Name: preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke FI Ataullakhanov for å bidra til å utvikle og produsere gjenbruk flyt kamre, N. Dashkevich, N. Gudimchuk og A. Korbalev for å gi bilder for tall, N. Gudimchuk og P. Zakharov for å utvikle en protokoll og gi reagenser til forberede Digoxigenin-merket microtubule frø, A. Potapenko for hjelp med tekstredigering og andre medlemmer av Grishchuk lab for tips og diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH gi GM R01-098389 og en pilot stipend fra Pennsylvania Muscle Institute til ELG, som er en Kimmel Scholar, etter RFBR bevilger 12-04-00111-en 13-04-40190-H og 13 -04-40188-H, Russian Academy of Sciences Presidiet Grants (Mekanismer av Molecular Systems Integration and Molecular and Molecular Cell Biology programmer) til FI Ataullakhanov, NIH gi GM R01 GM033787 til JR McIntosh, og en Dmitry Zimin dynastiet Foundation postdoktorstilling til VAV

Nødvendig utstyr: Eksperimentene beskrevet nedenfor krever et lysmikroskop utstyrt for DIC, og fluorescens-avbildning (tabell 1). Bright feltet LED-belysning kan brukes til å forbedre oppdagelse av dekk-festet microtubule frø 37, som er vanskelig å observere med en vanlig halogenlampe. For å kontrollere væskestrøm i mikros kamre, bør oppløsningene omsettes med en peristaltisk pumpe som kan strømningshastigheter 10-100 mL / min. En sprøytepumpe kan også brukes, men...

Mange eneste molekyl analyser i dag rutinemessig bruker spesialbehandlede Dekk å drastisk redusere uspesifikke protein stikker. Prosedyren vi beskriver her er en endring av den opprinnelige protokoll utviklet i Howard lab 32, og vi finner at silanizing Dekkglass er vel verdt innsatsen selv med DIC-basert perle analyser, som ikke bruker fluorescens. Chambers sammenføyd med en slik dekk viser mye renere flater, og de oppnådde resultater i nærvær av løselige mikrotubulus-bindende protein er mer reproduserb...

Mikrotubuli er svært konservert cytoskeletal strukturer som er viktige for cellulær arkitektur, cellemotilitet, celledeling, og intracellulær transport en. Disse dynamiske polymerer montere fra tubulin i nærvær av GTP, og de ​​slår spontant mellom vekst og forkorte 2. Mikrotubuli er meget tynn (bare 25 nm i diameter) derfor spesielle optiske teknikker for å forbedre kontrasten bør brukes til å observere mikrotubuli med et lysmikroskop. Tidligere arbeid med disse polymerer undersøkt deres dynamiske oppførsel ved hjelp av kontrast differensial forstyrrelser (DIC) 3. Denne og lignende studier in vitro viste at under typiske eksperimentelle forhold, mikrotubuli gjennomgå katastrofe og bryteren til depolymerization bare sjelden, en gang hver 5-15 min (denne frekvensen er for 7-15 mm løselig tubulin konsentrasjon undersøkt ved 28-32 ° C ) 4.. Forskjellige teknikker har således vært foreslått å induce microtubule depolymerisering på en kontrollert måte. Microtubule matfett kan utløses ved å vaske vekk oppløselig tubulin 5,6, skjære mikrotubuli med en laserstråle 7, eller ved hjelp av segmenterte mikrotubuli 8, slik det er beskrevet her. Tidligere arbeid ved bruk av segmenterte mikrotubuli, i tillegg til stokastisk koblings polymerer har funnet at små intracellulære last, slik som kromosomer, vesikler, og protein-belagte perler, kan bevege seg ved endene av matfettet mikrotubuli 9-13. Dette fenomenet er antatt å ha en direkte implikasjon for kromosom bevegelser i mitotiske celler, og de ​​underliggende mekanismene er for tiden under aktiv etterforskning 14-16. Nylig har fluorescerende-baserte teknikker, inkludert total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, blitt ansatt for å studere motilitet med dynamisk microtubule ender 17-24. Fordelen med denne metoden er at den tillater undersøkelse av interaksjonens mellom mikrotubuli og microtubule bindende proteiner i sanntid ved hjelp av proteiner merket med forskjellige fluorophores. Flere protein komplekser ble funnet å flytte processively med elongating og / eller forkorte microtubule ender. De omfatter microtubule-assosiert proteiner Dam1 10,12,18, Ska1 19, og XMAP215 20, samt kinesin motorer Kif18A 21,22, MCAK 23 og CENP-E 24. Disse proteinene vise processive tip-sporing, noe som er fundamentalt forskjellig fra de klassiske tip-sporing proteiner som EB1 25. Selv EB1 molekyler og de ​​tilhørende partnere ser ut til å være stabilt forbundet med dynamisk microtubule ender, kan de individuelle molekyler forblir bundet til microtubuli spissen for bare ~ 0,8 sek, i rask utveksling med det oppløselige bassenget 26.. I kontrast, processive tip-trackere, som Dam1, reise med microtubule ender for mange mikron, og deres tilknytning til microtubule tips kan vare for mnoen sekunder. Spissen krets tid, i tillegg til den resulterende hastighet på sporing, avhenger sterkt av hvor mange molekyler som danner spiss-sporing kompleks 27. Større protein ensembler er vanligvis mye bedre tip-trackere. For eksempel kan slike komplekse sammenstillinger som de isolerte gjær kinetochores forbli koblet til microtubule ender i timevis 28. Noen microtubule-bindende proteiner, f.eks Ndc80 kinetochore proteinkompleks, har blitt funnet å være ute av stand til å følge med microtubule ender ved en enkelt molekyl-nivå, men Ndc80 er svært effektiv i å kople bevegelsen av vulsten last 19,29-31. Derfor, for å forstå mekanismen for tip-sporing av forskjellige proteinkomplekser, så vel som deres biologiske roller, er det viktig å undersøke tip-sporing som en funksjon av antallet molekyler i tupp-sporing kompleks, så vel som for å fastslå evnen til disse kompleksene for å oppvise kollektiv motilitet på overflaten av vulsten last. (Figur 1a). For det første er de kommersielt tilgjengelige glassplater modifisert for å feste korte polyetylenrør (protokoll 1). Den gjenbrukmikros flyt kammeret er deretter satt sammen fra en slik sklie og kjemisk eller plasma-renset og silanbehandlet dekkglass (protokoll 2) 32-34. Den resulterende kammervolum er bare 20 til 25 pl (eller så lite som 15 pl, note 3 i protokoll 1), inklusive volumet av innløpsslangen. Kommersielt tilgjengelige strømningskamrene kan også benyttes, men deres volum er vanligvis større, noe som fører til unødvendig sløsing av proteiner. Hvis et større kammer anvendes, bør volumet av alle løsninger i protokollene nedenfor skaleres proporsjonalt. Microtubule frø blir deretter fremstilt for eksempel ved bruk av langsomt hydrolyserbar GTP analog, GMPCPP (Guanosine-5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfat) (protokoll 3, se også Hyman &lt;em&gt; et al. 35). Frøene blir immobilisert på en renset dekkglass og overflaten deretter blir sperret for å forhindre ikke-spesifikk absorpsjon av andre proteiner 32 (protokoll 4 beskriver frø immobilisering ved hjelp av Digoxigenin). De segmenterte mikrotubuli kan deretter fremstilles ved bruk av Protocol 5. Den viktigste begrunnelsen for denne tilnærmingen er at dynamiske microtubule polymerer, som danner i nærvær av GTP, kan stabiliseres midlertidig ved å legge de korte &quot;caps&quot; av stabile tubulin segmenter, som inneholder GMPCPP. Disse hetter også inneholde Rhodamine merkede tubulin, slik at de kan fjernes ganske enkelt ved å lyse opp synsfelt med en 530 til 550 nm laser eller kvikksølv buelampen (Protokoll 6) 36. Fluorescens intensiteten av tip-sporing signal kan deretter brukes til å beregne antallet molekyler som reiser med demontering microtubule endene, tar hensyn til ujevnheter i mikroskop feltet belysning (Protokoll 7). En tilsvarende metode kan benyttesfor å studere interaksjoner mellom depolymerisering av mikrotubuli og protein-belagte perler, fremstilt som beskrevet i 27 (protokoll 8). Noen proteiner lett vil binde seg til veggene av segmenterte mikrotubuli, men laser pinsett kan også brukes til å holde vulsten i nærheten av mikrotubulus veggen, for derved å fremme binding.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

Microtubule depolymerisering kan gi kraft til å transportere forskjellige proteinkomplekser og protein-belagte perler in vitro. De underliggende mekanismene er antatt å spille en viktig rolle i de microtubule avhengige kromosom bevegelser under celledeling, men de relevante proteiner og deres eksakte roller er dårlig definert. Således er det et økende behov for å utvikle analyser som brukes til å studere slike motility in vitro ved hjelp av rensede komponenter og definert biokjemiske miljø. Mikrotubuli, derimot, er iboende ustabile polymerer, deres veksling mellom vekst og forkortelse er stokastisk og vanskelig å kontrollere. Protokollene vi beskriver her dra nytte av segmenterte mikrotubuli som er gjort med den photoablatable stabiliserende caps. Depolymerization av slike segmenterte mikrotubuli kan utløses med høy tidsmessig og romlig oppløsning, og dermed hjelpe studier av motilitet ved demontering microtubule endene. Denne teknikken kan brukes til carry med en kvantitativ analyse av antallet molekyler i fluorescently merkede protein komplekser, som beveger processively med dynamisk microtubule ender. For å optimalisere et signal-til-støy-forholdet i denne og andre kvantitative fluorescerende analyser, bør dekkglass behandles for å redusere ikke-spesifikk absorpsjon av løselige fluorescensmerket-merkede proteiner. Detaljerte protokoller er anordnet for å ta hensyn til ujevnheter av fluorescerende lys, og å bestemme intensiteten av en enkelt fluorofor ved hjelp av like langt gaussisk form. Til slutt beskriver vi bruk av segmenterte mikrotubuli å studere microtubule avhengige bevegelser av protein-belagt microbeads, og gir innsikt i evnen til ulike motor-og nonmotor proteiner til par microtubule depolymerization til processive cargo bevegelse.

Protein sporing med depolymerisering microtubule ender. Gjær kinetochore komponent Dam1 er uten tvil den beste spissen-tracker av depolymerisering microtubule slutter 14. Denne 10-subenheten kompleks merket med GFP kan lett uttrykk og renset fra bakterieceller 18,38, så vi anbefaler å bruke det som en positiv kontroll for tipset-sporing analysen. En fluoriserende protein som sporer med depolymerisering enden av en microtubule blir sett på som en lys fluorescerende flekk stadig ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Mikrotubuli er iboende ustabile polymerer, og deres veksling mellom vekst og forkortelse er stokastisk og vanskelig å kontrollere. Her beskriver vi protokoller ved hjelp av segmenterte mikrotubuli med photoablatable stabiliserende caps. Depolymerization av segmenterte mikrotubuli kan utløses med høy tidsmessig og romlig oppløsning, og dermed hjelpe analyse av bevegelser med demontering microtubule endene.

Utarbeidelse av segment mikrotubuli å studere bevegelser drevet av demontering mikrotubulus Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produksjon av<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Ekstrakter å identifisere microtubule-tilknyttede RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Tilberedning av Mgm101 rekombinasjon Protein av MBP-baserte Tagging Strategi

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Bruke Caco-2 celler å studere Lipid Transport av tarmen

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Måling av Mikrotubulinettverket Dynamics ved spinning disk mikroskopi i Monopolar mitotisk aksling

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Undersøker Flagella-drevet motilitet i Escherichia coli ved å bruke tre etablerte teknikker i en serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

En trinnvis guide til Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...