Name: preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить FI Атауллаханов за помощь в разработке и производстве многоразовые камеры потока, Н. Дашкевича, Н. Gudimchuk и А. Korbalev за предоставление фотографий для фигур, Н. Gudimchuk и П. Захарова для разработки протокола и предоставления реагенты подготовить дигоксигенином меченных семена микротрубочек, А. Потапенко за помощь в редактировании текста и других членов Грищук лаборатории для советов и дискуссий. Эта работа была частично поддержана NIH грант GM R01-098389 и пилот грант Пенсильвания мышц института в ELG, который является Киммел Академия, грантов РФФИ 12-04-00111-А, 13-04-40190-H и 13 -04-40188-Н, русский академия наук Президиума грантов (Механизмы молекулярных систем интеграции и молекулярной и молекулярной клеточной биологии программ) в FI Атауллаханов, NIH грант GM R01 GM033787 к JR Макинтош, и докторантуру Фонд Дмитрий Династия Зимин в VAV

Необходимое оборудование: Эксперименты, описанные ниже, требуют светового микроскопа оборудованная для ДВС и флуоресцентной томографии (табл. 1). Яркий поле светодиодная подсветка может быть использована, чтобы значительно улучшить обнаружение покровное подключени...

Многие одинокие анализы молекул в настоящее время обычно используют специально обработанные покровные резко снизить неспецифическую налипание белка. Процедура мы описываем здесь является модификацией оригинального протокола, разработанного в лаборатории Ховард 32, и мы наход?...

Микротрубочки высоко консервативны цитоскелета структур, которые важны для клеточного архитектуры, подвижности клеток, клеточного деления, и внутриклеточного транспорта 1. Эти динамические полимеры собрать из тубулина в присутствии ГТФ, и они спонтанно переключения между ростом и сокращения 2. Микротрубочки являются очень тонкими (всего 25 нм в диаметре), следовательно, специальные оптические методы для повышения контрастности должен быть использован для наблюдения микротрубочки с помощью оптического микроскопа. Предыдущая работа с этих полимеров рассмотрены их динамическое поведение с использованием дифференциальной помехи контраст (DIC) 3. Этот и подобные исследования в пробирке показали, что в типичных условиях эксперимента, микротрубочки пройти катастрофу и перейти к деполимеризации редко, раз в 5-15 мин (эта частота для 7-15 мм растворимого концентрации тубулина рассматриваемой при 28-32 ° С ) 4. Различные методы, таким образом, было предложено индукэ микротрубочек деполимеризации в управляемом режиме. Микротрубочек сокращение может быть вызвано смывая растворимый тубулина 5,6, резка микротрубочки с помощью лазерного луча 7, или с использованием сегментированного микротрубочек 8, как описано здесь. Предыдущие работы с использованием сегментированные микротрубочки, а также стохастически переключения полимеры, было установлено, что небольшие внутриклеточные грузы, такие как хромосом, везикулы и белковых покрытием шариков, можно переместить на концах укорочение микротрубочек 9-13. Это явление, как полагают, прямое влияние на хромосомных движений в митотических клетках, и основные механизмы находятся в стадии активного расследования 14-16. Недавно люминесцентные основе методики, в том числе полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии, были использованы для изучения моторики с динамическим микротрубочки заканчивается 17-24. Преимущество этого подхода состоит в том, что она позволяет исследование взаимодействияс между микротрубочек и микротрубочек-связывающих белков в режиме реального времени с использованием белков, меченных разными флуорофорами. Несколько белковые комплексы были найдены двигаться поступательно с удлинения и / или сокращения микротрубочек концы. Они включают в себя микротрубочек связанных белков Dam1 10,12,18, Ska1 19, и XMAP215 20, а также кинезин двигатели Kif18A 21,22, MCAK 23 и CENP-E 24. Эти белки обладают поступательного наводку отслеживание, которое принципиально отличается от классических наконечника отслеживания белков, как EB1 25. Хотя EB1 молекулы и связанные с ними партнеры по-видимому, остаются стабильно связан с динамическим микротрубочек заканчивается, отдельные молекулы остаются связанными с наконечником микротрубочек только ~ 0,8 сек, быстро обмена с растворимым бассейне 26. В противоположность этому, поступательного наконечник-трекеры, как Dam1, путешествовать с микротрубочек заканчивается для многих микрон, и их связь с советами микротрубочек может длиться млюбые секунд. Кончик время ассоциация, а также в результате скорость отслеживания, сильно зависит от числа молекул, которые формируют наконечник отслеживания комплекс 27. Большие ансамбли белка, как правило, гораздо лучше наконечник-трекеры. Например, такие сложные агрегаты как изолированных дрожжей кинетохорах может оставаться в сочетании с микротрубочки заканчивается в течение нескольких часов 28. Некоторые микротрубочки-связывающие белки, например кинетохор белкового комплекса Ndc80, как было установлено, не сможет отслеживать с микротрубочки заканчивается на уровне одной молекулы, но Ndc80 очень эффективно в соединительном движение шарика груза 19,29-31. Таким образом, чтобы понять механизм наконечника слежения различными белковыми комплексами, а также их биологических функций, важно изучить наконечник отслеживания в зависимости от числа молекул в наконечнике отслеживания комплекса, а также для определения Способность этих комплексов проявляют коллективную подвижность на поверхности шарика груза. (рис. 1А). Во-первых, коммерчески доступные предметные стекла были изменены, чтобы прикрепить короткую трубку из полиэтилена (Протокол 1). Многоразовые камеры микроскопии поток затем собирают из такого слайда и химически или плазменный очищены и Силанизированные покровное (протокол 2) 32-34. В результате объем камеры составляет всего 20-25 мкл (или как малые, как 15 мкл, см. примечание 3 в Протоколе 1), в том числе объем впускной трубки. Коммерчески доступные камеры потока также могут быть использованы, но их объем, как правило, больше, что приводит к ненужному белков. Если увеличение размера камера используется, объем всех решений в поле ниже протоколов должны быть расширены пропорционально. Семена микротрубочек затем получают, например, с помощью медленно гидролизуемую аналога ГТФ, GMPCPP (Гуанозин-5&#39;-[(α, β)-methyleno] трифосфат) (протокол 3, см. также Хайман &lt;EM&gt; и др.. 35). Семена иммобилизуют на очищенную покровное и поверхность впоследствии заблокирован, чтобы предотвратить неспецифическую абсорбцию других белков 32 (протокол 4 описывает семена иммобилизацию с помощью дигоксигенин). Сегментированного микротрубочки могут быть получены с использованием протокола 5. Основным обоснованием для такого подхода является то, что динамические полимеры микротрубочки, образующие в присутствии ГТФ, можно стабилизировать временно, добавив короткие &quot;шапки&quot; стабильных сегментов тубулина, которые содержат GMPCPP. Эти шапки также содержат Родамин-меченого тубулина, таким образом, они могут быть удалены, просто освещая поле зрения с помощью лазера на 530-550 нм или дуговой ртутной лампы (протокол 6) 36. Интенсивность флуоресценции сигнала наконечник отслеживания затем могут быть использованы для оценки количества молекул, которые путешествуют с разборки концах микротрубочек, принимая во внимание неравномерность освещения поля микроскоп (протокол 7). Аналогичный подход может быть использованизучить взаимодействие между деполимеризации микротрубочек и белка покрытием шариков, полученный, как описано в (27 протокола 8). Некоторые белки будут легко связываются с стенок сегментированных микротрубочек, но лазерные пинцеты также может быть использован для хранения шарик около микротрубочек стене, тем самым способствуя его связывания.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

Микротрубочек деполимеризации может обеспечить силу для перевозки различных белковых комплексов и белковые покрытием бусы в пробирке. Основные механизмы, как полагают, играют жизненно важную роль в микротрубочки зависит движений хромосом во время деления клеток, но соответствующие белки и их точные роли плохо определены. Таким образом, существует растущая потребность в разработке анализов, с которой для изучения такой моторику в пробирке с использованием очищенных компонентов и определенный биохимический среду. Микротрубочки, однако, по сути своей нестабильными полимеры; их переключение между ростом и сокращением является стохастической и трудно контролировать. Протоколы мы описываем здесь воспользоваться сегментированных микротрубочек, которые сделаны с photoablatable стабилизации шапки. Деполимеризация таких сегментированных микротрубочек могут быть вызваны с высоким временным и пространственным разрешением, тем самым способствуя исследования моторики на разборки концах микротрубочек. Этот метод может быть использован до примерноRRY количественный анализ числа молекул в флуоресцентно меченных белковых комплексов, которые движутся поступательно с динамическим микротрубочек заканчивается. Для оптимизации отношения сигнал-шум в этом и других количественных флуоресцентный виды анализа, покровные должны рассматриваться, чтобы уменьшить неспецифическую поглощение растворимых дневно-меченых белков. Подробные протоколы предоставляются учитывать неравномерность флуоресцентного освещения, и определить интенсивность одной флуорофором использованием эквидистантный Gaussian нужным. Наконец, мы опишем использование сегментированных микротрубочек учиться микротрубочек в зависимости от движений микросфер белковых покрытием, обеспечивая полное представление о способности различных моторных и nonmotor белков в пары микротрубочек деполимеризации к поступательного движения грузов.

Белки слежения с деполимеризующим микротрубочек заканчивается. Дрожжи кинетохор компонент Dam1 на сегодняшний день лучший совет-трекер из деполимеризующих микротрубочки заканчивается 14. Этот 10-субъединица комплекс помечены GFP может быть легко выражено и очищают от бакт...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Микротрубочки нестабильны полимеры и их переключение между ростом и сокращением является стохастической и трудно контролировать. Здесь мы опишем протокола с сегментированные микротрубочки с photoablatable стабилизирующих колпачками. Деполимеризация сегментированных микротрубочек могут быть вызваны с высоким временным и пространственным разрешением, тем самым способствуя анализ движений с разборки концах микротрубочек.

Подготовка сегментированных микротрубочек исследовать движение приводится в действие разборки микротрубочек Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Компьютерные Стимулы животной модели

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Выделение и очистка Drosophila Периферийные Нейроны магнитными бисера Сортировка

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Производство<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Яйцо экстракты Определить микротрубочек связанных РНК

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Подготовка Mgm101 рекомбинации белка на основе МВР тегов стратегии

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Использование CaCO 2-Cells по изучению транспорта липидов в кишечнике

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Измерение динамики микротрубок с помощью вращающейся микроскопии диска в монополярных митотическом спинное

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Исследование подвижности жгутиков у кишечной палочки путем применения трех установленных методов в серии

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Пошаговое руководство по электроантенографии комаров

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...