Name: rapid synthesis and screening of chemically activated transcription factors with gfp-based reporters
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters at JoVE.com

RSM anerkender støtte fra NSF Graduate Research Fellowship. MBN anerkender finansiering fra en Lewis-Sigler Fellowship og begavet gave Peter Lewis. DB anerkender midler fra NIH (GM046406) National Institute of General Medical Sciences Center for Kvantitativ Biologi (GM071508). Vi anerkender Christina DeCoste for assistance med flowcytometri eksperimenter.

Figur 2 indeholder en skematisk af protokol sektioner 1-3. 1.. Oprettelse af en ATF-olie <ol><li> Opret primere til PCR-amplifikation af DNA-bindende domæne af interesse. Homologi med AKT1 promotoren og hormon-receptor (som beskrevet i figur 3 og 4) tilsættes via PCR for at lette en korrekt rekombination i stammen yMN15. </li><li> PCR forstærke DBD af interesse ved hjælp af en high fidelity-polymerase. </li><li> Transformer&gt; 1 ug af oprenset PCR-produkt ind i gær ved hjælp af lithiumacetatmetoden 13. </li><li> Efter transformation, spin celler ved tophastighed i 15 sekunder i mikrocentrifuge og fjerne transformation mix. </li><li> Resuspender i ~ 200 ul sterilt vand og plade på YPD. </li><li> Den næste dag, replika pladen fra YPD på 5-FOA-plader (5-FOA-plader er fremstillet som beskrevet i Cold Spring Harbor Gær Manuel) 13. </li><li> Tillad vækst for 2-4 days og restreak mindst 5-10 kolonier på YPD. Udfør en koloni-PCR under anvendelse af primerne i tabel 1 og sekvens til at kontrollere optagelsen. </li></ol> 2. Oprettelse af ATF Plasmid Reporter <ol><li> Bestem bindingssted ATF (sandsynligvis komme fra litteraturen). </li><li> Order ønskede bindende region som oligoer (eller Ultramers, hvis nødvendigt). Bestille som øverste og nederste strenge med korrekte udhæng for Notl &amp; XbaI som vist i tabel 2. </li><li> Fortynd oligos til ækvimolære koncentrationer (100 um). </li><li> Phosphorylere anvendelse af T4-polynukleotidkinase og derefter annealer i en thermocycler. Reaktionsbetingelserne er i tabel 3. </li><li> Digest ~ 1-2 ug pMN8 med NotI-HF og Xbal i 1 time ved 37 ° C (reaktionsbetingelser i tabel 4). </li><li> Geloprens rygraden båndet. </li><li> Fortynd den rensede rygrad til 10 ng / ul. </li><li> Fortynd dobbeltstrenget, phosphorylated bindingssted til 5x den molære koncentration af rygraden per gl. </li><li> Anvendelse af T4 DNA-ligase, ligere de bindingssteder i det fordøjede rygraden ved stuetemperatur i 30 minutter (tabel 5). </li><li> For transformation, tilsæt halvdelen af ligeringsreaktion til 50 pi standard, kemisk kompetente Escherichia coli, såsom XL1-Blue eller DH5-alfa. </li><li> Varmechok celler til 45 sekunder i et 42 ° C vandbad og derefter placere på is i 2 min. </li><li> Tilføj 900 ul SOC-medium transformation reaktion. </li><li> Vokse ved 37 ° C i 1 time på en rulle tromlen. </li><li> Spred 100-200 celler ul pr LB + AMP (100 ug / ml) plader og inkuberes natten over. </li><li> Grow up E. coli i LB + AMP væske og høst plasmid-DNA. Sequence kontrollere nye reporterplasmid fra ligation kolonier ved hjælp af primeren 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;. </li><li> Omdan ny reporterplasmid i ATF-indeholdende gær strain fra § 1 ved hjælp af lithium-transformation. </li></ol> 3. Kvantificere virkningen af ​​ATF Induction om Gene Expression Brug GFP Reporter Forberedelse af prøver: <ol><li> Gør 25 mM β-østradiol lager (10 ml ethanol + 0,0681 g β-østradiol). Hold nedkølet. </li><li> Grow ATF + Reporter-holdige stamme natten over i 5 ml SC-URA. </li><li> Få ni 250 ml ryste kolber, og der tilsættes 25 ml SC-URA til hver. </li><li> Tilføj 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM eller 10 uM β-estradiol. Dette gøres lettest ved at gøre 10-fold serielle fortyndinger af 25 mM β-østradiol lager. For en slutkoncentration på 10 uM β-estradiol, tilsættes 10 ul af 25 mM β-østradiol lager til 25 ml SC-URA. </li><li> Tilføj 125 ul overnatskulturer til kolber (1:200 fortynding). </li><li> For de 2 resterende kolber, podes med en konstitutiv GFP producerende strain og en stamme, der mangler GFP. Disse er nødvendige til kalibrering af flowcytometeret. </li><li> Ryst ved 200 rpm ved 30 ° C i 12-18 timer. Bemærk: Den optimale inkubationstid bestemmes ved at identificere når GFP induktion ændrer ikke længere efter tilsætning af β-estradiol. </li><li> Tag 500 ul af hver kultur og spin ned i separate 1,7 ml mikrocentrifugerør. </li><li> Aspirer SC-URA. </li><li> Vask en gang i 1 ml PBS +0,1% Tween-20 og aspirat. </li><li> Der tilsættes 1 ml PBS +0,1% Tween-20 og resuspender. </li><li> Der tilsættes 1 ml PBS +0,1% Tween-20 til Falcon-rør. </li><li> Tilsæt de resuspenderede celler til 5 ml rør (slutvolumen = 2 ml) (kan opbevares ved 4 ° C i adskillige dage). </li><li> Valgfrit: soniker celler let for at bruddet eventuelle klumpet celler. Flowcytometrianalyse: Oversigt: fluorescens 10.000-100.000 celler typisk analyseres per prøve. Data kan behandles enten i FlowJo eller ved hjælp af brugerdefinerede scripts i Matlab ellerR. Sørg for at kalibrere spænding GFP kanalen ved hjælp af GFP-positive og negative kontroller. Når FCS Filerne eksporteres, et script som den i figur 6 sammen med funktions fca_readfcs ( <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a> kan) bruges til at behandle oplysninger. </li><li> Udfør flowcytometri. <ol><li> Brug frem scatter (FSC) og sidespredning (SSC) for at identificere gærceller. </li><li> Indstil flowet til ~ 3.000 celler / sek. </li><li> Mål GFP (FITC kanal). </li><li> Når der er indsamlet data, eksport. FCS-filer </li></ol></li><li> Load MATLAB. </li><li> Flyt. FCS-filer, fcs_readfcs.m og et script svarer til den fra Figur 6 til den samme mappe. </li><li> Ændre den nuværende arbejdsmappe til mappen der indeholder de data og scripts. </li><li> Kør scriptet fra figur 6 (bemærk:legende er blevet indtastet manuelt til at producere, hvad der ses i figur 7). </li></ol> 4.. Kvantificere virkningen af ​​ATF induktion på cellevækst <ol><li> Fra frosne lagre, stribe både (1) en ATF-holdige stamme og (2) en ATF-mangler stamme (såsom yMN15) på separate YPD plader. </li><li> Efter 2 dages vækst, pode separate dyrkningsrør indeholdende 5 ml YPD væske med hver stamme og vokse natten over ved 30 ° C. </li><li> Udfør 10-fold seriefortyndinger af en 0,25 mM β-østradiol stamopløsning op til 10.000-fold (0,025 uM β-østradiol) i 100% ethanol. </li><li> Tilsæt 40 ​​ul overnatskulturer til 10 ml YPD flydende (1-250 fortynding). </li><li> For hver stamme, tilsættes 96 pi fortyndede celler til 18 brønde i en plade med 96 brønde. </li><li> Tilsæt 4 pi β-østradiol til cellerne. Et væsentligt punkt er at sikre hver brønd har den samme mængde af det samlede ethanol. (Alternativt kan en mo<html> re kan anvendes koncentreret bestand af β-østradiol og efterfølgende fortyndet til det punkt, effekten af ​​ethanol på væksten er ikke målbar). </li><li> Udfør i tre eksemplarer. Tre af brønde til hver stamme bør være ethanol kun kontrol. </li><li> Dæk 96-brønds plade i gasgennemtrængelig membran. </li><li> Overvåge væksten (OD 600) i plade-læser. </li><li> Kvantificere de vækstrater ved hjælp af enhver antal standard metoder såsom at finde den maksimale hældning. Bemærk: Vi har haft god succes med open source software-pakke grofit 14, som løber i R-programmering miljø Det er værd at nævne, at mens vækstraterne er beregnet ud fra 96-brønds plade analyser i forhold til ryste-kolber (25 ml kulturer). er ikke nødvendigvis de samme (på grund af både forskelle i fysiologi og i instrumentering), har vi observeret, at de relative vækstrater er ens (selvom det måske ikke altid tilfældet). </li></ol>TLE &quot;&gt; 5.. Opret Inducerbare Genomisk Alleler <ol><li> Opnå pMN10 en noncentromeric plasmid med ATF-responsiv promotor fra pMN8 fusioneret til KanMX (i den modsatte retning). </li><li> Restriktionsfordøjelsesprodukt vektorgrundstrukturen og gel ekstrakt som i afsnit 2. </li><li> Anneal, phosphorylere, og liger oligos indeholder passende bindingssteder som beskrevet i afsnit 2. </li><li> Sekvens verificere. Dette plasmid vil nu fungere som en DNA-template til at skabe den inducerbare allel. </li><li> Anskaf gær stamme, der udtrykker den tilsvarende ATF af interesse. </li><li> PCR amplificere KanMX-Promoter kassette (~ 2 kb) under anvendelse af primere fra tabel 6. </li><li> Omdan PCR produktet i ATF-udtrykkende stamme under anvendelse af lithiumacetatfremgangsmåden. </li><li> Plate på YPD og replika plade på YPD + G418 den følgende dag. </li><li> Bekræfte passende indsættelse af promotoren under anvendelse af forward primeren (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) og en revers primer interne the gen, hvis promotor er blevet udskiftet. Den reverse primer er typisk designet til at være mellem 200-300 bp nedstrøms for den første ATG 15. Det endelige PCR-produkt er ~ 1,2 kb. </li></ol>

<ol>
	<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid,+tunable,+single-gene+specificity+in+yeast.">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic acids res. 41, e57 (2013).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131, 129-134 (1993).</li><li>Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+oestrogen+receptor+ligand-binding+domain+as+an+improved+switch+for+the+regulation+of+heterologous+proteins.">A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins.</a> Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Analysis+of+mRNA+Molecules+Using+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Vis. Exp. (76), e50382 (2013).</li><li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway.">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).</li><li>Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activator/repressor+dual+system+allows+tight+tetracycline-regulated+gene+expression+in+budding+yeast.">An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast.</a> Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+aryl+hydrocarbon+receptors+for+bioassay+of+aryl+hydrocarbon+receptor+ligands+in+transgenic+tobacco+plants.">Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).</li><li>Hickman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+regulation+of+sulfur+and+phospholipid+metabolism+reflects+the+importance+of+methylation+in+the+growth+of+yeast.">Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).</li><li>Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+protein+depletion+by+genetically+controlled+deprotection+of+a+dormant+N-degron.">Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 267 (2009).</li><li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells.">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nat. methods. 6, 917-922 (2009).</li><li>Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=grofit:+Fitting+Biological+Growth+Curves+with+R.">grofit: Fitting Biological Growth Curves with R.</a> J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).</li><li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150, 647-658 (2012).</li><li>Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+specific+receptor-ligand+pairs+for+use+in+the+creation+of+gene+switches.">Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).</li><li>McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+orthogonal+ligand+specificity+in+a+single+scaffold.">Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold.</a> Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).</li><li>Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+pathways+that+couple+cell+growth+and+division+in+yeast.">Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast.</a> Science. 297, 395-400 (2002).</li><li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression.">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol. cell. 21, 319-330 (2006).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).</li><li>Polstein, L. R., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors.">Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).</li><li>Losi, A., Gartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+chromophores,+new+photoactivation+paradigms,+trendy+applications:+flavins+in+blue+light-sensing+photoreceptors.">Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors.</a> Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuitry.">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li><li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit.">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).</li></ol>

McIsaac, Noyes, og Botstein (med andre) har afgivet en del af dette system som en Patent Disclosure.

Hormon-baserede switche beskrevet her har et væld af anvendelsesmuligheder, studere native cellebiologi til at teste evnen af en DNA-bindende domæne af interesse til at målrette en DNA-sekvens in vivo. Systemet har mange positive træk, herunder en gradueret reaktion på inducer, hurtig handling, og stram regulering (dvs.. Nogen målelig utætheder, se figur 7). Imidlertid er der stadig plads til forbedring og udvidelse. Nyligt arbejde i syntetisk biologi har understreget multiplexing syntetiske systemer og udvide repertoiret af velkarakteriserede, programmerbare DNA dele 16. Independent, betinget udtryk særskilte target gener kræver både flere inducere og DNA-bindende domæner, der mangler overlappende specificitet. Tilgængeligheden af ​​konstruerede og naturligt forekommende receptorer giver et stort sæt af dele, som at udvikle nye kunstige transkriptionsfaktorer. Udvidelse afrepertoire af indbyrdes ortogonale switche er blevet stærkt hjulpet på vej af instrueret evolution nærmer 17,18. Nuværende bestræbelser på at omprogrammere ligand-bindende specificitet af vore kunstige transkriptionsfaktorer vil blive præsenteret i fremtiden. Tidligere har de fænotypiske konsekvenser af gendeletion / overekspression blevet grundigt undersøgt i gær 19,20. Det har imidlertid ikke været ligetil at undersøge virkningen af ​​ekspression på forskellige fænotyper over et område af ekspressionsniveauer. En primær funktion i systemet, præsenteret heri er dens gradueret karakter (figur 8). Mens ofte antages, kan forholdet mellem genekspression og fænotyper af interesse ikke nødvendigvis være monoton. Kunstige transkriptionsfaktorer, såsom Z 3 EV og Z 4 EV vil gøre opgaven analyse fænotypiske responser på ændringer i genekspression ligetil. Endelig protokollerne diskutereed i dette manuskript er for teknik og karakterisering af kunstige transkriptionsfaktorer, som reagerer på β-østradiol, men et vigtigt alternativ til kemisk reagerende domæner er brugen af ​​lys-responderende domæner (såsom PhyB/Pif3, LOV, og BLUF) hvis aktiviteter er reversible uden at forstyrre den kultur vækstmediet 21-23. Light-baserede systemer lette Spatiotemporal kontrol af genekspression, protein-protein interaktioner, iontransport, og enzymatisk aktivitet, som allerede har vist kraftig 21-26. Afslutningsvis har vi præsenteret metoder til hurtig opbygning af inducerbare, kunstige transkriptionsfaktorer i gær. Denne protokol giver en skabelon for deres byggeri i forbindelse med beslægtede GFP journalister, samt metoder til analyse reporter data ved hjælp af flowcytometri og analysere effekten af ​​ATF aktivering på væksten.

Udvikling af genetiske switches i gær er af stor interesse i både akademisk og industriel forskning. I det ideelle tilfælde kan genetiske kontakter anvendes til at aktivere et bestemt gen (eller et sæt af gener), når det ønskes af eksperimentatoren. Et gen kodningssekvens anbragt nedstrøms for en syntetisk promotor ikke udtrykkes i fravær af et inducerende molekyle: efter inducer tilsætning genet bør hurtigt udtrykkes. Det er først for nylig blevet påvist, at en sådan kontakt kan manipuleres i gær, hvor der i fravær af inducer, viser stammen en deletion fænotype, men i nærvær af inducer ekspression aktiveret i forhold til niveauet af inducer i alle celler 1,2. Historisk set har betingede ekspressionssystemer i gær var stærkt på næringsstof-responsive DNA-sekvenser, herunder behandling, FO, og GAL initiativtagere (hvis aktiviteter er følsomme over for ekstracellulære niveauer af methionin, fosfat oggalactose, henholdsvis). Mens betinget udtryk kan opnås, det kommer på bekostning af væsentlige pleiotropiske effekter. Hormon receptorer, såsom de humane østrogen-receptorer har vist sig at være effektive kontakter i eukaryoter 3,4. I fravær af hormon kan et protein fusioneret til en hormonreceptor være afsondret i cytoplasmaet, hvor det interagerer med Hsp90 chaperone kompleks. Efter binding passende ligand receptoren undergår en konformationel ændring, får det til at blive frigivet fra Hsp90 chaperone komplekse og afslørende kernelokaliseringssignalet. At observere localization dynamikken af ​​en bestemt hormon-receptor-indeholdende protein, vi skabt en C-terminal fusion af Gal4dbd.ER.VP16 (GEV et syntetisk transskriptionsfaktor indeholdende Gal4p DNA-bindende domæne, det ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor og VP16) med GFP 2. Kernelokalisering blev observeret inden for 8 minutter efter tilsætning afmættende mængder af inducer, ß-østradiol, som vildtype gær er fuldstændig inaktiv. På dette tidspunkt har de fleste celler har klart synlige aktive transskription sites for GEV target gener (analyseret via fluorescens in situ hybridisering) samt fuldt modne mRNAer 2,5. GEV målgener forøget ekspression&gt; 2-fold mindre end 2,5 min 2,6 (målt ved hjælp af microarrays), hvilket viser, at det tager &lt;2,5 min for det kimære aktivator til at translokere til kernen, binde DNA og aktivere transskription. Mens flere andre on-switche er blevet anvendt i gær, der udnytter forskellige små molekyler eller narkotika (herunder de klassiske doxycyclin-skifter fra Escherichia coli 7,8 og en indigo-baserede switch 9 fra Arabidopsis thaliana), har ingen opnået den hastighed, specificitet eller trykken for regulering udstillet af hormon-baserede switche. Det er værd at nævne that hurtig off-kontakter er også blevet udviklet i gær, og arbejder typisk ved at fusionere et gen til en protease eller ubiquitinligase targetingsekvens 2,10,11,12. Evnen til hurtigt at fjerne et målprotein fra cellen letter undersøgelse af essentielle gener såvel som gener, der er tilbøjelige til genetisk undertrykkelse når udgår 10. De i denne protokol beskrevne metoder er til at bygge og karakterisering af syntetiske on-afbrydere i gær. Først viser vi, hvordan hurtigt generere genomically integrerede fusionsproteiner bestående af et DNA-bindende domæne af interesse, det ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor og VP16 (DBD-EV). Efter vores protokol, er fusionsproteinet udtrykt fra en AKT1 promotor. Vi viser derefter, hvordan du opretter en beslægtet reporter plasmid til ATF og teste dens funktionalitet ved hjælp af flowcytometri. Selvom vi forestiller disse reporter plasmider, der anvendes med nye ATF-olie (fig. 1), kan de be anvendes som reportere for en indfødt transkriptionsaktivator såvel. Endelig informationer til at teste effekten af ​​ATF aktivering på cellevækst i 96-brønds plader og for Engineering inducerbare genomiske alleler forudsat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">Expand High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:88px;">Roche</td>
			<td style="width:88px;">11 732 650 001</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">M0202S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Competent E. coli</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">18258-012</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Estradiol</td>
			<td style="width:88px;">Tocris Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">2824</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">M0201</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">PBS</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">10010-23</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">Tween-20</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">9005-64-5</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">clonNAT</td>
			<td style="width:88px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:88px;">AB-102L</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">XbaI</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">R0145S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">NotI-HF</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">R3189S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">B7204S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Glucose</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">D15-500</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Bacto-Peptone</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">211677</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">210929</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Agarose</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">214010</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:88px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:88px;">04-355-222</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">G418</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">11811-031</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:88px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:88px;">27104</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L-6883</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Salmon sperm DNA</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">93283</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">PEG 3350</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-3640</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15</td>
			<td style="width:88px;">Noyes or Botstein labs</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Luria Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Material Name</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">LSRII Flow Cyometer&#160;</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">Various Models</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:88px;">MATLAB or FlowJo</td>
			<td style="width:88px;">MATLAB or FlowJo</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">R</td>
			<td style="width:88px;">Open Source</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">For analyzing growth-rate data from plate reader.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Falcon Tubes</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">352052</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:88px;">1.7 ml Eppendorf&#160; Tubes</td>
			<td style="width:88px;">GeneMate</td>
			<td style="width:88px;">C3262-1</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">250 ml Shake Flasks</td>
			<td style="width:88px;">Corning</td>
			<td style="width:88px;">4446-250</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">96-well, flat-bottom plates</td>
			<td style="width:88px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3635</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)</td>
			<td style="width:88px;">BioTek</td>
			<td style="width:88px;">H1MG</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Breathe-Easy Membranes</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Z380059-1PAK</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:88px;">various companies</td>
			<td style="width:88px;">Various models</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">SC-Ura powder</td>
			<td style="width:88px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:88px;">114410622</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">5-FOA</td>
			<td style="width:88px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:88px;">F9001-1</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid synthesis and screening of chemically activated transcription factors with gfp-based reporters

Syntetisk biologi har til formål at rationelt at designe og bygge syntetiske kredsløb med ønskede kvantitative egenskaber, samt give redskaber til at afhøre strukturen af ​​indfødte styrekredsløb. I begge tilfælde kan evnen til at programmere genekspression i en hurtig og afstemmelige mode, uden off-target effekter, være nyttige. Vi har konstrueret gærstammer indeholdende AKT1 promotor opstrøms for en URA3 kassette efterfulgt af ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor og VP16. Ved at omdanne denne stamme med en lineær PCR produkt, der indeholder et DNA-bindende domæne og vælge imod tilstedeværelsen af URA3 kan en konstitutivt udtrykt kunstig transskriptionsfaktor (ATF) frembringes ved homolog rekombination. ATF-olie manipuleret på denne måde kan aktivere en unik målgen i nærvær af inducer for derved at eliminere både off-target aktivering og ikke-fysiologiske vækstbetingelser findes med almindeligt anvendte conditiOnal genekspressionssystemer. En simpel metode til hurtig konstruktion af GFP reporter plasmider, der reagerer specifikt med et nativt eller kunstig transkriptionsfaktor af interesse er også tilvejebragt.

<html> Figur 5 viser induktion af GFP ved Z 3 EV, Z 4 EV eller GEV over tid. Bemærk stigningen i GFP-produktion som reaktion på ATF-olie indeholdende nonyeast DNA-bindende domæner. Vi har for nylig spekuleret på, at dette skyldes disse faktorer opnår enkelt gen specificitet i gærgenomet 1. GEV alene induktion fører til aktivering / undertrykkelse af hundredvis af gener, mens Z 3 EV og Z 4 EV kun aktivere udtryk for et mål gen placeret nedstrøms for en syntetisk promotor indeholder passende bindingssteder (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;og 5&#39;- GCGGCGGAGGAG-3 &#39;, henholdsvis) 1.. Figur 7 viser den stramme regulering af systemet (ingen inducer resultater i nogen påviselig GFP), og at alle celler bliver fremkaldt som reaktion på induktor evne Z 3 EV for at fremkalde GFP tværs af en række β-estradiol-koncentrationer er vist i figur 8. <html> ent &quot;fo: keep-together.within-side =&quot; altid &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> Fig. 1. Kunstige transkriptionsfaktorer interagere med Hsp90 i fravær af β-estradiol. Når β-østradiol binder til ATF, Hsp90 dissocierer, så ATF at trænge ind i kernen og aktivere ekspression fra plasmid reporter. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> Figur 2.. Skematisk af protokol for ingeniør-stammer, der indeholder kunstige transkriptionsfaktorer og bygge / teste beslægtede GFP journalister. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; Fig. 3. Den ACT1pr-URA3-EV sekvens i stamme yMN15 på LEU2 locus. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> Figur 4.. Design af PCR-primere til amplifikation af et DNA-bindende domæne af interesse med yderligere sekvenshomologi at generere et nyt fusionsprotein, når succes omdannet til yMN15. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> Figur 5. GFP induktion af tre forskellige ATF-promotor par i respons til 1 pM β-estradiol. &lt;/ P&gt; <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> Figur 6.. Et Matlab script til forarbejdning flowcytometri data. Dette script blev tilpasset fra <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> Figur 7. Induktion af GFP ved Z 3 EV i respons på 0 μ M β-østradiol og 1 uM β-østradiol efter 18 timer af induktion. Fluorescens var også measured fra celler, der mangler GFP at illustrere den stramme regulering af Z 3 EV-system. Dette tal blev genereret med koden i figur 6.. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> Figur 8. Forholdet mellem inducer koncentration og udtryk output er gradueret med en Hill-koefficient på ~ 1. (A) Udlodning af GFP udtryk som en funktion af β-østradiol koncentration. (B) Middelværdien fluorescens fordelingerne fra (A). Dataene var egnet til funktionen G (D) = G min + (G max-G min) D n / (K n + D n) hvor D er β-østradiol dosis, G min og G max er det mindste og maksimale GFP værdier, respectively n er Hill-koefficienten og K er β-østradiol dosis, der giver ½ (G max + G min.) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> Oligonukleotidsekvens </td><td> Navn </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD Check Fremad </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD Check Reverse </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Primere til bekræftelse af korrekt fusion af DBD af interesse for østrogen-receptor. Den fremadrettede primer er homolog til AKT1 promotoren og den reverse primer er homolog med østrogenreceptoren. For typiske DBDS (~ 300 bp), PCR-produktet er &lt;1,5 kb. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Oligonukleotidsekvens </td><td> Navn </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBD binging websted ... t-3 &#39; </td><td> Top oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... DNA bindingssted omvendt ... gc-3 &#39; </td><td> Bottom oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 &#39; </td><td> Top oligo + 6x Zif268 bindingssteder </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> Bottom oligo + 6x Zif268 bindingssteder </td></tr></tbody></table> Tabel 2.. S STRUKTUR af primere for at skabe dsDNA indeholder bindende steder af interesse. At skabe Z 3 EV-responsiv promotor, oligonucleotideme Top oligo + 6x Zif268 bindingssteder og Bund oligo + 6x Zif268 Binding blev anvendt.Sekvenser til at skabe de rigtige DNA udhæng er små bogstaver. Zif268 konsensus bindingssted, GCGTGGGCG, understreges i den øverste oligo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> T4-polynukleotidkinase Buffer </td><td> 5 mikroliter </td></tr><tr><td> T4-polynukleotidkinase (@ 10.000 enheder / ml) </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Top oligo (100 uM) </td><td> 1,5 pi </td></tr><tr><td> Bottom oligo (100 uM) </td><td> 1,5 pi </td></tr><tr><td> Vand </td><td> 41 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Phosphorylere og anneal primere i en thermocycler anvendelse af 50 pi af reaktionen beskrevet ovenfor. Der er to thermocycler trin. Trin 1: 37 ° C 30 min (phosphorylering), og trin 2: 95 ° C 30 sek (trin ned 1 ° C hvert 30. sek indtil ved 4 ° C, Anneal). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> XbaI </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> NotI-HF </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Plasmid-DNA </td><td> 5 pi (1-2 ug) </td></tr><tr><td> 10x Cut Smart Buffer </td><td> 5 mikroliter </td></tr><tr><td> Vand </td><td> 38 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Restriktionsfordøjelse af plasmid pMN8 med Xbal og NotI. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> Reagens </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> Beløb </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> T4 Ligase Buffer </td><td> 2 pi </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4 Ligase </td><td> 0,2 pi </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Backbone @ 10 ng / ul </td><td> 1 pi </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> Bindingssekvenser @ 5x molære koncentration / pl </td><td> 1 pi </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Vand </td><td> 15.8 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 5. Liger bindingssteder i plasmid DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Primer </td><td> Beskrivelse </td></tr><tr><td> ~ 40 bp opstrøms for ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Forward primer til amplifikation KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-omvendte komplement (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Omvendt primer til amplifikation KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Forward primer for at gøre GCN4 promotor swap. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Revers primer for at gøre GCN4 promotor swap. </td></tr></tbody></table> Tabel 6. PCR forstærke KanMX-Promotor for at gøre titratible allel.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters at JoVE.com

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Denne protokol beskriver en eksperimentel procedure for hurtig opbygning af kunstige transkriptionsfaktorer (ATFS) med beslægtede GFP journalister og kvantificering af ATFS evnen til at stimulere GFP udtryk via flowcytometri.

Hurtig Syntese og Screening af kemisk aktiveret transkriptionsfaktorer med GFP-baserede Journalister

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Overvågning af Ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler ved hjælp af en Degron (DGN)-destabiliseret Green Fluorescent Protein (GFP)-baseret Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Synthesis of Nine-atom Deltahedral Zintl Ions of Germanium and their Functionalization with Organic Groups

Syntese af Ni-atom Deltahedral Zintl Ioner af germanium og deres Funktionalisering med organiske grupper

Although the first studies of Zintl ions date between the late 1890's and early 1930's they were not structurally characterized until many years later.1,2 ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Brug cokultur Detect Kemisk medierede interspecies Interaktioner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolation fra celle specielle befolkningsgrupper ved hjælp af laser-capture mikrodissektion Kombineret med Rapid immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...