Name: preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00
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作者要感谢FI Ataullakhanov帮助设计和制造可重复使用的流室，N. Dashkevich，N. Gudimchuk和A. Korbalev提供图像数据，N. Gudimchuk和P.扎哈罗夫开发协议，并提供试剂备地高辛标记微管的种子，A.波塔潘科​​的帮助文本编辑和Grishchuk实验室的其他成员的提示和讨论。这项工作是由部分支持美国国立卫生研究院授予通用汽车R01-098389以及宾夕法尼亚肌肉学院ELG，谁是金梅尔学者试点补助金，由RFBR给予12-04-00111-A，13-04-40190-H和13 -04-40188-H，俄罗斯科学院主席团资助到FI Ataullakhanov（分子系统集成和分子与分子细胞生物学课程的机制），美国国立卫生研究院授予通用汽车R01 GM033787到JR麦金托什和梅德子敏王朝基金会博士后奖学金到VAV

所需设备：下面描述的实验需要一个光学显微镜配备的DIC和荧光成像（ 表1）。明场照明的LED可用于显著提高盖玻片-微管附着的种子37，这是难以观察到与常规的卤素灯的检测。以控制液体流动在显微镜室，该溶液应具有能够从10-100微升/分钟的速度流动的蠕动泵进行交换。一种注射器泵，也可以使用，但必须小心，以避免产生气泡，可能形成时的流动速度急剧变...

许多单分子检测时下经常使用经过特殊处理的盖玻片，大大减少非特异性蛋白的粘附。我们在这里描述的过程是在霍华德实验室32开发的原始协议的修改，我们发现，硅烷化的盖玻片甚至与DIC的基础珠实验，不使用荧光是非常值得的努力。腔室装配有这样的盖玻片显示更清洁的表面，并在可溶的微管结合蛋白的存在下所获得的结果是更具有可重复性，特别是当一个非常低的蛋白质浓度使用...

微管是高度保守的细胞骨架结构，是对细胞结构，细胞运动，细胞分裂，和胞内运输1重要。这些动态的聚合物从微管蛋白组装在GTP存在下，和它们的开关自发生长，缩短2之间。微管是非常薄的（在直径只有25纳米），因此特殊的光学技术来提高对比度，应使用以观察微管，用光学显微镜。利用微分干涉对比（DIC）3以前的工作与这些聚合物研究它们的动态特性。这和类似的研究在体外发现，典型的实验条件下，微管发生灾难并切换到解聚很少，连用5-15分钟（这个频率是7-15毫米微管蛋白的可溶性检测浓度在28-32°C ）4。不同的技术因而被提出来电感ê微管解聚以受控的方式。微管的缩短可以洗去可溶性微管5,6，切割微管的激光束7，或者使用分段微管8，如这里描述的触发。使用分段的微管，以及随机切换聚合物以前的工作，已经发现，小的细胞内货物，如染色体，囊泡，和蛋白包被的磁珠，可以在缩短微管9-13的端部移动。这种现象被认为是有直接的含义在有丝分裂细胞的染色体运动，以及相关的机制目前正在积极调查14-16。 最近，基于荧光的技术，包括全内反射荧光（TIRF）显微镜，已被用来研究运动 ​​与动态微管端部17-24。这种方法的优点在于，它允许检查相互作用的微管与微管结合蛋白在实时使用标记有不同的荧光基团的蛋白质之间的第几种蛋白质复合物发现与伸长和/或缩短微管两端processively移动。它们包括微管相关蛋白DAM1 10,12,18，SKA1 19，和XMAP215 20，以及驱动蛋白马达KIF18A 21,22，MCAK 23和CENP-E 24。这些蛋白质表现的processive尖端跟踪，这是从经典的尖端跟踪蛋白质如EB1 25的根本不同。虽然EB1分子和相关联的伙伴会保持稳定地与微管 ​​的动态结束时，各个分子仍结合于微管尖只〜0.8秒，与可溶性池26迅速地交换有关。相比之下，的processive尖纤夫一样DAM1，旅游与微管了许多微米​​结束，并与微管尖端的关联可以持续数米任何秒钟。尖端关联的时间，以及所得到的跟踪速度，强烈地依赖于分子的形成尖部-跟踪复杂27的数量。更大的蛋白质合奏通常是更好的尖端跟踪。例如，这种复杂的组件作为分离的酵母着丝粒可以保持连接到微管两端为28小时。一些微管结合蛋白， 例如 NDC80复合动粒蛋白复合物，已发现结束于一个单分子水平到无法跟踪与微管 ​​，但NDC80复合是非常有效的联接器的珠货物19,29-31动议。因此，要理解的尖端跟踪由不同的蛋白质复合物，以及它们的生物学作用的机制，重要的是检查针尖跟踪作为分子在尖端跟踪复杂的数目的函数，以及确定是很重要的这些配合物表现出的货物珠表面上的集体运动的能力。 图1A）。首先，将市售的载玻片被修改附加短的聚乙烯管（方案1）。可重复使用的显微镜流动室，然后从这样一个滑动装配和化学或等离子体清洗和硅烷化的盖玻片（方案2）32-34。所得到的腔室体积只有20-25微升（或小至15微升，见注3在方案1），其中所述入口管的容积。市售的流动室，也可以使用，但它们的体积通常较大，从而导致蛋白质的不必要的浪费。如果一个较大的腔采用，在下面的协议，所有溶液的体积应该按比例缩放。微管的种子然后制备，例如用缓慢水解的GTP类似物，GMPCPP（鸟苷-5&#39;-[（α，β） - methyleno]三磷酸）（协议3，参见海曼&lt;EM&gt;等35）。种子被固定在清洗盖玻片和表面随后被阻断，以防止其它蛋白质的非特异性吸附32（使用洋地黄毒苷协议4描述了种子的固定化）。分段的微管然后可以使用协议5制备。这种方法的主要理由是，动态微管聚合体，在GTP的存在构成，可以暂时通过添加稳定微管蛋白片段，其中包含GMPCPP短“帽子”稳定。这些帽还含有罗丹明标记的微管蛋白，所以它们可以简单地通过照明视场用530-550纳米的激光或汞弧灯（协议6）36被除去。尖端跟踪信号的荧光强度可以被用来估计分子与微管拆卸端行进的数量，同时考虑到在显微镜视场照明（协议7）的不均匀性。类似的方法可以用研究解聚微管蛋白包被的珠之间的相互作用，如在27（协议8）所述的方法制备。某些蛋白质会容易结合到分割的微管的壁，但激光镊子还可以用来保持接近微管壁上的胎圈，从而促进其结合。

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

微管解聚能提供力输送不同的蛋白质复合物和蛋白包被的磁珠体外 。基本的机制被认为在细胞分裂过程中微管相关的染色体运动起到了至关重要的作用，但相关的蛋白质和它们的确切角色不明确。因此，人们越来越需要开发实验与用纯化的元件和限定的生化环境研究这些蠕动体外 。微管，但是，本质上是不稳定的聚合物;生长及缩短之间的切换是随机的并且难以控制。我们在这里描述的协议采取的均采用photoablatable稳定上限分段微管的优点。这样分割的微管的解聚可以以高的时间和空间分辨率被触发，从而协助蠕动的研究在拆卸微管末端。这种技术可用于约RRY出分子中的荧光标记的蛋白复合物，processively动态微管端部的移动的数量的定量分析。优化一个信号 - 噪声比在这个和其他定量荧光测定法，盖玻片应该被处理以减少水溶性荧光标记蛋白的非特异性吸收。所提供的详细方案考虑到荧光灯照明的不均匀性，并确定使用等距离高斯拟合单个荧光的强度。最后，我们描述了使用分段的微管来研究蛋白质包被的微珠的微管依赖性的运动，提供了见解不同的电机和非机动蛋白偶联的微管解聚到的processive货物运动的能力。

蛋白与微管 ​​解聚跟踪结束。酵母着丝粒成分DAM1是迄今为止最好的提示跟踪器的微管解聚的结束14。这个10-亚基复合GFP标记可以容易地表达并从细菌细胞18,38纯化，因此建议用它作为阳性对照的尖端跟踪检测。与微管 ​​的解聚结束追踪荧光蛋白被看作是一个明亮的荧光斑点稳步迈向盖玻片连接的种子（ 视频3）。它也将出现在相应kymograph（ 图2...

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Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

微管本质上是不稳定的聚合物，以及生长和缩短之间的切换是随机的并且难以控制。在这里，我们将介绍使用分段微管与photoablatable稳定上限协议。分割的微管的解聚可以以高的时间和空间分辨率被触发，从而协助运动与拆卸的微管末端的分析。

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