Name: the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis
Uploaded: 2014-02-05T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis at JoVE.com

Vi vill tacka alla medlemmar i McMahon laboratorium för deras hjälp och stöd. Denna forskning har finansierats med bidrag från en NIH / NCI R01 CA176839-01 (till MM) och en institutionell forskning och akademiska karriär Development Award (IRACDA till JS).

1. Beredning av helcellslysat från cellodling <ol><li> Placera cellodlingsskålar på is och tillsätt kallt PBS med 5 mM EDTA (t.ex. 5 ml PBS med 5 mM EDTA/10 cm 2 platta). Avlägsna vidhäftande cellerna från skålen med användning av en cellskrapa och överför sedan cellsuspensionen till en kall 15 ml koniska rör. </li><li> Pelletera cellsuspensioner genom låghastighetscentrifugering vid 1000 rpm (230 x g) under 5 minuter vid 4 ° C. Placera koniska rör på is och försiktigt aspirera sup...

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

De kritiska stegen i att generera högkvalitativa, kvantitativa Western blotting enligt detta protokoll är följande: 1) mätning av proteinkoncentrationer, 2) provberedning, 3) blockerar membranet och, 4) kvalitet och kaliber på den primära antikroppen. Noggrannheten för mätning av den totala proteinhalter kan ha en stor inverkan på att kvantifiera proteinband eftersom den exceptionella känsligheten för IR fluorescerande upptäckt förstärker några små skillnader som finns i prot...

<html> Tekniken med Western blotting har utvecklats mellan 1977 och 1979 i syfte att skapa en bättre metod för att detektera proteiner med användning av antikroppar 1-3. Detta förfarande utnyttjade elektroforetisk överföring av proteinerna till membran från SDS-PAGE-geler med målproteiner visualiseras med sekundära antikroppar och detekteras genom autoradiografi, UV-ljus, eller ett peroxidas reaktionsprodukt 3. Således är dessa samma grundläggande principer fortfarande ofta används i dagens Western blot-protokoll. Men denna klassiska Western blotting tekniken presentera många nackdelar, till exempel långsamma elektrofores körtider, låg upplösning och konstgjorda proteinbanden, känslighet för proteinnedbrytning, och begränsad känslighet samt dålig datakvalitet 4. Därför beskriver detta protokoll betydande framsteg och förbättringar till den standard Western blot förfarande som genererar mer exakta kvalitativa och kvantitativa data. &quot;&gt; Den Laemmli-systemet för att separera ett brett spektrum av proteiner med användning av SDS-PAGE är den mest använda gelsystem för Western blotting 5. Trots populariteten av denna Western-blotting-system, kan denna metod resultera i bandet distorsion, förlust av upplösning, och spurious band 4. Detta kan vara en konsekvens av deaminering och alkylering av proteiner på grund av högt pH (9,5) av den separerande gelén, återoxidering av reducerad disulfidbindningar på grund av den varierande redoxtillstånd av gelén, och klyvning av aspartyl-prolyl peptidbindningar på grund av uppvärmning av proteinet i Laemmli-buffert (pH 5,2) 4,6. Bis-Tris gel systemet, som är verksam i ett neutralt pH-värde (7,0), ger betydande fördelar över Lamemmli systemet. förbättrar Systemet proteinstabilitet, minimerar proteinmodifieringar, upprätthåller proteiner i sina reducerade stater, förhindrar aspartyl-prolyl klyvning under elektrofores, och ännu viktigare, är den elektrofores gångtid 35 min 4,6,7. Dessutom than Bis-Tris gel systemet producerar dessutom skarpare band, högre upplösning och separation, samt ökad känslighet resulterar i mer tillförlitliga uppgifter 4. I samband med Bis-Tris-gel-system, använder iBlot torra blotting-systemet med hög fältstyrka och strömmar för att avsevärt minska överföringstiden av proteiner från geler på membran inom 7 min 8. Detta överföringssystem är baserat på den torra blotting-metoden som genererar en mer effektiv och tillförlitlig överföring av proteiner 8. För en detaljerad jämförelse av effekten av systemet för iBlot överföring till de konventionella överföringssystem hänvisas till följande webbplats: <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Den utnyttjar en anod-och katodstapeln, som är sammansatta av en gelmatris som innehåller de lämpliga överföringsbuffertarna, som verkar som jon reservoarer 8. Under överföringen, hjälper vatten elektrolys för att förhindra uppkomsten av syre från koppar anoden resulterar i en mer konsekvent proteinöverföring utan att bandet distorsion 8. Dessutom ökar denna överföringssystem även överföringshastigheten genom att minska avståndet mellan elektroderna 8. Även kemiluminiscens är den vanligaste och traditionella tekniken för protein upptäckt av Western blot analyser, tvåfärgad infraröd fluorescerande detektion avsevärt förbättrar känsligheten, kvalitet och noggrannhet av Western blot uppgifter. Denna upptäckt metod använder infraröd laser excitation i två optimala våglängder, 700 nmoch 800 nm, för att generera en klar data, bilder med den största signal-till-brusförhållande och högsta känslighet 9. Sålunda kan två målproteiner visualiseras samtidigt på samma membran med användning av 700 nm och 800 nm fluorescensdetekteringskanaler. Ännu viktigare är att lineariteten och det dynamiska omfånget av infraröd fluorescens möjliggör exakt kvantitativ analys av både starka och svaga proteinband 9. Vidare tillhandahåller detta protokoll enorma fördelar och förbättringar över den klassiska Western blotting-teknik, genom att minska elektrofores och överföring gånger med detta experiment utan att äventyra effektiviteten av dessa processer och utnyttjande av infraröda fluorescerande proteindetektion för att producera större kvalitativa och kvantitativa Western blot-data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

De Western blot teknik som ursprungligen etablerades i slutet av 1970 fortfarande aktivt utnyttjas idag. Men denna traditionella metoden för Western blotting har flera nackdelar som inkluderar låg kvalitet upplösning, falska band, minskad känslighet, och dålig proteinintegritet. Nya framsteg har drastiskt förbättrat många aspekter av standarden Western blot-protokollet för att producera högre kvalitativa och kvantitativa data. Den Bis-Tris gel systemet, ett alternativ till den konventionella Laemmli-systemet genererar bättre proteinseparation och upplösning, underhåller protein integritet, och minskar elektrofores på en 35 min körning. Dessutom iBlot torr blotting-system, förbättrar dramatiskt effektiviteten och hastigheten för proteinöverföring till membranet i 7 min, vilket är i motsats till de traditionella proteinöverföringsmetoder som ofta är mer ineffektiva med långa överföringstider. I kombination med dessa mycket innovativa förändringar, protein detection hjälp av infraröda fluorescerande imaging resultat i högre kvalitet, mer exakta och konsekventa uppgifter jämfört med standard Western blotting tekniken med kemiluminescens. Denna teknologi kan samtidigt detektera två olika antigener på samma membran genom att utnyttja två-färgs nära-infraröda färgämnen som visualiseras i olika fluorescenskanaler. Vidare linjäritet och brett dynamikområde av fluorescerande avbildning möjliggör exakt kvantifiering av både starka och svaga proteinbanden. Således beskriver detta protokoll de viktigaste förbättringarna av den klassiska Western blotting metod, där dessa framsteg väsentligt öka kvaliteten på data samtidigt kraftigt minska prestationstiden för detta experiment.

Två-färg infraröd fluorescens upptäcker både starka och svaga band på samma membran med förbättrad känslighet och högsta signal-till-brus-förhållande för att producera tydliga Western blot bilder. Typiska resultat som genereras av två-färgs Western blot detektering visualiseras i både 700 nm och 800 nm fluorescerande kanaler exemplifieras i Figurerna 1 och 2. Den översta Western blot i Figur 1 visar den samtidiga (överlagring) upptäckt av total ERK1 /...

Watch this Scientific Journal Video about The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis at JoVE.com

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Detta protokoll utforskar det senaste inom utföra Western blot analyser. Dessa nya ändringar anställa en Bis-Tris-gel-system med en 35 min elektrofores kör tid, en 7 min torrt system blotting överföring, och infraröd fluorescerande protein detektion och avbildning som genererar högre upplösning, kvalitet, känslighet och förbättrad noggrannhet av västerländska uppgifter.

Det snabbaste Western i stan: en modern twist på den klassiska Western blot-analys

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western blotting Använda Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Kirurgisk Induktion av Endolymphatic hydrops av utplåning av Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting: provberedning till Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analys av cellcykeln Position i däggdjursceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Regelbunden skötsel och underhåll av en zebrafisk (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorium: En introduktion

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imaging och 3D rekonstruktion av Cerebrovascular Structures i embryonala Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiering av nyfödda mus härledda hudens stamceller i Germ-liknande celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

En guide till Modern Kvantitativ Fluorescerande Western blotting med Felsökning Strategier

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Blommor-Dip Omvandling av lin (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) För att generera transgena avkommor med en hög Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Metod för bedömning av effekterna av ett intervall av våglängder och intensiteter från Red / nära infraröda Ljusterapi på oxidativ stress<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...