Name: preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

De auteurs willen graag FI Ataullakhanov bedanken voor het helpen bij het ontwerpen en vervaardigen herbruikbare stromingskamers, N. Dashkevich, N. Gudimchuk en A. Korbalev voor het verstrekken van afbeeldingen voor figuren, N. Gudimchuk en P. Zakharov voor het ontwikkelen van een protocol en het verstrekken van reagentia bereiden digoxigenine-gelabelde microtubuli zaden, A. Potapenko voor hulp bij het bewerken van tekst en andere leden van Grishchuk lab voor tips en discussies. Dit werk werd mede ondersteund door NIH te verlenen GM R01-098389 en een pilot subsidie ​​van Pennsylvania Muscle Instituut voor ELG, die een Kimmel Scholar, door RFBR verleent 12-04-00111-a, 13-04-40190-H en 13 -04-40188-H, de Russische Academie van Wetenschappen presidium Subsidies (Mechanismen van de Molecular Systems Integration en Moleculaire en Moleculaire Celbiologie programma&#39;s) naar FI Ataullakhanov, NIH verlenen GM R01 GM033787 JR McIntosh, en een Dmitry Zimin Dynasty Stichting postdoctoraal fellowship aan VAV

Benodigde apparatuur: De hieronder beschreven experimenten vereisen een lichtmicroscoop uitgerust voor DIC en fluorescentie beeldvorming (tabel 1). Helderveld LED verlichting kan worden gebruikt om aanzienlijke verbetering van de detectie van het dekglaasje bijgevoegde microtubuli zaden 37, die moeilijk waar te nemen met een gewone halogeenlamp zijn. Om vloeistofstroom in de microscopie kamers regelen, moet de oplossing worden uitgewisseld met een peristaltische pomp kan stro...

Veel single molecule assays tegenwoordig routinematig gebruik speciaal behandeld dekglaasjes om aspecifieke eiwit plakken drastisch te verminderen. De procedure die we hier beschrijven is een wijziging van het oorspronkelijke protocol ontwikkeld in Howard lab 32, en we vinden dat silaniseren de dekglaasjes is de moeite waard, zelfs met DIC-gebaseerde kraal assays, die geen gebruik maken van fluorescentie. Chambers geassembleerd dergelijke dekglaasjes tonen veel schoner oppervlak en de verkregen in de aanwezig...

Microtubuli sterk geconserveerd cytoskelet structuren die belangrijk zijn voor de cellulaire architectuur, celbeweeglijkheid, celdeling, en intracellulair transport 1 zijn. Deze dynamische polymeren samenstellen uit tubuline in de aanwezigheid van GTP en schakelen ze spontaan tussen groei en verkorting 2. Microtubules zijn zeer dun (slechts 25 nm in diameter) derhalve speciale optische technieken om het contrast moet worden gebruikt om microtubuli waarnemen met een lichtmicroscoop. Eerdere werk met deze polymeren onderzocht hun dynamisch gedrag met behulp van differentieel interferentie contrast (DIC) 3. Deze en soortgelijke studies in vitro aangetoond dat onder normale experimentele omstandigheden, de microtubuli catastrofe en schakelaar om de depolymerisatie ondergaan slechts zelden, eens in de 5-15 min (deze frequentie is voor 7-15 mM oplosbaar tubuline concentratie bij 28-32 ° C onderzocht ) 4. Verschillende technieken zijn dus voorgesteld induce microtubule depolymerisatie op een gecontroleerde manier. Microtubuli verkorting kan worden geactiveerd door wegwassen oplosbare tubuline 5,6, snijden microtubuli met een laserbundel 7, of met gesegmenteerde microtubules 8, zoals hier beschreven. Contract met gesegmenteerde microtubules, evenals stochastisch schakelen polymeren, heeft gevonden dat kleine intracellulaire ladingen, zoals chromosomen, blaasjes en met eiwit beklede korrels, aan de uiteinden van de verkorting microtubuli 9-13 bewegen. Dit fenomeen wordt gedacht aan een rechtstreekse gevolgen voor chromosoom bewegingen in mitotische cellen hebben, en de onderliggende mechanismen worden momenteel actief onderzoek 14-16. Onlangs hebben-tl-gebaseerde technieken, met inbegrip van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie, zijn gebruikt om de beweeglijkheid te studeren met dynamische microtubuli eindigt 17-24. Het voordeel van deze benadering is dat het onderzoek van interacties tussen microtubuli en microtubuli bindende eiwitten in real time via eiwitten gelabeld met verschillende fluoroforen. Verschillende eiwitcomplexen bleken processively bewegen verlengen en / of verkorten uiteinden van microtubuli. Zij omvatten het met microtubuli geassocieerde eiwitten Dam1 10,12,18, Ska1 19 en XMAP215 20, alsmede kinesine motor Kif18A 21,22, MCAK 23 en CENP-E 24. Deze eiwitten vertonen processive tip-tracking, die fundamenteel verschilt van die van de klassieke-tip bijhouden eiwitten zoals EB1 25. Hoewel EB1 moleculen en de geassocieerde partners lijken te blijven stabiel geassocieerd met dynamische uiteinden van microtubuli, de individuele moleculen blijven gebonden aan de microtubuli tip voor slechts ~ 0,8 sec, snel uit te wisselen met de oplosbare zwembad 26. In tegenstelling processieve tip-trackers, zoals Dam1, reizen met microtubuli eindigt voor veel micron, en hun associatie met microtubuli tips kan duren voor menige seconden. De tip vereniging tijd, en de resulterende snelheid tracking, hangt sterk af van het aantal moleculen die de tip bijhouden complex 27 gevormd. Groter eiwit ensembles zijn meestal veel betere tip-trackers. Zo kunnen dergelijke complexe samenstellingen de geïsoleerde gist kinetochores gekoppeld blijven microtubuli uiteinden voor 28 uur. Sommige microtubule-bindende eiwitten, bijv. Ndc80 kinetochore eiwitcomplex, bleken niet te volgen met microtubuli te eindigt bij een enkel molecuul, maar Ndc80 zeer efficiënt koppelen van de beweging van de kraal lading 19,29-31. Dus, om het mechanisme van tip-volgen door verschillende eiwitcomplexen, evenals hun biologische rollen begrijpen, is het belangrijk tip tracking onderzocht als functie van het aantal moleculen in de tip bijhouden complex, en bepalen het vermogen van deze complexen collectieve motiliteit vertonen op het oppervlak van de kraal lading. (Figuur 1A). Eerst worden de handel verkrijgbare objectglaasjes gemodificeerd korte polyethyleen buis (Protocol 1) bevestigen. De herbruikbare microscopie stroom kamer wordt vervolgens geassembleerd uit zo&#39;n glijbaan en het chemisch of plasma gereinigd en gesilaniseerd dekglaasje (protocol 2) 32-34. Het resulterende volume kamer is slechts 20-25 pi (of zo klein als 15 pl, zie opmerking 3 in Protocol nr. 1), met inbegrip van het volume van de inlaat slang. Commercieel verkrijgbare stroomkamers kan worden gebruikt, maar hun omvang gewoonlijk groter, waardoor onnodige verspilling van eiwitten. Indien een grotere kamer wordt toegepast, moet het volume van alle oplossingen in onderstaande protocollen evenredig geschaald. Microtubuli zaden worden vervolgens bereid, bijvoorbeeld met langzaam hydrolyseerbare GTP analoog, GMPCPP (guanosine-5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfaat) (protocol 3, zie ook Hyman &lt;em&gt; e.a.. 35). De zaden worden geïmmobiliseerd op een schoon dekglaasje en het oppervlak wordt vervolgens geblokkeerd om niet-specifieke absorptie van andere eiwitten voorkomen 32 (protocol 4 beschrijft zaden immobilisatie met behulp van digoxigenine). De gesegmenteerde microtubuli kan dan worden voorbereid met behulp van Protocol 5. De belangrijkste reden voor deze benadering is dat de microtubulus polymeren, die in aanwezigheid van GTP vormen, tijdelijk worden door toevoeging van de korte &quot;caps&quot; stabiele tubuline segmenten die GMPCPP bevatten gestabiliseerd. Deze kappen bevatten ook Rhodamine-gelabeld tubuline, zodat ze kunnen eenvoudig worden verwijderd door het verlichten van het gezichtsveld met een 530-550 nm laser of kwik booglamp (Protocol 6) 36. Fluorescentie-intensiteit van de punt-spoorvolgsignaal kan dan worden gebruikt voor het schatten van het aantal moleculen die reizen met de demontage microtubuli uiteinden, gezien de ongelijkheid van de microscoop field verlichting (Protocol 7). Een soortgelijke aanpak kan worden gebruiktinteracties tussen microtubuli depolymeriseren en eiwit beklede parels, bereid zoals beschreven in 27 (protocol 8) te bestuderen. Sommige eiwitten zullen binden gemakkelijk aan de wanden van gesegmenteerde microtubuli, maar laserpincet kan ook worden gebruikt om de hiel bij de microtubule muur houden, waardoor de binding bevorderen.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

Depolymerisatie van microtubuli kan werking bieden aan verschillende eiwitcomplexen en met eiwit beklede korrels transporteren in vitro. De onderliggende mechanismen worden verondersteld om een ​​belangrijke rol spelen in het microtubuli-afhankelijke chromosoom bewegingen tijdens de celdeling, maar de betrokken eiwitten en hun exacte rollen zijn slecht gedefinieerd. Er is dus een groeiende behoefte aan assays waarmee dergelijke motiliteit in vitro bestuderen met gezuiverde componenten en gedefinieerde biochemische milieu te ontwikkelen. Microtubules zijn echter inherent instabiel polymeren, alsmede schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. De protocollen beschrijven we hier gebruik maken van de gesegmenteerde microtubuli die zijn gemaakt met de photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van dergelijke gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van studies van de beweeglijkheid bij de demontage uiteinden van microtubuli. Deze techniek kan worden gebruikt om caRRY een kwantitatieve analyse van het aantal moleculen in het fluorescentie-gemerkte eiwitcomplexen die processively met microtubulus uiteinden bewegen. Een signaal-ruisverhouding in deze en andere kwantitatieve fluorescentie assays optimaliseren, moet dekglaasjes worden behandeld om niet-specifieke absorptie van oplosbare fluorescent gelabelde eiwitten te verminderen. Gedetailleerde protocollen worden voorzien om rekening te houden met de ongelijkheid van fluorescentieverlichting, en bepalen de intensiteit van een enkele fluorofoor met equidistante Gaussische fit. Tenslotte beschrijven we het gebruik van gesegmenteerde microtubuli microtubuli-afhankelijke bewegingen van de met eiwit beklede microkorrels bestuderen, die inzicht in het vermogen van verschillende motorische en niet-motorische eiwitten te koppelen microtubule depolymerisatie te processive lading beweging.

Eiwit tracking met depolymeriseren microtubuli eindigt. Gist kinetochoor component Dam1 is veruit de beste tip-tracker van de depolymeriseren microtubuli eindigt 14. Deze 10-subunit complex gelabeld met GFP kan gemakkelijk worden uitgedrukt en gezuiverd van bacteriële cellen 18,38, dus we raden het gebruik ervan als een positieve controle voor de tip volgen assay. Een fluorescerend eiwit dat meeloopt met het depolymeriseren na een microtubule wordt gezien als een heldere fluoresce...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubules zijn inherent instabiel polymeren en hun schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. Hier beschrijven we protocollen gebruiken gesegmenteerde microtubuli met photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van de analyse van bewegingen met de demontage uiteinden van microtubuli.

Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Productie van<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extracten aan microtubuli-geassocieerde RNA&#39;s identificeren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Bereiding van de Mgm101 recombinatie eiwit met MBP-based Tagging strategie

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Met behulp van Caco-2 cellen te Lipid Transport studie van de Darm

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Een stapsgewijze handleiding voor muggenelektroantennografie

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...