Name: preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Författarna vill tacka FI Ataullakhanov för att hjälpa till att designa och tillverka återanvändningsbara flödeskammare, N. Dasjkevitj, N. Gudimchuk och A. Korbalev för att ge bilder för siffror, N. Gudimchuk och P. Zakharov för att utveckla ett protokoll och ge reagenser förbereda digoxigeninmärkta mikrotubuli frön, A. Potapenko för hjälp med textredigering och andra medlemmar av Grishchuk labbet för tips och diskussioner. Detta arbete stöddes delvis av NIH bevilja GM R01-098.389 och en pilot bidrag från Pennsylvania Muscle Institute till ELG, som är en Kimmel Scholar, genom RFBR beviljar 12-04-00111-a, 13-04-40.190-H och 13 -04-40188-H, Russian Academy of Sciences Presidium Grants (Mekanismer för Molecular Systems Integration och Molecular and Molecular Cell Biology program) till FI Ataullakhanov, NIH bevilja GM R01 GM033787 till JR McIntosh, och en Dmitry Zimin Dynasty Foundation postdoktorsstipendium till VAV

Utrustning som krävs: Experimenten beskrivs nedan kräver ett ljusmikroskop utrustat för DIC och fluorescens avbildning (Tabell 1). Ljusa fält LED-belysning kan användas för att avsevärt förbättra upptäckten av täcklösa mikrotubuli frön 37, som är svåra att observera med en vanlig halogenlampa. För att styra vätskeflödet i mikroskopi kamrarna bör de lösningar som skall utbytas med en peristaltisk pump med förmåga att flödeshastigheter från 10 till 100 |...

Många enda molekyl analyser numera rutinmässigt använda specialbehandlade täckglas för att drastiskt minska ospecifika protein fastnar. Det förfarande som vi beskriver här är en modifikation av den ursprungliga protokoll som utvecklats i Howard lab 32, och vi tycker att silanisering täckglasen är väl värt ansträngningen även med DIC-baserade pärla analyser, som inte använder fluorescens. Chambers monterade med sådana täck visar mycket renare ytor, och de resultat som erhållits i närvaro av...

Mikrotubuli är starkt konservativa cytoskelettala strukturer som är viktiga för cellulära arkitektur, cellmotilitet, celldelning, och intracellulär transport 1. Dessa dynamiska polymerer ihop från tubulin i närvaro av GTP, och de byter spontant mellan tillväxt och förkorta 2. Mikrotubuli är mycket tunna (endast 25 nm i diameter) därför speciella optiska tekniker för att öka kontrasten bör användas för att observera mikrotubuli med ett ljusmikroskop. Tidigare arbete med dessa polymerer sökte deras dynamiska beteende med hjälp av differential interferens kontrast (DIC) 3. Denna och liknande studier in vitro visade att under typiska experimentella förhållanden, mikrotubuli genomgår katastrof och byta till depolymeriseringen sällan, en gång varje 5-15 min (denna frekvens är för 7-15 mM löslig tubulin koncentration undersöks vid 28-32 ° C ) 4. Olika tekniker har sålunda föreslagits att induktionse mikrotubul depolymerisation på ett kontrollerat sätt. Mikrotubuli förkortning kan utlösas genom att tvätta bort löslig tubulin 5,6, skära mikrotubuli med en laserstråle 7, eller med hjälp av segmente mikrotubuli 8, som beskrivs här. Tidigare arbete med användning av segmenterade mikrotubuli samt stokastiskt omkopplings polymerer har funnit att små intracellulära laster, såsom kromosomer, vesiklar, och proteinbelagda pärlor, kan röra sig vid ändarna av matfettet mikrotubuli 9-13. Detta fenomen tros ha en direkt implikation för kromosom rörelser i mitotiska celler, och de bakomliggande mekanismerna är föremål för pågående utredning 14-16. Nyligen har lysrörsbaserade tekniker, bland annat total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi, använts för att studera motilitet med dynamiska mikrotubuli slutar 17-24. Fördelen med denna metod är att den tillåter granskning av interaktions mellan mikrotubuli och mikrotubuli-bindande proteiner i realtid med hjälp av proteiner som är märkta med olika fluoroforer. Flera proteinkomplex befanns röra processively med förlängning och / eller förkorta mikrotubuli ändar. De inkluderar de mikrotubulus-associerade proteiner Dam1 ,10,12,18 Ska1 19 och XMAP215 20 samt kinesin motorer Kif18A 21,22, MCAK 23 och CENP-E 24. Dessa proteiner uppvisar processive tip-tracking, som i grunden skiljer sig från de klassiska tip-tracking proteiner som EB1 25. Även EB1 molekyler och de associerade partner tycks förbli stabilt samband med dynamiska mikrotubuli ändar, de enskilda molekylerna förblir bundet till mikrotubuli spetsen för endast ~ 0,8 sek, snabbt utbyte med den lösliga pool 26. Däremot processive tip-trackers, som Dam1, resa med mikrotubuli slutar för många mikron, och deras samband med mikrotubuli tips kan pågå mnågra sekunder. Spetsen association tid, liksom den resulterande hastighet av spårning, är starkt beroende av antalet molekyler som bildar spetsen följ komplex 27. Större protein ensembler är oftast mycket bättre tip-trackers. Exempelvis kan sådana komplexa sammansättningar som de isolerade jäst kinetochores vara kopplad till mikrotubuli slutar i timmar 28. Vissa mikrotubuli-bindande proteiner, t ex Ndc80 kinetochor proteinkomplex, har visat sig vara oförmögna att spåra med mikrotubulus slutar på en enda molekyl, vilket åter Ndc80 är mycket effektiv i att koppla rörelsen hos vulsten last 19,29-31. Således, för att förstå mekanismen för dricks-spårning av olika proteinkomplex, samt deras biologiska roller, är det viktigt att undersöka spets-spårning som en funktion av antalet molekyler i spetsfölj komplex, samt att bestämma möjligheten för dessa komplex att ställa kollektiva motilitet på ytan av pärla last. (Figur 1A). Först är de kommersiellt tillgängliga glasskivor modifierats för att fästa kort polyeten slang (protokoll 1). Den återanvändbara mikroskopi flödeskammare sedan samman av en sådan bild och det kemiskt eller plasma-rengjorda och silaniserad täckglas (protokoll 2) 32-34. Den resulterande kammarvolym är endast 20-25 l (eller så små som 15 pl, se not 3 i protokoll nr 1), inklusive volymen av inloppsslangen. Kommersiellt tillgängliga flödeskammare kan också användas, men deras volym är vanligen större, vilket leder till onödigt slöseri med proteiner. Om en större kammare används, bör volymen på alla lösningar i protokollen nedan skalas proportionellt. Mikrotubulus frön framställs därefter, exempelvis med användning långsamt hydrolyserbar GTP-analog, GMPCPP (guanosin-5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfat) (protokoll 3, se även Hyman &lt;em&gt; et al. 35). Fröna är immobiliserade på en rengjord täckglas och ytan därefter blockeras för att förhindra ospecifik absorption av andra proteiner 32 (protokoll 4 beskriver frön immobilisering med hjälp digoxigenin). De segmente mikrotubuli kan sedan framställas med protokoll 5. Det viktigaste skälet till detta är att dynamiska mikrotubuli polymerer, som bildar i närvaro av GTP, kan stabiliseras tillfälligt genom att lägga till korta &quot;lock&quot; av stabila tubulin segment, som innehåller GMPCPP. Dessa kapslar innehåller också rodaminmärkt tubulin, så att de kan tas bort helt enkelt genom att belysa synfältet med en 530 till 550 nm laser eller kvicksilverbåglampa (Protokoll 6) 36. Fluorescensintensiteten hos spetsen spårningssignal kan sedan användas för att uppskatta antalet av molekyler som reser med demonteringen mikrotubuli ändar, med hänsyn till ojämnheter i mikroskop fältbelysning (Protokoll 7). Kan användas Ett liknande tillvägagångssättatt studera interaktioner mellan depolymerisering mikrotubuli och proteinbelagda pärlor, framställda såsom beskrivits i 27 (protokoll 8). Vissa proteiner kommer lätt binda till väggarna i segmente mikrotubuli, men laserpincett kan också användas för att hålla vulsten nära mikrotubulus vägg och därigenom främja dess bindning.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

Mikrotubuli depolymerisation kan ge kraft för att transportera olika proteinkomplex och proteinbelagda pärlor in vitro. De bakomliggande mekanismerna är tänkt att spela en viktig roll i mikrotubuli beroende kromosom rörelser under celldelning, men de relevanta proteiner och deras exakta roll är dåligt definierad. Således finns det ett växande behov av att utveckla analyser som att studera en sådan rörlighet in vitro med hjälp av renade komponenter och definierade biokemiska miljö. Mikrotubuli, men är i sig instabila polymerer, sin växling mellan tillväxt och matfett är stokastisk och svår att kontrollera. De protokoll som vi beskriver här dra nytta av de segmente mikrotubuli som görs med photoablatable stabiliserande mössor. Depolymerisation av sådana segmente mikrotubuli kan utlösas med hög tids-och rumsupplösning och därmed hjälpa studier av motilitet vid demonteringen mikrotubuli ändar. Denna teknik kan användas för att caRRY en kvantitativ analys av antalet molekyler i de fluorescensmärkta proteinkomplex, som rör sig processively med dynamisk mikrotubulus slutar. För att optimera ett signal-till-brus-förhållande i detta och andra kvantitativa fluorescerande analyser bör täck behandlas för att minska icke-specifik absorption av lösliga fluorescerande-märkta proteiner. Detaljerade protokoll finns för att ta hänsyn till ojämnheter i fluorescerande belysning, och bestämma intensiteten av ett enda fluorofor med användning ekvidistanta Gaussisk passform. Slutligen beskriver vi användandet av segmente mikrotubuli att studera mikrotubuli beroende rörelser hos de proteinbelagda mikrokulor, som ger insikt i förmågan hos olika motor-och nonmotor proteiner till par mikrotubulus depolymerisation till processiv last rörelse.

Protein spårning med depolymerisera mikrotubuli slutar. Jäst kinetochor komponent Dam1 är den absolut bästa tips-tracker för depolymerizing mikrotubuli slutar 14. Denna 10-subenhet komplex märkta med GFP lätt kan uttryckas och renas från bakterieceller 18,38, så vi rekommenderar att du använder det som en positiv kontroll för tipset-tracking-analysen. En fluorescerande protein som spårar med depolymerizing änden av en mikrotubuli ses som ett klart fluorescerande fläck...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Mikrotubuli är till sin natur instabila polymerer, och deras växling mellan tillväxt och matfett är stokastisk och svår att kontrollera. Här beskriver vi protokoll som använder segmente mikrotubuli med photoablatable stabiliserande mössor. Depolymerisation av segmente mikrotubuli kan utlösas med hög tids-och rumsupplösning, och därigenom hjälpa analys av rörelser med demonteringen mikrotubuli ändar.

Beredning av Segmente mikrotubuli att studera Motioner Driven av demonteringen mikrotubuli Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolering och rening av Drosophila Kringutrustning Nervceller av magnetiska Bead Sortering

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion av<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Ägg extrakt för att identifiera mikrotubuli-associerade RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Beredning av Mgm101 rekombinationsprotein av MBP-baserade taggning strategi

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Använda Caco-2-celler för att studera lipidtransport av tarmen

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Mätning av mikrotubuli dynamik genom spinning disk mikroskopi i monopolär mitotiska spindlar

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Undersöka Flagella-driven motilitet i Escherichia coli genom att tillämpa tre etablerade tekniker i en serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

En steg-för-steg-guide till myggelektroantennografi

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...