Name: preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke FI Ataullakhanov for at hjælpe med at designe og fremstille genanvendelige strømningskamre, N. Dashkevich, N. Gudimchuk og A. Korbalev for at levere billeder til figurer, N. Gudimchuk og P. Zakharov for at udvikle en protokol og levere reagenser til forberede digoxigenin-mærket mikrotubuli frø, A. Potapenkos hjælp til tekstredigering og andre medlemmer af Grishchuk laboratorium for tips og diskussioner. Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud GM R01-098.389 og en pilot tilskud fra Pennsylvania Muskel Institute til ELG, der er en Kimmel Scholar ved RFBR giver 12-04-00.111-en 13-04-40.190-H og 13 -04-40188-H, Russian Academy of Sciences Præsidiets Grants (Mekanismer Molekylær Systems Integration og Molekylær og molekylær cellebiologi programmer) til FI Ataullakhanov, NIH tilskud GM R01 GM033787 til JR McIntosh og en Dmitry Zimin dynastiet Foundation postdoc-stipendium til at VAV

Nødvendigt udstyr: De nedenfor beskrevne eksperimenter kræver et lysmikroskop udstyret til DIC og fluorescens imaging (tabel 1). Lysfelt LED-belysning kan anvendes til at forbedre påvisningen af dækglasset-attached mikrotubulus frø 37, som er vanskelig at observere med en regelmæssig Halogenlampe. Til at styre flydende flow i mikroskopi kamre, skal løsninger udveksles med en peristaltisk pumpe i stand til flow hastigheder 10-100 ul / min. En sprøjtepumpe kan også anv...

Mange enkelt molekyle assays dag rutinemæssigt bruger specielt behandlede dækglas til drastisk at reducere uspecifik protein stikning. Den procedure, vi beskriver her er en modificering af den oprindelige protokol udviklet i Howard lab 32, og vi finder, at silanizing dækglas er indsatsen værd, selv med DIC-baserede perle assays, der ikke anvender fluorescens. Chambers samlet med disse dækglas viser meget renere overflader, og de opnåede resultater i nærvær af opløseligt mikrotubulus-bindende protein ...

Mikrotubuli er højkonserverede cytoskeletstrukturen der er vigtige for cellulær arkitektur, celle motilitet, celledeling, og intracellulær transport 1.. Disse dynamiske polymerer samle fra tubulin i nærvær af GTP, og de ​​skifter spontant mellem vækst og afkortning 2. Mikrotubuli er meget tynde (kun 25 nm i diameter) derfor specielle optiske teknikker til at øge kontrasten skal bruges til at observere mikrotubuli med et lysmikroskop. Tidligere arbejde med disse polymerer undersøgt deres dynamiske adfærd ved hjælp af kontrast differential interferens (DIC) 3. Denne og lignende undersøgelser in vitro viste, at under typiske eksperimentelle betingelser, mikrotubuli gennemgå katastrofe og skift til den depolymerisering kun sjældent, en gang hver 5-15 min (denne frekvens er for 7-15 mM opløselig tubulin koncentration undersøgt på 28-32 ° C ) 4.. Forskellige teknikker er således blevet foreslået at induce mikrotubuli depolymerisering på en kontrolleret måde. Mikrotubulus afkortning kan udløses ved at vaske væk opløseligt tubulin 5,6, opskæring mikrotubuli med en laserstråle 7, eller ved hjælp af segmenterede mikrotubuli 8, som beskrevet her. Tidligere arbejde under anvendelse af segmenterede mikrotubuli samt stokastisk skifter polymerer, har fundet, at små intracellulære laster, såsom kromosomer, vesikler, og protein-coatede perler, kan bevæge sig ved enderne af forkortelsen af mikrotubuli 9-13. Dette fænomen menes at have en direkte virkning på kromosom bevægelser i mitotiske celler, og de ​​underliggende mekanismer er i øjeblikket under aktiv efterforskning 14-16. For nylig har fluorescerende-baserede teknikker, herunder total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi, er blevet ansat til at studere motilitet med dynamisk mikrotubuli ender 17-24. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det tillader undersøgelse af interaktionens mellem mikrotubuli og mikrotubuli-bindende proteiner i realtid ved hjælp proteiner mærket med forskellige fluoroforer. Adskillige protein-komplekser blev fundet til at bevæge processively med forlængede og / eller afkorte mikrotubuli ender. De omfatter mikrotubuli-associeret proteiner Dam1 10,12,18, Ska1 19 og XMAP215 20 samt kinesin motorer Kif18A 21,22, MCAK 23 og CENP-E 24. Disse proteiner udviser processive tip-tracking, som er fundamentalt forskellig fra de klassiske tip-tracking proteiner som EB1 25. Selv EB1 molekyler og de ​​associerede partnere synes at forblive stabilt forbundet med dynamisk mikrotubuli ender de enkelte molekyler forbliver bundet til mikrotubuli tip til kun ~ 0,8 sek, hurtigt udveksle med den opløselige pool 26. I modsætning hertil processive tip-trackers, ligesom Dam1, rejse med mikrotubuli ender for mange mikrometer, og deres tilknytning til mikrotubuli tips kan vare meventuelle sekunder. Spidsen forening tid, samt den resulterende sats for tracking, afhænger meget af antallet af molekyler, der danner spids-tracking kompleks 27. Større protein ensembler er normalt meget bedre tip-trackers. For eksempel kan sådanne komplekse enheder som de isolerede gær kinetochores fortsat være koblet til mikrotubuli ender i timevis 28. Nogle mikrotubuli-bindende proteiner, fx Ndc80 kinetochore protein kompleks, har vist sig at være ude af stand til at spore med mikrotubuli slutter ved et enkelt molekyle niveau, men Ndc80 er meget effektiv i at koble bevægelse perle last 19,29-31. Således at forstå mekanismen af ​​tip-sporing af forskellige protein-komplekser, såvel som deres biologiske roller, er det vigtigt at undersøge tip-sporing, som en funktion af antallet af molekyler i spids-tracking kompleks, samt at bestemme evnen af ​​disse komplekser udviser kollektiv motilitet på overfladen af ​​perlen last. (figur 1a). Først er de kommercielt tilgængelige objektglas modificeret til at fastgøre kort polyethylenrør (Protokol 1). Den genanvendelige mikroskopi flowkammer samles derefter fra sådan et dias og kemisk eller plasma-rengøres og silaniserede dækglas (protokol 2) 32-34. Den resulterende kammer volumen er kun 20-25 pi (eller så lille som 15 ul, se note 3 i protokol nr. 1), herunder mængden af ​​indløbsrøret. Kommercielt tilgængelige strømningskamre kan også anvendes, men deres volumen er normalt større, hvilket fører til det unødvendige spild af proteiner. Hvis et større kammer er ansat, bør mængden af ​​alle løsninger i de protokoller nedenstående skaleres proportionalt. Mikrotubuli frø fremstilles derefter, fx under anvendelse langsomt hydrolyserbare GTP-analog, GMPCPP (guanosin-5&#39;-[(α, β)-methyleno] triphosphat) (protokol 3, se også Hyman &lt;em&gt; et al. 35). Frøene er immobiliseret på en renset dækglas og overfladen efterfølgende blokeret for at forhindre ikke-specifik absorption af andre proteiner 32 (protokol 4 beskriver frø immobilisering ved hjælp digoxigenin). De segmenterede mikrotubuli kan derefter fremstilles ved Protokol 5. Den væsentligste begrundelse for denne fremgangsmåde er, at dynamiske mikrotubuli polymerer, som dannes i nærvær af GTP, kan stabiliseres midlertidigt ved at tilføje korte &quot;caps&quot; af stabile tubulin segmenter, som indeholder GMPCPP. Disse hætter indeholder også Rhodamine-mærket tubulin, så de kan fjernes blot ved at belyse synsfelt med en 530-550 nm laser eller kviksølv buelampe (protokol 6) 36. Kan derefter anvendes fluorescensintensitet tip-sporingssignal at estimere antallet af molekyler, der rejser med demontering mikrotubuli ender, idet der tages hensyn til ujævnheder i mikroskop feltbelysning (Protokol 7). Kan bruges En lignende fremgangsmådeat studere samspillet mellem depolymerisering mikrotubuli og protein-coatede perler, fremstillet som beskrevet i 27 (protokol 8). Visse proteiner vil let binde til væggene af segmenterede mikrotubuli, men laser pincet kan også bruges til at holde perlen nær mikrotubulus væggen og derved fremme dets binding.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

Mikrotubuli depolymerisering kan give kraft til at transportere forskellige protein komplekser og protein-coatede beads in vitro. De underliggende mekanismer menes at spille en afgørende rolle i mikrotubuli-afhængige kromosomfejl bevægelser under celledeling, men de relevante proteiner og deres præcise roller er dårligt defineret. Således er der et stigende behov for at udvikle assays med til at studere en sådan motilitet in vitro under anvendelse af oprensede komponenter og defineret biokemiske miljø. Mikrotubuli, er dog i sagens natur ustabile polymerer deres skift mellem vækst og afkortning er stokastisk og vanskelig at kontrollere. De protokoller, vi beskriver her drage fordel af de segmenterede mikrotubuli, der er lavet med photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisering af sådanne segmenterede mikrotubuli kan udløses med høj tidslig og rumlig opløsning og dermed bistå studier af motilitet ved demonteringen mikrotubuli ender. Denne teknik kan bruges til caRRY en kvantitativ analyse af antallet af molekyler i fluorescens-mærket protein-komplekser, som bevæger processively med dynamisk mikrotubulus ender. For at optimere et signal-til-støj-forholdet i dette og andre kvantitative fluorescerende assays bør dækglas behandles for at reducere uspecifik absorption af opløselige fluorescens-mærkede proteiner. Detaljerede protokoller er tilvejebragt for at tage hensyn til ujævnheder i fluorescerende belysning og bestemme intensiteten af ​​en enkelt fluorophor hjælp ækvidistante gaussisk pasform. Endelig beskriver vi anvendelse af segmenterede mikrotubuli at studere mikrotubulus-afhængige bevægelser af protein-coatede mikroperler, der giver indsigt i evnen af ​​forskellige motordrevne og motonske proteiner par mikrotubuli depolymerisation til bearbejdende last bevægelse.

Protein sporing med depolymerisering mikrotubuli slutter. Gær kinetochore komponent Dam1 er langt den bedste tip-tracker for depolymerisering mikrotubuli ender 14. Denne 10-underenhed kompleks mærket med GFP let kan udtrykkes og oprenses fra bakterieceller 18,38, så vi anbefaler at bruge det som en positiv kontrol for tip-sporing assay. En fluorescerende protein, der sporer med depolymerisering ende af en mikrotubuli ses som en lys fluorescerende plet støt bevæger sig mod dæk...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Mikrotubuli er i sagens natur ustabile polymerer og deres skift mellem vækst og afkortning er stokastisk og vanskelig at kontrollere. Her beskriver vi protokoller anvender segmenterede mikrotubuli med photoablatable stabiliserende hætter. Depolymerisering af segmenterede mikrotubuli kan udløses med høj tidslig og rumlig opløsning og dermed bistå analyse af bevægelser med demonteringen mikrotubuli ender.

Udarbejdelse af Segmenteret Mikrotubuli at studere Forslag drevet af demontering mikrotubuli Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion af<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg uddragene Identificer mikrotubuli-associerede RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Forberedelse af Mgm101 Recombination Protein af MBP-baserede tagging strategi

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Brug af Caco-2 celler til at studere Lipid Transport af tarmen

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Måling af dynamik i Mikrotubulen ved spinding af Diskmikroskopi i monopolære mitotiske spindler

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Undersøgelse Flagella-Driven Motility i Escherichia coli ved at anvende tre etablerede teknikker i en serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

En trin-for-trin guide til myg elektroantennografi

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...