Name: rapid synthesis and screening of chemically activated transcription factors with gfp-based reporters
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00
Duration: 9 min 22 s
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RSMは、NSF大学院研究員から資金提供を認めている。 MBNはルイス·リンディスカラフェローシップからの資金とピーター·ルイスの恵まれ贈り物を認めている。 DBは、NIH（GM046406）定量生物学のための総合医科学センター（GM071508）の国立研究所からの資金提供を認めている。我々は、フローサイトメトリー実験の支援のためにクリスティーナDeCosteを認める。

図2は、プロトコルのセクション1-3の模式図を提供しています。 1。 ATFSの作成<ol><li> PCRは、目的のDNA結合ドメインを増幅するためのプライマーを作成する。 ACT1プロモーターおよびホルモン受容体に対する相同性は、（ 図3および4に記載されるように）株yMN15に正しい組換えを容易にするために、PCRを介して添加される。 </li><li> PCRは、高忠実度ポリメラーゼを用いて、目的のDBDを増幅する。 </li><li>酢酸リチウム法13を用いて、酵母に精製されたPCR産物の&gt; 1μgのを変換する。 </li><li>形質転換後、微量15秒間最高速度で細胞をスピンし、変換ミックスを削除します。 </li><li> YPDに滅菌水、プレートの〜200μl中に再懸濁します。 </li><li> 5-FOAプレート上に、YPDから翌日、レプリカプレート（コールド·スプリング·ハーバー酵母マニュアルに記載されているよう5-FOAプレートが作られる）13。 </li><li> 2-4日間増殖を可能にAYS、およびYPD上に、少なくとも5〜10個のコロニーをrestreak。含めることを確認するために、 表1およびシーケンスのプライマーを用いてコロニーPCRを行う。 </li></ol> 2。 ATFプラスミドレポーターの作成<ol><li> （文献から来る可能性が最も高い）のATFの結合部位を決定します。 </li><li> （必要に応じて、またはUltramers）順番はオリゴとして結合領域を希望する。 表2に示すようにNotI＆XbaIでの正しいオーバーハングを有する上部と下部の鎖のように注文。 </li><li>等モル濃度（100μM）にオリゴを希釈します。 </li><li> T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化して、サーモサイクラー中でアニール。反応条件を表3に示す 。 </li><li> 37℃（ 表4の反応条件）で1時間のNotI-HF＆XbaIでpMN8のダイジェスト〜1〜2μgの。 </li><li>ゲルは、バックボーンバンドを精製する。 </li><li> 10 NG /μlに精製されたバックボーンを希釈します。 </li><li>二本鎖、ホスホリルを希釈μLあたりの背骨のモル濃度を5倍の結合部位をated。 </li><li> T4 DNAリガーゼを用いて、30分間（ 表5）を、室温で消化し ​​た骨格への結合部位を連結する。 </li><li>形質転換のために、標準の50μL、このようなXL1-ブルーまたはDH5アルファなどの化学的にコンピテントな大腸菌に半分ライゲーション反応を追加します。 </li><li>次いで、熱ショック42℃の水浴中で45秒間細胞および2分間氷上に置く。 </li><li>形質転換反応にSOC培地900μLを加える。 </li><li>ローラードラム上で1時間37℃で成長する。 </li><li> LB + AMP（100μg/ ml）をプレート当たり100〜200μlの細胞を広げ、一晩インキュベートする。 </li><li> E.育つ LB + AMPでの大腸菌の液体や収穫プラスミドDNA。シーケンスは、プライマー5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;を使用してライゲーションコロニーから新しいレポータープラスミドを確認します。 </li><li> ATF含有酵母STRに新しいレポータープラスミドを変換酢酸リチウム形質転換を用いて第1のアイン。 </li></ol> 3。 GFPレポーターを用いた遺伝子発現にATF誘導の影響を定量化サンプルを調製する。 <ol><li> 25 mMのβ-エストラジオールの在庫（β-エストラジオールのエタノール+ 0.0681グラムの10ミリリットル）を作る。冷蔵保管してください。 </li><li> 5ミリリットルのSC-URA内のATF +レポーター含有ひずみ一夜を育てる。 </li><li>入手9 250ミリリットルのフラスコを振るし、それぞれに25ミリリットルのSC-URAを追加します。 </li><li> 0 nMで、0.1 nMで、1 nMで、10 nMで、100nmであり、1μM、または10μMのβ-エストラジオールを追加します。これは、最も容易に25mMのβ-エストラジオールストックの10倍連続希釈を作製することによって行われる。 β-エストラジオール、10μMの最終濃度のため、SC-URAの25ミリリットルに25 mMのβ-エストラジオールの株式の10μlを加える。 </li><li>フラスコ（1:200希釈）を一晩培養物の125μLを加える。 </li><li> 2残りのフラスコのために、構成的にGFP産straiで接種Nと、GFPを欠損株。これらは、フローサイトメータを較正するために必要とされる。 </li><li> 12月18日時間30℃、200rpmで振とうする。 注：最適なインキュベーション時間は、GFPの誘導もはや変化がβ-エストラジオールの添加の後に時識別することによって決定される。 </li><li>各培養液500μlを取り、別の1.7ミリリットルの微量遠心チューブにスピンダウン。 </li><li>吸引SC-URA。 </li><li> 1ミリリットルのPBS +0.1％のTween-20および吸引に一度洗う。 </li><li> PBS +0.1％のTween-20および再懸濁の1ミリリットルを追加します。 </li><li>ファルコンチューブにPBS +0.1％のTween-20の1ミリリットルを追加します。 </li><li> 5ミリリットルのチューブ（最終容量= 2ml）中に再懸濁した細胞を追加する（数日間4℃で保存することができる）。 </li><li>オプション：崩壊へ軽く超音波処理細胞任意の凝集細胞。 フローサイトメトリー分析：概要：10,000〜100,000細胞の蛍光は、一般的に、サンプルごとに分析する。データは、FlowJoソフトやMATLABでカスタムスクリプトを使用するかのどちらかに処理することができるR.は、GFP陽性および陰性コントロールを使用して、GFPチャネルの電圧を校正してください。 FCSファイルがエクスポートされると、このような機能fca_readfcsと一緒に、図6の1（としてスクリプト<a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-readerは</a> ）処理するために使用することができますデータ。 </li><li>フローサイトメトリーを実行します。 <ol><li>酵母細胞を同定するために使用する前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）。 </li><li> 〜3000セル/秒に流量を設定。 </li><li> GFP（FITCチャネル）を測定します。 </li><li>データが収集されると、輸出。、FCSファイル</li></ol></li><li> MATLABをロードします。 </li><li> 。FCSファイル、fcs_readfcs.m、 図6と同じフォルダにそのようなスクリプトを移動します。 </li><li>データとスクリプトを含むフォルダに現在の作業ディレクトリを変更します。 </li><li>注意します（ 図6からスクリプトを実行します。伝説は手動で）、図7に見ているものが生成するために入力されています。 </li></ol> 4。細胞増殖に対するATFの誘導の影響を定量化<ol><li>凍結ストックから、独立したYPDプレートの上に（1）ATF-含む株と（例えばyMN15など）（2）ATF-欠損株両方で連勝。 </li><li>成長の2日後に、各菌株をYPD液体の5ミリリットルを含む別培養管に接種し、30℃で一晩増殖</li><li> 100％エタノール中で10,000倍に0.25 mMのβ-エストラジオールの原液アップ（0.025100μMのβ-エストラジオール）の10倍連続希釈を行う。 </li><li> YPD液体（1〜250希釈）10mlに一晩培養液40μlを追加します。 </li><li>それぞれの株については、96ウェルプレートの18ウェルに希釈した細胞の96μlを加える。 </li><li>細胞にβ-エストラジオールの4を添加する。重要な点は、各ウェルは、総エタノールと同じ量を持っていることを確認することです。 （代わりに、MO<html> β-エストラジオールの濃縮ストックを使用し、その後ポイントに希釈することができる再増殖に対するエタノールの影響）は測定できない。 </li><li>三重で行う。各菌株のための井戸の三つは、エタノールのみのコントロールである必要があります。 </li><li>ガス透過性膜96ウェルプレートを覆う。 </li><li>プレートリーダーの成長（OD 600）を監視します。 </li><li>このような最大勾配を求めるなどの標準的な任意の数の方法を用いて成長速度を定量化する。 注：私たちは、Rプログラミング環境で実行されるオープンソースソフトウェアパッケージgrofit 14、との良好な成功を持っていたことが言及する価値があることを96ウェルプレートアッセイから計算された成長率は（25ミリリットル文化） -振盪フラスコと比較しながら。 （原因生理学および計測の両方の違い）、我々は（これは必ずしもそうでないかもしれないが）の相対成長率が類似していることを観察してきた、必ずしも同じではありません。 </li></ol>TLE &quot;&gt; 5。誘導ゲノム対立遺伝子を作成します。 <ol><li> pMN10、（反対方向に）KanMXに融合しpMN8からATF-応答性プロモーターとnoncentromericプラスミドを得。 </li><li>制限は、第2節のように、ベクター骨格およびゲル抽出を消化。 </li><li>アニール、リン酸化、および第2章で説明したように、適切な結合部位を含むライゲーションオリゴ。 </li><li>シーケンスが確認します。このプラスミドは、今や誘導性対立遺伝子を作成するためのDNAテンプレートとして機能する。 </li><li>興味のある対応ATFを発現する酵母株を取得。 </li><li> PCRは、 表6からのプライマーを用いて、KanMX-プロモーターカセット（〜2キロバイト）を増幅。 </li><li>酢酸リチウム法を用いて、ATF-発現株へのPCR産物を変換します。 </li><li> YPD + G418へYPDとレプリカプレート上のプレートの翌日。 </li><li>フォワードプライマー（5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;）および第内部のリバースプライマーを用いて、プロモーターの適切な挿入を確認その電子プロモーター遺伝子が置換されている。リバースプライマーは、典型的には、第一ATG 15の下流200-300 bpの間になるように設計されている。最終的なPCR産物を〜1.2 KBです。 </li></ol>

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McIsaac、ノイス、およびBotstein（他の人とは）特許開示として、このシステムの一部を提出している。

ここで説明するホルモンベースのスイッチは、 生体内で DNA配列を対象とする目的のDNA結合ドメインの能力を試験するネイティブの細胞生物学を研究から、無数の用途がある。システムは、インデューサー、高速動作、および厳しい規制の段階的な応答を含む多くの望ましい特徴、持っていない（ すなわち 。測定可能な漏出を、 図7を参照）。しかし、改善と拡張の余地がある。 合成生物学における最近の研究は、多重合成システムを強調し、十分に特徴づけられた、プログラム可能なDNAの部分16のレパートリーを拡大しました。別個の標的遺伝子とは無関係に、条件式は、複数のインデューサーと重なる特異性を欠くDNA結合ドメインの両方を必要とする。設計および天然に存在する受容体の利用可能性は、新たな人工的な転写因子を開発するためにどの部分での大規模なセットを提供します。拡大する相互に直交するスイッチのレパートリーが大幅17,18に近づく方向進化によって支援されています。我々の人工的な転写因子のリガンド結合特異性を再プログラムする現在の努力は、将来的に提示される。 以前は、遺伝子欠失/過剰発現の表現型の結果は、広範囲に酵母19,20に研究されている。しかしながら、発現レベルの範囲にわたって異なる表現型上の発現の効果を研究するための簡単​​されていない。ここに提示され、システムの主な特徴は、その段階的な性質（ 図8）である。多くの場合を想定しながら、遺伝子発現と目的の表現型の間の関係は必ずしも単調でない場合があります。このような、Z 3、EV、およびZ 4、EVなどの人工的な転写因子は、直接的な遺伝子発現の変化を表現型の応答をアッセイする作業を行います。 最後に、プロトコルが議論本稿では、EDは、エンジニアリングおよびβ-エストラジオールをに応答人工転写因子を特徴づけるためのものであるが、化学的に反応するドメインへの重要な選択肢は、（このようなPhyB/Pif3、LOV、およびBLUFなど）光応答ドメインの使用であり、その活動は、培養増殖培地21-23を摂動することなく、可逆的である。光ベースのシステムは、既に証明されている21-26強力なタンパク質-タンパク質相互作用、イオン輸送、および酵素活性を、遺伝子発現の時空間制御を容易にする。 結論として、我々は、酵母における誘導、人工的な転写因子を迅速に構築するための方法を提示している。このプロトコルは、同族GFPレポーターと一緒に自分の構築のためのテンプレートを提供し、ならびにフローサイトメトリーを用いたレポーターデータを分析し、成長にATF活性化の効果を分析する方法。

酵母における遺伝子スイッチの開発は、学術と産業の両方の研究において非常に興味深いです。理想的なケースでは、遺伝子スイッチは、実験者が所望する場合にのみ、特定の遺伝子（または遺伝子セット）を活性化するために使用することができる。合成プロモーターの下流に配置された遺伝子のコード配列は、誘導分子の非存在下で発現されていません：デューサーを添加すると遺伝子が急速に表現されるべきである。これは、ごく最近、このようなスイッチは、誘導物質の非存在下で、歪みが欠失表現型を示すが、インデューサーの存在下では、発現は全ての細胞において誘導物質のレベルに比例して活性化される酵母で操作することができることが実証されている1,2。歴史的には、酵母中の条件式システムは、MET、PHO、およびGALプロモーター （活動メチオニン、リン酸の細胞外レベルに敏感であり、などの栄養素応答性DNA配列、に大きく依存してきたガラクトース、それぞれ）。条件式を得ることができるが、それは重要な多面的効果が犠牲になっている。 例えば、ヒトエストロゲン受容体などのホルモン受容体は、真核生物において有効3,4のスイッチであることが証明された。ホルモンの非存在下では、ホルモン受容体への融合タンパク質は、Hsp90のシャペロン複合体と相互作用する細胞質中に隔離され得る。適切なリガンドを結合すると、受容体は、Hsp90のシャペロン複合体から放出されるようにする、核局在化シグナルを明らかにし、コンフォメーション変化を受ける。特定のホルモン受容体含有タンパク質の局在化の動態を観察するために、我々はGal4dbd.ER.VP16（GEV、Gal4p DNA結合ドメイン、ヒトエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインを含む合成転写因子のC末端融合を作成したGFPを2とし、VP16）。核局在を添加した後の8分以内に観察されたその野生型酵母は完全に不活性であり、誘導物質、β-エストラジオールの飽和量。この時までに、細胞の大部分は、2,5（蛍光in situハイブリダイゼーションを介してアッセイ）GeVの標的遺伝子のためのはっきりと目に見える活性転写·サイトだけでなく、完全に成熟したmRNAを持っています。 GEV標的遺伝子は、核に転位DNAに結合し、転写を活性化する&lt;キメラアクチベーターのための2.5分を要することを実証し、2.5分の2,6（マイクロアレイを用いて測定）内に発現&gt; 2倍に増加した。 スイッチON-いくつかの他の（ 大腸菌（Escherichia coli）7,8とシロイヌナズナからのインジゴ系スイッチ9からの古典的なドキシサイクリンベースのスイッチを含む）は、様々な小分子や薬物を利用した酵母で適用されてきたが、どれも、スピードを達成しなかった特異性、またはホルモンベースのスイッチが示す規制の圧迫感。それは、T言及する価値がある帽子ラピッド·スイッチもオフ酵母内で開発されており、典型的には、配列2,10,11,12を対象としたプロテアーゼまたはユビキチンリガーゼに遺伝子を融合させることにより動作します。 10を削除した際に速やかに細胞から標的タンパク質を除去する能力は必須の遺伝子だけでなく、遺伝的抑制を起こしやすい遺伝子の研究を促進する。 このプロトコルに記載された方法は、建物やスイッチON-酵母における合成を特徴付けるためのものである。まず、迅速に目的のDNA結合ドメインからなるゲノムに統合された融合タンパク質を生成する方法を示し、リガンドは、ヒトエストロゲン受容体の結合ドメイン及びVP16（DBD-EVの）。我々のプロトコルに従って、融合タンパク質は、ACT1プロモーターから発現される。それから、ATFのための同族レポータープラスミドを作成し、フローサイトメトリーを使用してその機能をテストする方法を示しています。我々は新しいATFS（ 図1）で使用されているこれらのレポータープラスミドを想像するが、それらはできるBEだけでなく、ネイティブの転写活性化因子のためのレポーターとして使用される。最後に、96ウェルプレートで細胞増殖に対するATF活性化の効果を試験するためのゲノムおよび誘導性対立遺伝子を操作するための詳細が提供される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">Expand High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:88px;">Roche</td>
			<td style="width:88px;">11 732 650 001</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">M0202S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Competent E. coli</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">18258-012</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Estradiol</td>
			<td style="width:88px;">Tocris Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">2824</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">M0201</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">PBS</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">10010-23</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">Tween-20</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">9005-64-5</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">clonNAT</td>
			<td style="width:88px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:88px;">AB-102L</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">XbaI</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">R0145S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">NotI-HF</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">R3189S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">B7204S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Glucose</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">D15-500</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Bacto-Peptone</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">211677</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">210929</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Agarose</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">214010</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:88px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:88px;">04-355-222</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">G418</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">11811-031</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:88px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:88px;">27104</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L-6883</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Salmon sperm DNA</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">93283</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">PEG 3350</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-3640</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15</td>
			<td style="width:88px;">Noyes or Botstein labs</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Luria Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Material Name</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">LSRII Flow Cyometer&#160;</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">Various Models</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:88px;">MATLAB or FlowJo</td>
			<td style="width:88px;">MATLAB or FlowJo</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">R</td>
			<td style="width:88px;">Open Source</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">For analyzing growth-rate data from plate reader.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Falcon Tubes</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">352052</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:88px;">1.7 ml Eppendorf&#160; Tubes</td>
			<td style="width:88px;">GeneMate</td>
			<td style="width:88px;">C3262-1</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">250 ml Shake Flasks</td>
			<td style="width:88px;">Corning</td>
			<td style="width:88px;">4446-250</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">96-well, flat-bottom plates</td>
			<td style="width:88px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3635</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)</td>
			<td style="width:88px;">BioTek</td>
			<td style="width:88px;">H1MG</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Breathe-Easy Membranes</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Z380059-1PAK</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:88px;">various companies</td>
			<td style="width:88px;">Various models</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">SC-Ura powder</td>
			<td style="width:88px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:88px;">114410622</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">5-FOA</td>
			<td style="width:88px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:88px;">F9001-1</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid synthesis and screening of chemically activated transcription factors with gfp-based reporters

合成生物学は、合理的に設計し、必要な定量性を有する合成回路を構築するだけでなく、ネイティブな制御回路の構造を問い合わせるためのツールを提供することを目的とする。両方の場合において、迅速かつ調整可能な様式で遺伝子発現をプログラムする能力は、無オフターゲット効果で、有用であり得る。我々は、ヒトエストロゲン受容体およびVP16のリガンド結合ドメインが続くURA3カセットの上流にACT1プロモーターを含む酵母株を構築した。 URA3の存在に対するDNA結合ドメインおよび選択することを含む直鎖状PCR産物でこの株を形質転換することによって、恒常的に発現人工転写因子（ATF）は、相同組換えにより生成することができる。このように設計さATFS、それによって標的外の活性化と一般的に使用されるconditiで見つかった非生理学的な成長条件の両方を排除し、誘導物質の存在下で、独特の標的遺伝子を活性化することができますonal遺伝子発現系。関心対象の天然または人工的な転写因子に特異的に応答するGFPレポータープラスミドを迅速に構築するための簡便な方法も提供される。

<html> 図5に、時間をかけて、Z 3、EV、Z 4、EV、またはGEVによるGFPの誘導を示す。 nonyeastのDNA結合ドメインを含むATFSに応じて、GFPの生産の増加に注意してください。我々は最近、これが酵母ゲノム1に単一遺伝子特異性を達成するため、これらの要因に起因すると推測した。 Z 3 EV及びZ 4 EVのみ適切な結合部位（5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;を含む合成プロモーターの下流に配置された標的遺伝子の発現を活性化し、5&#39;-に対し、単独GEV誘導は、数百の遺伝子の活性化/抑制につながりGCGGCGGAGGAG-3 &#39;のそれぞれ）1。 図7は 、システム（検出可能なGFP無しデューサーの結果）の厳密な調節を示し、すべてのセルを範囲全体にGFPを誘導するための、Z 3、EVの能力を誘導物質に応答して誘導取得することをβ-エストラジオール濃度は、 図8に示されている。 <html> ENT &quot;FO：キープtogether.withinページを=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> 図1。人工転写因子は β-エストラジオールは、ATFに結合すると、β-エストラジオールがない状態でのHsp90との対話 、Hsp90は、ATFが核に入り、プラスミドレポーターからの発現を活性化することができるように、解離する。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> 図2。人工転写因子および建物/同族のGFPレポーターをテストが含まれているエンジニアリング株のためのプロトコルの概略。 load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; 図3。LEU2遺伝子座のひずみyMN15中ACT1pr-URA3-EVシーケンス。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> 図4 yMN15正常に形質転換されたときに新しい融合タンパク質を生成するために、付加的な配列相同性により、目的のDNA結合ドメインを増幅するためのPCRプライマーの設計。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> 図5。1μMのβ-エストラジオールに応じて三つの異なるATF-プロモーターの組み合わせによるGFPの誘導 。&lt;/ pの&gt; <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> 図6の処理フローサイトメトリーデータのためのMATLABスクリプト 。このスクリプトは、から適応した<a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> 図7。0μMの誘導のβ-エストラジオールおよび1μMのβ-エストラジオール、次の18時間に応じて、Z 3、EVによるGFPの誘導。蛍光はまた、MEAたZ 3 EVシステムの厳密な調節を説明するために、GFPを欠く細胞からsured。この図は、 図6のコードを使用して生成された。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> 図8誘導物質濃度と発現量との関係は〜1のHill係数で傾斜している。（A）β-エストラジオール濃度の関数としてのGFP発現の分布。 （B）（A）の分布の平均蛍光。データは、Dは、β-エストラジオールの用量である= G 最小 +（G のmax-G minの ）D のn /（K nの + D n）は 、G min及びG maxは最小であり、関数G（D）に適合させたとGFP最大値、解像度pectively、nはHill係数であり、Kは½（G + G 最大最小 ） が得られるβ-エストラジオールの投与量である。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td>オリゴヌクレオチド配列</td><td>名前</td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBDはフォワードチェック</td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBDチェックリバース</td></tr></tbody></table> 表1：エストロゲン受容体への関心のDBDの正確な融合を確認するためのプライマー。フォワードプライマーは、相同ACT1プロモーターであり、リバースプライマーは、エストロゲン受容体に相同である。典型的なのDBD（〜300 bp）のために、PCR産物は&lt;1.5 kbのである。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td>オリゴヌクレオチド配列</td><td>名前</td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBDの一気飲みサイト... t-ブチル3 &#39; </td><td>トップオリゴ</td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... DNA結合部位の逆... GC-3 &#39; </td><td>下のオリゴ</td></tr><tr><td> 5&#39;-GCC gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG T-3 &#39; </td><td>トップオリゴ+ 6X Zif268の結合部位</td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td>下のオリゴ+ 6X Zif268の結合部位</td></tr></tbody></table> 興味のある結合部位を含む二本鎖DNAを作成するためのプライマーの表2。のS tructure。Z 3 EV-応答性プロモーターを作成するには、オリゴヌクレオチド上のオリゴ+ 6X Zif268の結合部位およびボトムオリゴ+ 6X Zif268の結合が使用された。正しいDNAオーバーハングを作成するための配列は小文字です。 Zif268のコンセンサス結合部位、GCGTGGGCGは、一番上のオリゴに下線が引かれている。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td>試薬</td><td>額</td></tr><tr><td> T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液</td><td> 5μL </td></tr><tr><td> T4ポリヌクレオチドキナーゼ（10,000単位/ ml @） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td>トップオリゴ（100μM） </td><td> 1.5μL </td></tr><tr><td>下のオリゴ（100μM） </td><td> 1.5μL </td></tr><tr><td>水</td><td> 41μL </td></tr></tbody></table> 表3。リン酸化し、上記の反応液50μlを使用したサーモサイクラー中でアニールするプライマー。2サーモサイクラーのステップがあります。ステップ1：37℃、30分（リン酸化）、ステップ2：95℃、30秒（4℃まで1℃ごとに30秒をステップダウン、アニール）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td>試薬</td><td>額</td></tr><tr><td>をXbaI </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> NotIで-HF </td><td> 1μL </td></tr><tr><td>プラスミドDNA </td><td> 5μL（1〜2μgの） </td></tr><tr><td> 10倍のカットスマートバッファ</td><td> 5μL </td></tr><tr><td>水</td><td> 38μL </td></tr></tbody></table> 表4。 XbaIおよびNotIでプラスミドpMN8の制限消化。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88">試薬</td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88">額</td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td>のT4リガーゼBufのFER </td><td> 2μL </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4リガーゼ</td><td> 0.2μL </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> 10 NG /μL@バックボーン</td><td> 1μL </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> 5倍モル濃度/μL@結合配列</td><td> 1μL </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td>水</td><td> 15.8μL </td></tr></tbody></table> 表5プラスミドDNAへの結合部位をライゲーションする 。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td>プライマー</td><td>説明</td></tr><tr><td> 〜40塩基対上流のATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> KanMX-プロモーターを増幅するためのフォワードプライマー</td></tr><tr><td> 5&#39;-逆相補（ATG +〜37bp）+ TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> PRIを逆転KanMX-プロモーターを増幅するためのマー</td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> GCN4プロモータースワップを作るためのフォワードプライマー。 </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> GCN4プロモータースワップを作るためのリバースプライマー。 </td></tr></tbody></table> 表6。PCRはtitratible対立遺伝子を作るためのKanMX-プロモーターを増幅する。

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