Name: preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לFI Ataullakhanov שעזרו לתכנן ולייצר זרימת תאים לשימוש חוזר, נ &#39;Dashkevich, נ&#39; וא &#39;Gudimchuk Korbalev למתן תמונות לדמויות, נ&#39; פ &#39;וGudimchuk זכרוב לפיתוח פרוטוקול ומתן ריאגנטים ל להכין זרעי microtubule כותרת digoxigenin, א Potapenko לעזרה בעריכת טקסט ולחברי הגילדה של המעבדה Grishchuk לעצות ודיונים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק NIH GM-R01 098,389 ומענק טייס משריר פנסילבניה מכון לELG, שהוא Scholar קימל, על ידי RFBR מעניק 12-04-00,111-, 13-04-40,190-H ו13 -04-40188-H, אקדמיה הרוסית למדעי מענקי נשיאות (מנגנונים של אינטגרציה של המערכות המולקולרית ותוכניות ביולוגיה המולקולרית של תא ומולקולרי) לFI Ataullakhanov, מענק NIH GM R01 GM033787 לJR מקינטוש, ומלגה הבתר דמיטרי Zimin שושלת קרן ל ט&quot;ו

ציוד נדרש: הניסויים המתוארים להלן דורשים מיקרוסקופ אור מצוידת לדסק&quot;ש ודימות פלואורסצנטי (טבלת 1). תאורת LED שדה מואר יכולה לשמש כדי לשפר את זיהוי של זרעים ומצורפים coverslip microtubule 37, אשר קשה לצפות עם מנורת הלוגן רגילה באופן משמעותי. כדי לשלוט בזרי?...

מבחני מולקולה בודדים רבים בימינו משתמשים באופן שגרתי coverslips טיפול מיוחד כדי להפחית את דבק חלבון ספציפי באופן דרסטי. ההליך שאנו מתארים כאן הוא שינוי של הפרוטוקול המקורי שפותח במעבדה של הווארד 32, ואנו מוצאים כי silanizing coverslips הוא גם שווה את המאמץ אפילו עם מבחני חרוז ?...

Microtubules הם מאוד נשמרים מבני cytoskeletal כי הם חשובים לארכיטקטורה הסלולר, תנועתיות תא, חלוקת תא, והובלה תאית 1. פולימרים אלה דינמיים להרכיב מטובולין בנוכחות GTP, והם עוברים באופן ספונטני בין צמיחה וקיצור 2. Microtubules הם דקים מאוד (25 ננומטר רק בקוטר) ולכן טכניקות אופטיות מיוחדות כדי לשפר את צריך לשמש ניגוד להתבונן microtubules עם מיקרוסקופ אור. עבודה קודמת עם פולימרים אלו נבחנת ההתנהגות הדינמית שלהם באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) 3. מחקרים במבחנה וזה דומה גילו כי תחת תנאי ניסוי טיפוסיים, microtubules לעבור קטסטרופה ומתג לdepolymerization רק לעתים רחוקות, פעם אחת בכל דקות 5-15 (התדר הזה הוא בשביל 7-15 ריכוז טובולין מסיס מ&quot;מ נבדק ב28-32 ° C &#39;) 4. טכניקות שונות ובכך הוצעו לinducdepolymerization microtubule דואר באופן מבוקר. קיצור microtubule יכול להיות מופעל על ידי שטיפת טובולין מסיס 5,6, חיתוך microtubules עם קרן לייזר 7, או שימוש בmicrotubules מפולחת 8, כפי שמתואר כאן. העבודה קודמת באמצעות microtubules המפולח, כמו גם פולימרים stochastically מיתוג, מצאה כי מטענים קטנים תאיים, כגון כרומוזומים, שלפוחית, וחרוזים מצופים חלבון, יכולים לנוע בקצות microtubules קיצור 9-13. הוא חשב תופעה זו יש השלכה ישירה לתנועות כרומוזום בתאי mitotic, והמנגנונים שבבסיס נמצאים כעת תחת חקירה פעילה 14-16. לאחרונה, טכניקות מבוססות פלורסנט, כוללים הקרינה הכוללת הפנימית ההשתקפות (TIRF) מיקרוסקופיה, כבר מועסקים ללמוד תנועתיות עם microtubule הדינמי מסתיים 17-24. היתרון של גישה זו הוא שהיא מאפשרת בדיקה של אינטראקציהים בין microtubules ומחייב חלבוני microtubule בזמן אמת באמצעות חלבונים שכותרתו עם fluorophores שונה. כמה קומפלקסי חלבונים נמצאו לעבור processively עם מתארך ו / או לקצר קצות microtubule. הם כוללים את חלבוני microtubule הקשורים Dam1 10,12,18, Ska1 19, וXMAP215 20, כמו גם מנועים kinesin Kif18A 21,22, MCAK 23 ו24 CENP-E. חלבונים אלה תערוכת קצה מעקב התהליכית, שהוא שונה מהותי מזו של חלבוני מעקב טיפ הקלאסיים כמו EB1 25. למרות שנראה מולקולות EB1 והשותפים הקשורים להישאר ביציבות קשורים microtubule הדינמי מסתיים, המולקולות בודדות יישארו מחויבות לקצה microtubule רק ~ שניות 0.8, מהירות החלפה עם הבריכה מסיסה 26. לעומת זאת, טיפ עוקבים התהליכית, כמו Dam1, לנסוע עם microtubule מסתיים עבור מיקרון רבים, והקשר שלהם עם עצות microtubule יכול להימשך מ &#39;<html> כל שניות. קצה זמן עמותה, כמו גם את השיעור של מעקב וכתוצאה מכך, תלוי בחום על מספר המולקולות היוצרים את 27 מורכבות מעקב הקצה. הרכבי חלבון גדולים יותר הם בדרך כלל-עוקבים אחר עצה הרבה יותר טוב. לדוגמא, מכלולים מורכבים כגון kinetochores השמרים המבודד יכולים להישאר מצמידים microtubule מסתיים במשך שעות 28. מחייב חלבוני microtubule מסוימים, למשל חלבון מורכב kinetochore Ndc80, כבר מצאתי להיות מסוגל לעקוב אחר עם microtubule מסתיים ברמת מולקולה בודדת, ובכל זאת Ndc80 הוא יעיל מאוד בצימוד תנועת מטענים חרוז 19,29-31. לכן, כדי להבין את המנגנון של קצה מעקב על ידי מתחמים שונים חלבון, כמו גם התפקידים הביולוגיים שלהם, חשוב לבחון את קצה מעקב כפונקציה של מספר המולקולות במתחם מעקב הקצה, כמו גם כדי לקבוע היכולת של קומפלקסים אלה להציג תנועתיות קולקטיבית על פני השטח של מטען חרוז. &gt; להלן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים להכין ולערוך ניסויים עם microtubules המפולח (איור 1 א). ראשית, שקופיות זכוכית הזמינות המסחרי שונה כדי לצרף צינורות קצרים פוליאתילן (1 לפרוטוקול). הזרימה מיקרוסקופית החדר לשימוש חוזר לאחר מכן הורכב משקופיות כאלה ו- ניקה פלזמה ו coverslip silanized (פרוטוקול 2) 32-34 כימי או. וכתוצאה מכך נפח התא הוא רק 20-25 μl (או קטן כמו 15 μl, ראה באור 3 ב 1 לפרוטוקול), ובכלל זה היקף צינורות היניקה. יכולים לשמש גם זרימת תאים זמינים באופן מסחרי, אבל הנפח שלהם הוא בדרך כלל גדול יותר, מה שמוביל לבזבוז המיותר של חלבונים. אם חדר גדול יותר הוא מועסק, היקף כל הפתרונות בפרוטוקולים להלן אמור להיות מדורגים באופן יחסי. לאחר מכן זרעי microtubule מוכנים, למשל באמצעות אנלוגי GTP Hydrolysable לאט, (אדנוזין Guanosine-5&#39;-[(α, β)-methyleno]) GMPCPP (פרוטוקול 3, ראה גם היימן &lt;em&gt; et al. 35). הזרעים הם משותקים על coverslip ניקה ועל פני השטח, נחסם לאחר מכן על מנת למנוע קליטה לא ספציפית של חלבונים אחרים 32 (פרוטוקול 4 מתאר חוסר תנועת זרעים באמצעות digoxigenin). אז יכול להיות מוכן microtubules המפולח באמצעות פרוטוקול 5. הרציונל העיקרי לגישה זו הוא כי פולימרים microtubule דינמיים, המהווים בנוכחות GTP, ניתן התייצבו באופן זמני על ידי הוספה &quot;כובעים&quot; קצרים של מגזרי טובולין יציבים, המכילים GMPCPP. כמוסות הללו גם מכילות טובולין שכותרת Rhodamine, כך שניתן יהיה להסירו פשוט על ידי מאיר שדה הראייה בלייזר 530-550 ננומטר או מנורת קשת כספית (פרוטוקול 6) 36. עוצמת הקרינה של אות קצה המעקב לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את מספר המולקולות שנוסעות עם קצות microtubule פירוק, תוך לקיחה בחשבון את חוסר האחידות של התאורה בשדה מיקרוסקופ (7 לפרוטוקול). גישה דומה ניתן להשתמש בםכדי לחקור אינטראקציות בין microtubules depolymerizing וחרוזים מצופה חלבון, שהוכנו כמתואר ב27 (פרוטוקול 8). חלבונים מסוימים בקלות יהיו לאגד את הקירות של microtubules המפולח, אלא גם פינצטה הלייזר יכולה לשמש כדי להחזיק את חרוז ליד קיר microtubule, ובכך לקדם אותה מחייב.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

depolymerization microtubule יכול לספק כוח להובלת קומפלקסי חלבונים שונים וחרוזים מצופים חלבון במבחנה. המנגנונים הם חשבו לשחק תפקיד חיוני בתנועות כרומוזום microtubule תלוי במהלך חלוקת תא, אך החלבונים הרלוונטיים והתפקידים המדויקים שלהם מעורפלים. לפיכך, יש צורך הולך וגדל לפיתוח מבחני שבה ללימודים כגון תנועתיות במבחנה באמצעות רכיבים מטוהרים וסביבה ביוכימית מוגדרת. Microtubules, לעומת זאת, מטבעם פולימרים יציבים; מיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. הפרוטוקולים שאנו מתארים כאן לנצל את microtubules המפולח שהם עשו עם photoablatable ייצוב כובעים. Depolymerization של microtubules המפולח כאלה יכולים להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע ללימודים של תנועתיות בקצות microtubule הפירוק. טכניקה זו יכולה לשמש כדי carry מתוך ניתוח כמותי של מספר המולקולות בקומפלקסי החלבונים שכותרת פלורסנטי, אשר להזיז processively עם microtubule הדינמי מסתיים. כדי לייעל את יחס בזה ואות לרעש מבחני ניאון כמותיים אחרים, יש להתייחס אליהם coverslips כדי להפחית את הספיגה ספציפיות של חלבוני fluorescently שכותרתו מסיסים. פרוטוקולים מפורטים מסופקים לקחת בחשבון את חוסר האחידות של תאורת ניאון, ולקבוע את עוצמת fluorophore יחיד באמצעות כושר גאוס במרחק שווה. לבסוף, אנו מתארים את השימוש של microtubules המפולח ללמוד תנועות microtubule תלוי של microbeads מצופה החלבון, המספקים תובנות על יכולת של חלבוני מנוע וnonmotor שונים לdepolymerization microtubule זוג לתנועת מטענים התהליכית.

חלבון מעקב עם depolymerizing microtubule מסתיים. רכיב Dam1 kinetochore שמרים הוא ללא ספק הקצה-הגשש הטוב ביותר של microtubule depolymerizing מסתיים 14. מורכב 10-מקטע זה מסומן עם GFP יכול לבוא לידי ביטוי בקלות ומטוהר מתאי חיידקים 18,38, ולכן אנו ממליצים להשתמש בו כביקורת חיובית עבור assay מ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח של תנועות עם קצות microtubule פירוק.

הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

מדריך שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרפיה של יתושים

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...