoner efter Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induktion Dendritic Tillväxten i Odlade sympatiska nervceller

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Samtidig Registrering av Kalcium Signaler från identifierade nervceller och Utfodring beteende Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion och exocytos av membranproteiner i odlade nervceller utvärderas med hjälp av fluorescens återhämtning och fluorescens-förlust fotoblekning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Membranpotential Dye avbildning av ventromediala Hypothalamus nervceller från vuxna möss för att studera Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantifiering av endosom och lysosommotiliteter i odlade neuroner med användning av fluorescerande probar

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...